一种来源于副溶血弧菌噬菌体的内溶素及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种来源于副溶血弧菌噬菌体的内溶素及其 应用。
【背景技术】
[0002] 副溶血性弧菌是革兰氏阴性多形态杆菌或稍弯曲弧菌，为二级有害微生物，隶属 弧菌科中的弧菌属，它是一种人畜共患病菌，广泛存在于近海岸的海水、海底沉积物以及鱼 类、贝类等海产品之中。随着抗生素的大量和长期使用，在食品和环境中，日趋严重的耐药 型副溶血弧菌已影响人类感染副溶血弧菌疾病的治疗，能否研宄出新型的生物抑菌剂来替 代化学抗生素是目前科研人员面临的一个挑战。
[0003] 噬菌体内溶素是一类能够裂解细菌细胞壁的裂解酶。尽管在1957年噬菌体内溶 素裂解细菌的能力就被首次报道，但直到2001年Nelson等才证实纯化的重组内溶素可以 作为抗菌剂有效控制大鼠感染A族链球菌。到目前为止，内溶素已被用来防控和检测食品 中的食源性致病菌如金黄色葡萄球菌、李斯特菌和梭状芽孢杆菌。与使用小分子抗生素用 于抗菌治疗或预防相比，专一性的内溶素不易导致抗性菌株的快速出现。在细菌耐药性日 益严重的现在，尤其在市场对新型抗菌剂的需求空前提高，内溶素不易产生抗性且裂解专 一性的特点，使其作为新型抗菌剂具有一定的优势。
[0004] 虽然国内利用基因工程技术构建内溶素生产菌株的工作已经有了一定的进展，但 是在研宄和生产过程中存在的重要的问题是，制备的内溶素大多数都集中在革兰氏阳性细 菌的防治和检测，对于革兰氏阴性细菌尤其是副溶血弧菌的防控研宄仍较少。所以，针对副 溶血弧菌的耐药性日趋严重及相关内溶素缺乏的问题，本发明开发出能够高效裂解副溶血 弧菌的内溶素或内溶素基因。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种来自副溶血弧菌噬菌体的具有显著抑菌效果的内溶素。
[0006] 本发明还提供所述的内溶素在制备抑菌剂中的应用。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0008] 一种来源于副溶血弧菌噬菌体的内溶素，其氨基酸序列为SEQIDNo:1所示的全 部或部分氨基酸序列。经过序列结构分析，显示该酶为噬菌体中的能够裂解细菌细胞壁的 裂解酶，经试验证实，该氨基酸序列形成的蛋白具有较好的杀菌活性。
[0009] 编码所述的内溶素的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNo:2所示。
[0010] 含有所述的基因的表达载体、工程菌或细胞系。
[0011] 所述原核细胞表达载体为pET-28a(+)。
[0012] 所述工程菌为大肠杆菌Rosseta(DE3)。
[0013] 一种所述的内溶素在制备抑菌剂中的应用。目前尚未有文献公开过能够裂解副溶 血弧菌细胞壁的裂解酶，而本发明的内溶素具有该功能，对副溶血弧菌具有有效的杀菌活 性。
[0014] 本发明的有益效果是：本发明的内溶素通过市场上已有的适合表达载体表达、纯 化后，体外对副溶血弧菌表现出显著的杀菌效果，可用于副溶血弧菌抑菌剂的制备。
【附图说明】
[0015] 图1为内溶素蛋白进行结构域分析预测图；
[0016] 图2为内溶素蛋白在大肠杆菌中高效表达图谱；
[0017] 图3为内溶素蛋白裂解副溶血弧菌ATCC17802的吸光值变化图谱；
[0018] 图4为内溶素蛋白裂解副溶血弧菌ATCC17802的浊度变化图谱。
【具体实施方式】
[0019] 下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发 明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落 入本发明保护范围。
[0020] 在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等 均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常 规方法。
[0021]本发明试验涉及的菌株：副溶血弧菌VP17802(保藏号为ATCC17802)，购买于美 国ATCC中心，副溶血弧菌VIB304、副溶血弧菌VIB461、副溶血弧菌VIB800和副溶血弧菌 VP14-90、VP1. 2、VP2. 1、VP3. 2、VP4. 1均保存在中国海洋大学食品安全实验室。
[0022] 本发明涉及的副溶血弧菌噬菌体，该噬菌体VPpl保存于中国典型培养物保藏中 心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:M2013030,保藏日期为2013年1月20 日，分类学命名：副溶血弧菌菌体VPpl(VibrioparahaemolyticusphageVPpl)〇
[0023] 2216E培养基，青岛海博生物技术有限责任公司；
[0024]LB液体培养基，北京陆桥技术有限责任公司；
[0025]质粒pET28a和大肠杆菌Rosetta(DE3)，北京康为世纪公司；
[0026]NiSepharose?6Fast Flow填料，美国GE公司；
[0027]异丙基_ 0-D-硫代半乳糖苷（IPTG)，北京索莱宝科技有限公司。
[0028] 实施例1:内溶素蛋白功能预测
[0029] 本发明人从污水中分离出一株副溶血弧菌的烈性噬菌体VPpl。经全基因组测序 和分析，鉴定该噬菌体gp32编码的蛋白在氨基酸序列上与果胶杆菌噬菌体溶菌酶有32% 的相似度。使用InterProScan软件对gp32编码的蛋白LysVPpl进行结构域预测分析。结 构域预测结果如图1所示，LysVPpl的120-209氨基酸区间为高度保守的功能区域，属于 Lysozymedomain家族（IPR023346)。该家族能够裂解原核细胞细胞壁肽聚糖中糖苷键。
[0030] 实施例2 :内溶素在大肠杆菌中的高效表达
[0031] 1、重组质粒的构建
[0032]根据内溶素基因序列（SEQIDNo:2)，设计引物，上游引物：CGGGATCCATGGATGATG GCTTACTAACTGATA(SEQIDNo:3)，下游引物：CCGCTCGAGTCATAAAGGTAATCTCCCTGCCTCA(SEQ 10此：4)，在上下游引物端分别设定限制性内切酶8&111111和乂11 〇1。利用？0?进行内溶 素基因扩增，将25yLPCR回收产物克隆入pET-28a载体的多克隆位点BamHI和XhoI之间，得到重组质粒，转化至大肠杆菌R〇setta(DE3)中。挑取单克隆至LB液体培养基中过 夜振荡培养，提取质粒作为模板进行PCR鉴定，结果表明质粒中具有SEQIDNo:2所示的核 苷酸序列，将该基因表达的蛋白命名为LysVPpl，该基因编码SEQIDN〇:l所示的氨基酸残 基序列。将鉴定正确的重组质粒命名为pET-28a-LysVPpl。
[0033] 2、重组蛋白的制备
[0034] 重组质粒命名为pET-28a_LysVPpl转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，筛选得到可表达 内溶素的工程菌Rosetta(LysVPpl)，接种单菌落于10mLLB液体培养基（含50yg/mL卡 那霉素）中，37°C，150r/min，过夜振荡培养，次日，按照1:100的比例将菌液加入到新鲜的 900mLLB液体培养基（含50yg/mL卡那霉素）中，37°C培养3h，加入IPTG(至终浓度为 lmmol/L)，在37°C条件下进行诱导表达，150r/min振荡培养4h后，3381g、4°C条件下离心 15min获得细胞。每300mL菌液所得的细胞沉淀悬于30mL缓冲液（20mmol/LpH8. 0NaH2P03， 含500mmol/LNaCl)，充分混匀后，用超声波破碎仪进行破碎，离心去除不溶性细胞碎片，上 清液过0. 22ym无菌滤膜，获得粗酶液。采用NiSepharose? 6FastFlow进行纯化，利 用10kD超滤离心管进行脱盐处理获得纯度较高的重组蛋白。结果如图2所示，重组蛋白 LysVPpl得到高效表达。图2中泳道M为蛋白标准分子量，泳道1、2分别为未经IPTG诱导 和经诱导的Rosetta(LysVPpl)的细菌总蛋白，泳道3、4分别为超声破碎后上清和沉淀，泳 道5为超滤浓缩脱盐后的融合蛋白。
[0035] 实施例3 :以副溶血弧菌ATCC17802为靶细菌测试内溶素LysVPpl抑菌效果
[0036] 挑取副溶血弧菌ATCC17802单菌落至300mL2216E培养基中，过夜培养，菌体离心， 用100mMEDTA复融，5min，细胞离心用纯水清洗两次，然后-80°C保存，测定活性之前，将 细菌沉淀用20臟〇1/1口118.0似1^03，含0.1%1'1^〇11乂-100复融。将1001^重组蛋白 LysVPpl溶液（100yg/mL)加入到900yL细菌复融液中，37°C培养至裂解效果明显。将缓 冲液和溶菌酶（100yg/mL)作为空白组和阳性对照组分别同细菌复融液混合，相同条件下 培养，用酶标仪测定0D450值，吸光值的下降反映细菌被裂解。
[0037] 结果如图3所示，重组蛋白LysVPpl试验组和阳性对照组的吸光值在5min内迅速 降低，并且，LysVPpl溶液将细菌的浊度在10min内降低约0. 39,溶菌酶溶液降低0. 25左 右。通过图4所示，37°C培养15min后，LysVPpl试验组和阳性对照组的菌液明显比空白组 澄清。证明通过克隆表达获得的内溶素LysVPpl具有体外抗菌活性。
[0038] 实施例4 :以不同血清型副溶血弧菌和大肠杆菌为靶细菌测定内溶素LysVPpl抑 囷效果
[0039] 挑取副溶血弧菌ATCC17802单菌落至300mL2216E培养基中，过夜培养，菌体离心， 用100mMEDTA复融，5min，细胞离心用纯水清洗两次，然后-80°C保存，测定活性之前，将 细菌沉淀用20臟〇1/1口118.0似1^03，含0.1%1'1^〇11乂-100复融。将1001^重组蛋白 LysVPpl溶液（100yg/mL)加入到900yL细菌复融液中，37°C培养30min，测定0D450值。 LysVPPl酶活力值=A450nm(LysVPpl实验组降低值）-A450nm(缓冲液空白组降低值）。
[0040] 以副溶血弧菌ATCC17802为抑菌阳性标准，检测LysVPpl对多株菌株的抑菌活性， 表1所示，LysVPpl能够裂解其余5种不同血清型的副溶血弧菌。
[0041] 表1内溶素LysVPpl抑菌效果分析
[0042]
【主权项】
1. 一种来源于副溶血弧菌噬菌体的内溶素，其氨基酸序列为SEQ ID No :1所示的全部 或部分氨基酸序列。
2. 编码权利要求1所述的内溶素的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No :2所 不〇
3. 含有权利要求2所述的基因的表达载体、工程菌或细胞系。
4. 根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述原核细胞表达载体为pET-28a (+)。
5. 根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌为大肠杆菌Rosseta (DE3) 〇
6. -种权利要求1所述的内溶素在制备抑菌剂中的应用。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体涉及一种来源于副溶血弧菌噬菌体的内溶素及其应用。一种来源于副溶血弧菌噬菌体的内溶素，其氨基酸序列为SEQ ID No：1所示的全部或部分氨基酸序列。经过序列结构分析，显示该酶为噬菌体中的能够裂解细菌细胞壁的裂解酶，经试验证实，该氨基酸序列形成的蛋白具有较好的杀菌活性。本发明的内溶素通过市场上已有的适合表达载体表达、纯化后，体外对副溶血弧菌表现出显著的杀菌效果，可用于副溶血弧菌抑菌剂的制备。CCTCC NO： M 201303020130120
【IPC分类】A61P31-04, C12N15-60, C12N15-70, C12N9-88, C12N1-21, A61K38-51
【公开号】CN104593346
【申请号】CN201410795849
【发明人】王静雪, 林洪, 金延秋
【申请人】中国海洋大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2014年12月18日