一种从蚯蚓中提取的sod的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗氧化酶领域，具体涉及一种从蚯蚓中提取的S0D。
【背景技术】
[0002]SOD(Superoxidedismutase)，中文名称超氧化物歧化酶，是一类广泛存在于生物 体内的金属酶，广泛分布于动物、植物、微生物等各种生物体内，它能催化超氧阴离子自由 基发生歧化反应，从而能有效清除机体内超氧阴离子自由基，是生物体重要的细胞防御系 统之一。S0D在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标，现已证实，由氧自由基 引发的疾病多达60多种。S0D可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受 损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害，具有抗辐射、抗肿瘤及延缓机体衰老等功能，在 保健品、医药和化妆品行业中有重要的应用价值。
[0003]S0D按其所含金属辅基不同可分为三种，第一种含铜（Cu)锌（Zn)金属辅基（Cu， Zn-S0D)，是最为常见的一种S0D，呈绿色，主要存在于机体细胞浆中；第二种含锰（Mn)金属 辅基（Mn-S0D)，呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞内；第三种含铁（Fe)金属辅 基（Fe-SOD)，呈黄褐色，存在于原核细胞中。
[0004]目前，国内外S0D多数来源于动物血液、肝脏，在我国有着丰富的资源，但随着动 物疫病和血液安全性的问题日益突出，寻找一种合适的生物体并从中提取S0D的方法逐渐 受到本领域的广泛关注。蚯蚓在我国传统医药中有着悠久的应用历史，其中S0D酶活性高， 并且养殖成本低廉，安全性好。
[0005] 现有技术提供的从蚯蚓中提取S0D的工艺中，透析去盐、丙酮沉淀仍是其中的关 键环节。如本领域技术人员所熟知的，透析工艺产能有限，过程耗时长，效率低；而作为有机 溶剂的丙酮，有着一定的毒性，不符合目前环保趋势，并且丙酮在一定程度上还会引起蛋白 质活性丢失。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在克服现有技术存在的缺陷，提供一种从蚯蚓中提取的高纯度、高活性 的S0D;所述S0D以蚯蚓为原料，采用高效、安全、环保方法制备而成。
[0007] 本发明提供的S0D(超氧化物歧化酶）以蚯蚓作为提取原料，蚯蚓具有易于养殖、 来源广泛、生物安全性高的特点；并且蚯蚓中S0D含量较高，是规模化生产S0D的优选原料。
[0008] 本发明提供了一种从蚯蚓中提取的S0D，所述S0D由包括以下步骤的方法制备而 成：
[0009] 1)将蚯蚓浸泡于浓度0. 1?5%的甲基纤维素溶液中，排净沙土后，将蚯蚓清洗干 净；
[0010] 2)将步骤1)所得蚯蚓浸泡于pH6. 7?6. 9的0. 045?0. 055mol/L磷酸盐缓冲液 中，分散成匀浆液，离心后取上清，即得粗酶液；
[0011] 3)将硫酸铵加入步骤2)所得粗酶液中，静置，离心后收集沉淀；
[0012] 4)将步骤3)所得沉淀溶解于pH6. 7?6. 9的0. 01?0. 02mol/L磷酸盐缓冲液 中，将所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝胶柱SephadexG-25顶端，用本步骤所述磷酸盐缓冲 液进行洗脱，收集含有蛋白质且不含硫酸铵的洗脱液，浓缩，得浓缩液；
[0013] 5)在步骤4)所得浓缩液中加入NaCl，得到NaCl浓度为0. 4?0. 6mol/L的溶液， 将所得溶液加入平衡好的金属螯合亲和柱顶端，用pH值4. 1?4. 9的0. 015?0. 025mol/ L柠檬酸缓冲液进行洗脱，收集含有蛋白质的洗脱液，浓缩，冷冻干燥，即得SOD。
[0014] 本发明所述步骤1)中使用甲基纤维素溶液浸泡蚯蚓，甲基纤维素可以促进蚯蚓 的肠道蠕动，可以高效、快速的清除蚯蚓体内的沙土和废物，大幅度缩短蚯蚓清洗、浸泡的 时间。具体的，所述甲基纤维素溶液的浓度优选为0. 5?2% ;蚯蚓与甲基纤维素溶液的质 量体积比为1 :1?10,优选为1 :2?5,此处虹蚓的质量单位为g，甲基纤维素溶液的体积 单位为ml;蚯蚓在甲基纤维素中浸泡的时间应足以将其体内沙土排除干净，浸泡的时间优 选为10?90min，进一步优选为30?60min;沙土排除干净后，用清水将纟丘蝴通体清洗至少 三次，彻底将沙土、废物和甲基纤维素溶液的残留清洗干净。
[0015] 本发明所述步骤2)中：所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液，该 缓冲液的浓度优选为〇. 〇5mol/L，pH值优选为6. 8 ;蚯蚓与磷酸盐缓冲液的质量体积比为1 : 1?20,优选为1 :3?5,此处蚯蚓的质量单位为g，磷酸盐缓冲液的体积单位为ml;将蚯蚓 分散成匀浆液的设备选用常规的高速剪切机，高速剪切机的操作温度为-5?20°C，优选为 0?4°C，转速为300?12000rpm，优选为6000?8000rpm，剪切时间为0? 5?20min，优选 为3?lOmin;所述离心的温度为-5?20°C，优选为0?4°C，离心速度为300?12000rpm， 优选为1000?5000rpm，离心时间为0? 5?20min，优选为5?15min。
[0016] 本发明所述步骤3)为硫酸铵分级沉淀法，具体为：将硫酸铵以质量体积比0. 3? 〇. 5:1溶解于步骤2)所得粗酶液中，此处硫酸铵的质量单位为g，粗酶液的体积单位为ml， 静置20?40min，在0?4°C、7500?8500rpm条件下离心10?20min，分离上清液，收集沉 淀；在所得上清液中以质量体积比0. 7?0. 9:1加入硫酸铵，此处硫酸铵的质量单位为g， 上清液的体积单位为ml,静置20?40min，在0?4°C、8500?9500rpm条件下离心25? 35min，收集沉淀；将两次收集所得的沉淀合并。
[0017] 本发明所述步骤4)采用凝胶层析法除去硫酸铵，能快速获得不含硫酸铵的蛋白 溶液，避免了常规透析除盐方法的繁冗过程和可能造成的目标产物损失。具体的，所述磷酸 盐缓冲液为磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液；缓冲液的浓度优选为〇. 〇15mol/L，pH值优选 为6. 8 ;步骤3)所得沉淀以质量体积比1:1?5溶解于磷酸盐缓冲液中，此处沉淀的质量 单位为g，磷酸盐缓冲液体积的单位为ml;葡聚糖凝胶柱选用SephadexG-25,凝胶柱的平 衡和流动相的洗脱均为常规操作；所述浓缩优选为聚乙二醇浓缩法，所述聚乙二醇优选为 PEG4000,浓缩步骤为常规操作。
[0018] 本发明所述步骤4)中，洗脱液中硫酸铵的鉴别方法具体为：取1滴洗脱液，滴在白 色比色盘孔中，加入1滴奈氏试剂混合，若出现棕黄色沉淀则表明洗脱液中含有硫酸铵。按 照上述标准，步骤4)收集的目标洗脱液进行该检测后，不应出现棕黄色沉淀。
[0019] 本发明所述步骤4)中，洗脱液中蛋白质的鉴别方法具体为：取1滴洗脱液，滴在黑 色比色磁盘中，加入1滴20%磺基水杨酸混合，若出现白色絮状沉淀则表明洗脱液中含有 蛋白质。按照上述标准，步骤4)收集的目标洗脱液进行该检测后，应出现白色絮状沉淀。
[0020] 本发明所述步骤5)中，金属螯合亲和柱所螯合的金属离子选自铜、锌、铁、镍离子 等常规的螯合用金属离子；柠檬酸缓冲液的浓度优选为〇. 〇2mol/L，pH值优选为4. 5 ;洗脱 液中蛋白质的鉴别方法与步骤4)相同；所述浓缩优选为聚乙二醇浓缩法，所述聚乙二醇优 选为PEG4000,浓缩步骤为常规操作。该步骤通过金属亲和层析法进行蛋白纯化，能够快速 获得纯化后的S0D，能够避免S0D的活性损失，且安全性更高，更环保。
[0021] 作为本发明的最优选方案，所述S0D由包括以下步骤的方法制备而成：
[0022] 1)将蚯蚓以重量体积比1 :2浸泡于浓度0. 5%的甲基纤维素溶液中60min，排净 沙土后，将蚯蚓清洗干净；
[0023] 2)将步骤1)所得蚯蚓以质量体积比为1 :3浸泡于冰浴后的pH6. 8、0. 05mol/L 磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液中，用高速剪切机将蚯蚓分散成匀浆液，操作条件为〇°c、 3000rpm、lOmin;在0°C、3000rpm条件下离心15min，取上清，即得粗酶液；
[0024] 3)将硫酸铵以质量体积比0.4:1溶解于步骤2)所得粗酶液中，静置30min，在 0°C、8000rpm条件