专利名称：一种分离的副溶血弧菌噬菌体及其在杀菌和防菌中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种能够特异性裂解副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)菌株的噬菌体分离物及其在杀菌和防菌中的应用，属于生物工程领域。
背景技术：
噬菌体(bacteriophage，phage)是一种细菌病毒，可以特异性感染并裂解一种或少数几种细菌。噬菌体有严格的宿主特异性，只寄居在易感宿主菌体内，对动植物细胞和其 他细菌没有感染性。噬菌体的安全性有保证。噬菌体分为两类，一类噬菌体感染细菌后将 其遗传物质整合到细菌的DNA里，随着细菌的繁殖而繁殖，一旦外界条件合适就裂解细菌 细胞，而引起细菌死亡，这种噬菌体叫做温和噬菌体。另一类噬菌体一旦感染细菌，就利用 细菌合成子代噬菌体，然后裂解细菌细胞而释放，这种噬菌体成为烈性噬菌体。在杀菌效果 上，烈性噬菌体有着广泛的应用，尤其是利用其治疗由“超级细菌”引起的感染取得了良好 的效果。本发明中的噬菌体分离物是从自然界中分离的烈性噬菌体，经毒理实验证明其安全、无任何毒副作用，并对副溶血弧菌有强烈的裂解作用。该噬菌体经高度纯化有望开发成 为生物杀菌剂防治副溶血弧菌的污染。
发明内容
本发明的目的是开发对副溶血弧菌具有强烈裂解作用的噬菌体分离物，该噬菌体 分离物可以单独或混合使用，可以特异性地部分或完全灭活副溶血弧菌，为工业化生产噬 菌体杀菌剂提供噬菌体株来源。本发明的另一个目的是开发一种新型的安全的水环境生物杀菌剂，用以特异性地 杀灭水体中的副溶血弧菌，改善水体微环境。本发明的又一个目的是提供一种用于水产品养殖、运输及保存的生物杀菌剂，用 以防治在水产品养殖、运输及保存过程中致病性副溶血弧菌的污染。本发明的再一个目的是为治疗由副溶血弧菌引起的感染提供潜在治疗药物。本发明从自然界中分离得到一种噬菌体分离物，该噬菌体分离物包括一种或多种 对副溶血弧菌具有裂解作用的噬菌体，经纯化可得噬菌体单体。证明该噬菌体分离物中的 噬菌体单独或混合使用对副溶血弧菌具有实质裂解作用。上述分离出的噬菌体单体(副溶 血弧菌噬菌体,拉丁名Vibrio Parahaemolyticus phage)命名为BPH-VP-1，对副溶血弧菌 具有广谱的杀菌能力。噬菌体BPH-VP-I保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地址武 汉市武昌珞珈山武汉大学校内中国典型培养物保藏中心)，保藏日期是2009年3月24日， 保藏编号为CCTCC M 209058。本发明中的噬菌体BPH-VP-I经小鼠毒理实验，给予li^pfu/kg的噬菌体样品对实 验小鼠未见异样，连续给予15天后，将小鼠断颈处死，尸检，未发现其内脏有异样变化。与 其他实验结果相同。该噬菌体是安全的。
本发明中的噬菌体BPH-VP-I可以单独或混合使用，在浓度为IO2-IO3CfuAil的副 溶血弧菌培养基中，106-107pfu/ml的噬菌体对该浓度的副溶血弧菌的灭菌率达到99%以 上。本发明中的噬菌体可应用于防治环境中，包括但不限于水体中的副溶血弧菌的污染。本发明中的噬菌体BPH-VP-I可以单独或混合使用，可以作为杀菌剂喷洒于水体 中，防治水生动物感染副溶血弧菌引起的疾病，并可在水产品养殖、运输及保存过程中防治 副溶血弧菌的污染。本发明中的噬菌体BPH-VP-I可以单独或混合使用，对被副溶血弧菌污染的固体 食品表面喷洒106pfu/ml-107pfu/ml数量级的噬菌体，lifpfu/ml-ionpfu/ml的效果尤佳， 可以在12小时内完全灭活副溶血弧菌。本发明中的噬菌体可应用于防治固体食品，包括但 不限于水产品的副溶血弧菌污染。本发明中的噬菌体BPH-VP-I可以单独或混合使用，可作为杀菌剂喷洒于食品生 产车间，可特异性、持续防止该环境中副溶血弧菌的生存和繁殖，防治食品加工过程中副溶 血弧菌的污染。本发明中的噬菌体BPH-VP-I可以单独或混合使用，可作为一种潜在药物治疗由 副溶血弧菌引起的细菌感染。本发明中的噬菌体可以和其他噬菌体联合使用，以或得较宽的噬菌范围。本发明中的噬菌体可以和其他抗菌剂混合使用，在获得抗菌广谱性的同时，对副 溶血弧菌特异性杀灭。能与本发明中的噬菌体联合使用的抗菌剂包括但不限于抗生素和化 学抗菌剂。本发明中的噬菌体可应用于工业生产，可由宿主菌副溶血弧菌特异性扩增，可应 用标准病毒纯化方法高度纯化，可以开发为一种生物杀菌剂用于防治副溶血弧菌污染。
本发明采用的噬菌体BPH-VP-I为副溶血弧菌噬菌体，拉丁名为Vibrio parahemolyticusphage BVP-40-1，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地址武汉 市武昌珞珈山武汉大学校内中国典型培养物保藏中心)，保藏日期是2009年3月24日，保 藏编号为 CCTCC M209058。图1为常温下噬菌体稳定性的测试结果图；图2为4°C时噬菌体稳定性的测试结果图；图3为本发明所述的噬菌体在海水中的杀菌效果图，副溶血弧菌接种量为 1000cfu/ml ；图4为本发明所述的噬菌体在海水中的杀菌效果图，副溶血弧菌接种量为 100cfu/ml ；图5为本发明所述的噬菌体对贝类样品的杀菌效果图，副溶血弧菌接种量为lOOcfu/ml。
具体实施例方式实施例1 噬菌体的筛选和纯化(一)样品的采集及处理
本发明中的样品采自珠海本地，包括中山大学第五附属医院未处理的污水、珠海 市市内下水道污水、排污入海口处的海水、珠海市海水鱼养殖场。采集的样品用NaOH调节，使pH约为7. 8，经过4000r/min离心15min，用0. 45 μ m 滤膜过滤得上清液。取过滤除菌后的样品75ml，加入25ml 4倍高盐TSB培养基(1 %氯化 钠TSB培养基)。
( 二)样品中针对副溶血弧菌的噬菌体特异性扩增在处理好的样品中加入预先扩增好的副溶血弧菌(0D_约为0.8，加入比例为 1 100)，将其置于恒温摇床300C，250r/min培养12_24h。(三)斑点实验测定特异性噬菌体的有无副溶血弧菌双层检测平板的制备1.高温灭菌1. 50% agar高盐TSB固体培养基， 室温放置至约40-60°C，取10-15ml倾倒至培养皿内，均勻铺于皿底，室温放置30min，使其 凝固；2.将经过高温灭菌的0. 5%高盐TSB半固体培养基融化，40°C _48°C水浴保温；3.取 副溶血弧菌(106-108pfu/ml)0. 2ml-0. 8ml，加入步骤2的0. 5%高盐TSB培养基3. 6_5ml， 混勻，倒入步骤1制得的培养皿内，室温放置凝固；4.将副溶血弧菌双层检测平板置37°C保 温培养Ih。取上述经副溶血弧菌扩增后的样品lml，8000rpm，离心15min，上清液经0. 22 μ m 过滤膜过滤除菌。取5μ 1点于副溶血弧菌双层检测平板上，37°C过夜培养，观察有无噬斑， 如果有进行步骤(四)。(以上操作均在无菌条件下进行)(四)噬菌体样品的分离及噬菌体样品的扩增将步骤(三)中在副溶血弧菌双层检测平板中呈现噬斑的样品，经过稀释，按如下 步骤纯化将制备好的高盐TSB平板，置37°C平衡0. 5h，使其表面温度达到室温(若在室 温条件下放置可省略此步)；取0. 4ml对数生长期(0D 0. 4-0. 8之间)、0. Iml扩增后的样 品和4ml 0. 5%高盐TSB培养基混勻，倒于平板上，轻轻振荡，使其铺平，室温放置约0. 5h， 使表面彻底凝固；将双层平板置37°C培养4-18h观察；挑选单个噬菌斑。将挑选出来的噬 菌体单克隆，加入2ml对数生长期的相应菌种中，37°C培育2h-6h，观察。重复克隆步骤3_5 次，得到噬菌体单克隆样品，并将其命名为BPH-VP-I。(五)噬菌体的纯化应用宿主菌副溶血弧菌将噬菌体BPH-VP-I高度扩增，待培养基澄清后，SOOOg 离心lOmin，取出杂质，加入固体聚乙二醇(PEG8000)至终浓度为10% w/v，搅拌溶解， 4°C 过夜，4°C 8000g 离心 20min，弃沉淀，重悬于缓冲液(IOOmM NaCl, 5mM MgSO4, IOmM pH7. 2Tris-HCl)中，于37 °C保温30min，期间振荡数次。加入氯仿，漩涡混合30min， 3000rpm,离心5min，小心收集水相，4°C过夜透析(截留分子量3kd)，除去盐份，重复透析一 次。将得到的噬菌体透析液置4°C保存待用。实施例2 毒理实验昆明小鼠，清洁级，体重22 士 3g，2月龄(合格证号SCXK (京)2004-0001)，由协和 医科大学试验动物研究中心提供。试验动物饲养于清洁级饲养室，室温18-22°C，相对湿度 40%-70%,12h日照和昏暗循环。实验小鼠20只，雌雄各半，适应性饲养3天后，随机分为 两组(噬菌体组、对照组)，每组10只(雌雄各5只)，给予噬菌体组计量为liTpfu/kg的 噬菌体BPH-VP-I，对照组给予等量生理盐水，连续给药15d，将实验鼠断颈处死，检查内脏情况。试验结果显示，此计量的噬菌体BPH-VP-I对小鼠日常行为没有影响。解剖检查内 脏未见异常。实施例3 噬菌体BPH-VP-I稳定性测定1.噬菌体计数方法(效价)将所得噬菌体样品按10倍比例稀释，取其中一定稀释比例的样品100μ 1，按照实施例1所述的步骤(四)中的方法铺双层平皿，取合适比例的平皿计算噬斑个数，一个噬斑 代表一个噬菌体单体。2.将噬菌体样品分别调节至ρΗ 6. 0,6. 5、7. 0、7. 5、8. 0，分别于4°C和室温(珠海 本地，室温在25-33°C )放置，样品处理完成后，首先测定噬菌体的初始效价，然后在设定时 间测定噬菌体的效价。测试结果见图1和图2。结果显示在室温保持4天的时候，噬菌体的效价有小幅的上升。在各ρΗ条件下， 14天内的活性都保持60%以上，尤以pH8.0为佳。在4°C时，噬菌体活性的保持效果优于室 温。噬菌体的稳定性良好，为噬菌体的保藏和应用提供了便利的条件。实施例4 检测噬菌体样品在海水中的杀菌效果1.噬菌体计数方法同实施例3所述的方法。2.副溶血弧菌计数方法(效价)采用TCBS弧菌选择性培养基，应用涂布的方法计数，37°C培养24h，蓝绿色菌落为 阳性菌落。3.海水处理方法海水采集于珠海唐家湾海域，将采集的海水样品3000r/min离心lOmin，取出不溶 物，用0. 22 μ 1的一次性滤器过滤，经检验无细菌生长即得实验用样品。4.海水中杀菌效果实验将噬菌体样品按10倍比例稀释，其中一部分按实施例2中方法测定效价，另一部 分按如下方法检测杀菌效果取2ml 1. 4X108pfu/ml对数生长期的副溶血弧菌，4000r/min离心lOmin，弃上 清，沉淀用等量处理后的海水重新悬起，备用；分别取用处理后的海水样品98ml，分别加入 Iml经适当稀释的副溶血弧菌样品及Iml经适当稀释的噬菌体样品，使副溶血弧菌的终浓 度分别为lOOcfu/ml和lOOOcfu/ml，噬菌体样品的接种浓度分别为106pfu/ml和107pfu/ ml ；分别于lh、2h、3h、4h、5h检测副溶血弧菌的残留量。试验结果显示当海水中的噬菌体浓度达到107-108pfu/ml时，对副溶血弧菌的灭 活率达到100%。当噬菌体浓度在106pfu/ml时，对海水中副溶血弧菌的灭活率达到99% 以上。测试结果见图3和图4。实施例5 运输过程中噬菌体对贝类样品的体内副溶血弧菌残留量的影响1.噬菌体计数方法同实施例3所述的方法。2.副溶血弧菌计数方法同实施例4所述的方法。3.贝类样品的杀菌效果评价将从市场上买回来的新鲜贝类样品，用水冲洗干净表面后，随机进行分组，依次分 为对照组、对照平行组、噬菌体组、噬菌体平行组，每组加入IL海水，分别接种lOOcfu/ml副溶血弧菌。对照组及对照平行组不做其他处理，噬菌体组及噬菌体平行组加入107pfu/ml噬 菌体样品。随后分别于0.5h、2h、4h测定贝类样品中的副溶血弧菌的浓度(测定方法参照 GB-T4789. 7-2003)。 试验结果显示应用噬菌体处理后，在短时间内贝类样品中的副溶血弧菌的数目显著减少，表明在实际贝类样品中，噬菌体能够杀死副溶血弧菌，能够比较完全的杀灭有可 能侵入的副溶血弧菌。
权利要求
一种噬菌体BPH-VP-1，保藏编号为CCTCC M 209058。
2.权利要求1所述的噬菌体在防治副溶血弧菌污染方面的应用。
3.权利要求1所述的噬菌体作为杀菌剂用于防治水产品养殖、运输及保存过程中副溶 血弧菌污染方面的应用。
4.权利要求1所述的噬菌体作为食物添加剂用于防治副溶血弧菌污染方面的应用。
5.权利要求1所述的噬菌体作为杀菌剂喷洒于食品生产车间，用于防止该环境中副溶 血弧菌的生存和繁殖，防治食品加工过程中副溶血弧菌污染方面的应用。
6.权利要求1所述的噬菌体作为一种治疗副溶血弧菌感染的药物的应用。
全文摘要
本发明公开了一种分离的副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)噬菌体及其在杀菌和防菌中的应用。分离出的噬菌体单体命名为BPH-VP-1，对副溶血弧菌具有广谱的杀菌能力。噬菌体BPH-VP-1保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地址武汉市武昌珞珈山武汉大学校内中国典型培养物保藏中心)，保藏日期是2009年3月24日，保藏编号为CCTCC M209058。
文档编号A23L3/3571GK101798568SQ20091003839
公开日2010年8月11日 申请日期2009年4月3日 优先权日2009年4月3日
发明者刘磊, 张智英, 李练周, 赵海丽, 陆佳, 陈锦永 申请人:珠海市晋平科技有限公司