猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒RvHBJX及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及病毒基因工程技术领域，具体地，涉及一种猪繁殖与呼吸综合征嵌合 病毒RvHBJX及其应用。
【背景技术】
[0002] 猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS) 是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)引起的一种高度传染性疾病，主要以怀孕母猪发生 流产、早产、产死胎和木乃伊胎等繁殖障碍疾病以及仔猪和生长育肥猪出现呼吸道症状为 特征（Rossowetal.，1994)。2006年初夏以来，严重型PRRS暴发，并迅速席卷我国主要养 猪地区，造成大批生猪死亡，给我国养猪业造成巨大经济损失。疫苗被认为是防控与净化 PRRSV的重要工具。但是，PRRSV感染能引起免疫抑制与持续性感染，减毒活疫苗的长期使 用存在毒力返强等潜在风险（Madsenetal.，1998)。感染性克隆技术为新型疫苗的研宄提 供了技术保障。自从第一株PRRSV的感染性克隆成功构建以来（Meulenbergetal.，1998)， 反向遗传操作技术已用于分析和研宄PRRSV的基因结构与功能、病毒RNA合成的调控机制、 致病机制，以及新型疫苗的研宄。
[0003] 一般说来，用同源性高的毒株进行免疫能获得较好的抵抗力。因此将流行毒株的 某些基因置换到传统疫苗中，也许能提高疫苗的免疫效力。Ellingson等人利用MLV疫苗 毒、MN184毒株为亲本病毒构建了 5个嵌合病毒，其中两个是MLV疫苗毒、MN184毒株5'UTR/ 0RF1相互置换的病毒，一个是以MLV为骨架置换了MN1840RF5-6的嵌合病毒，一个是以MLV 为骨架置换了MN1840RF7-3 'UTR的嵌合病毒，一个是以MLV为骨架置换了MN184毒株3 'UTR 的嵌合病毒。这些嵌合病毒免疫后的攻毒实验显示MLV疫苗毒、MN184毒株5'UTR/0RF1相 互置换的病毒及以MLV为骨架置换了MN1840RF5-6的嵌合病毒能够诱导产生与传统细胞 培养疫苗相似的抵抗力。Lee等人用韩国PRRSV流行毒株的结构蛋白编码区置换了感染性 cDNA克隆质粒中的相应区域并拯救出相应的PRRSV嵌合病毒，该病毒能够被自然感染猪的 血清所中和，相应的体内试验尚未开展。以上结果说明通过嵌合病毒来研制新型疫苗是可 行的。
[0004]我国先前的分离毒株PRRSVHB-1 (sh) /2002(GenBank收录号AY150312)(Gao etal.，2004)，在全基因组序列上与高致病性毒株的同源性最高（97. 2%)，但致病性 低。该毒株经MARC-145细胞连续传代，获得能在MARC-145细胞中良好增殖的克隆毒株 HB-1/3. 9 (GenBank收录号EU360130)(冉智光等，2006)，与高致病性毒株的全基因组序列 同源性为97. 4%。这两个毒株基因组高度同源而生物学特性，如毒力、致病性、生长特性、免 疫原性等差异较大。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒；本发明的另一目的在 于提供该嵌合病毒作为嵌合疫苗候选株的用途。
[0006] 本发明首先提供了一种猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒，命名为RvHBJX，是以低致 病性PRRSV毒株HB-1/3. 9为骨架，含有高致病性PRRSV毒株JXwn06结构蛋白编码区的嵌 合病毒。
[0007] 其中，高致病性PRRSV毒株JXwn06结构蛋白编码区的基因序列如SEQIDNO. 1所 不〇
[0008] 本发明提供了猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒RvHBJX全长cDNA克隆质粒，是通过 以下方法构建得到：
[0009] (1)以pWSK-JXwn为模板，PCR扩增得到JXwn06的整个结构蛋白编码区，扩增产物 命名为HJSP-S2 ;
[0010] (2)以pWSK-HB-1/3. 9为模板，分别PCR扩增HB-1/3. 9结构蛋白编码区两侧序列， 分别命名为HJSP-S1、HJSP-S3 ;
[0011] (3)将步骤（1)和（2)的扩增产物纯化回收后，以HJSP-S1，HJSP-S2，HJSP-S33个 片段作为模板，PCR扩增得到HJSP-S123 ;
[0012] (4)HJSP-S123纯化后经RsrII、AscI双酶切，连接到相同双酶切的 pWSK-HB-1/3. 9质粒中，完成PRRSV嵌合质粒的构建，命名为pW-HJSP。
[0013] 其中，步骤（l)PCR扩增使用的引物为JX-S2F和JX-S2R，其核苷酸序列如SEQID NO. 2、3 所示；
[0014] 步骤（2)PCR扩增分别以HB-S1F、HB-S1R和HB-S3F、HB-S3R为引物，其核苷酸序列 分别如SEQIDNO. 4-7所示；
[0015] 步骤（3)?〇?扩增的引物为耵-包81〇1^和耵-包8丨〇111?，其核苷酸序列如5￡0 10 NO. 8-9 所示。
[0016] 本发明还提供了制备猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合病毒RvHBJX的方法，包括以 下步骤：
[0017] (1)构建猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒RvHBJX全长cDNA克隆质粒；
[0018] (2)嵌合病毒RvHBJX的拯救。
[0019] 上述方法中，步骤（1)的克隆质粒通过以下方法构建得到：
[0020] 1)以pWSK-JXwn为模板，PCR扩增得到JXwn06的整个结构蛋白编码区，扩增产物 命名为HJSP-S2 ;
[0021] 2)以pWSK-HB-1/3. 9为模板，分别PCR扩增HB-1/3. 9结构蛋白编码区两侧序列， 分别命名为HJSP-S1、HJSP-S3 ;
[0022] 3)将步骤1)和2)的扩增产物纯化回收后，以HJSP-S1，HJSP-S2,HJSP-S33个片 段作为模板，PCR扩增得到HJSP-S123 ;
[0023] 4)HJSP-S123纯化后经RsrII、AscI双酶切，连接到相同双酶切的 pWSK-HB-1/3. 9质粒中，完成PRRSV嵌合质粒的构建，命名为pW-HJSP。
[0024] 全基因组序列测定表明，pW-HJSP质粒中结构蛋白编码区与JXwn06 -致，而其余 骨架与HB-1/3. 9 -致，同时HB-1/3. 9亲本拯救病毒的两个遗传标记MluI与SfiI酶切 位点仍然存在。
[0025] 进一步地，步骤1)中PCR扩增使用的引物为JX-S2F和JX-S2R，其核苷酸序列如 SEQIDNO. 2、3 所示；步骤 2)中PCR扩增分别以HB-S1F、HB-S1R和HB-S3F、HB-S3R为引 物，其核苷酸序列分别如SEQIDNO. 4-7所示；步骤3)中PCR扩增的引物为HJ-fusionF和HJ-fusionR，其核苷酸序列如SEQIDNO. 8-9所示。
[0026] 本发明的制备猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合病毒RvHBJX的方法中，步骤（2)的嵌 合病毒RvHBJX的拯救通过以下方法来实现：
[0027] 1)用RsrII、PacI内切酶消化pW-HJSP全长cDNA克隆质粒，使质粒线性化；获 得的线性化质粒经酚氯仿抽提及无水乙醇沉淀、干燥后，紫外分光光度计测定纯化后质粒 的浓度；
[0028] 2)立即进行体外转录；
[0029] 3)转录产物经TURBODNaseI消化后，用DMRIE-C脂质体转染MARC-145细胞，每 天观察并记录细胞病变CPE的产生情况；将出现明显CPE的细胞培养上清在MARC-145细胞 上进行连续传代，每代3-5d。获得的拯救病毒即为RvHBJX。
[0030] 在本发明的实施例中，上述步骤2)的体外转录是按照mMessagemMachinc?High YieldCappedRNATranscriptionkit(AmbionInc.，Texas,USA)操作说明进行的。
[0031] 本发明提供了一种猪繁殖与呼吸综合征嵌合疫苗，含有本发明提供的猪繁殖与呼 吸综合征嵌合病毒RvHBJX或其传代培养后的病毒。
[0032] 本发明提供了猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒或其传代培养后的病毒在制备疫苗 中的用途。
[0033] 本发明发现嵌合病毒RvHBJX在MARC-145细胞上连续传代80次后，病毒滴度由第 5代的104 5TCID5(l/mL升高至107.51TCID5(l/mL。经过多次连续的体外传代，嵌合病毒的细胞适 应能力显著提高。
[0034] 本发明通过选择RvHBJXP40、P60、P80毒株人工感染仔猪，分析比较其对高致病性 PRRSV感染的免疫保护性，结果发现PRRSV嵌合毒株RvHBJXP40、P60和P80细胞传代毒株 免疫仔猪后均能减轻感染仔猪的临床症状，降低感染仔猪血清中的病毒载量，显著降低仔 猪的死亡数量，减轻病毒感染造成的肺脏损伤。该嵌合病毒经MARC-145细胞体外连续传代 80次，该病毒遗传性质表现稳定；病毒对宿主细胞的适应性随传代次数的增加逐渐增强； PRRSV嵌合毒株RvHBJXP60传代60次（P60)及以上对本体动物具有较好的安全性，且接种 后能够对高致病性PRRSV毒株感染提供100%的免疫保护，可作为猪繁殖与呼吸综合征的 疫苗候选株开发。
[0035] 经动物安全性试验及攻毒保护性试验证明，本发明所获得的猪繁殖与呼吸综合征 嵌合疫苗HBJX接种仔猪后不会引起明显的临床症状，作为疫苗使用的安全性较好；并能够 为感染仔猪提供较好的免疫保护，减轻高致病性PRRSV感染带来的危害。该嵌合疫苗的病 毒骨架来源于临床分离的自然低