专利名称：人乳头病毒dna嵌合疫苗及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，更涉及人乳头瘤病毒(HPV)16型病毒疫苗，还涉及人乳头瘤病毒16型DNA治疗性疫苗的制备方法；同时还涉及该疫苗的一种应用。
背景技术：
宫颈癌是严重危害妇女健康和生命的恶性肿瘤之一，全球每年约有50万新发病例，25万人死亡，是引起妇女死亡的第二大原因，其中大部分在发展中国家，占80％左右(Cain JM，Science，2000，2881753-1754)。1977年德国学者Zur Hausen等从宫颈癌标本中发现了人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)DNA，推测HPV感染与宫颈癌发生有关。进一步的分子流行病学证据表明，HPV与人类多种癌症，特别是与宫颈癌有着密切的关系。约93％的宫颈癌组织中可检测到HPV DNA，其中HPV16型占65％(Chen LP，et al.Proc NatlAcad Sci USA，1991，88110～114)。目前HPV16感染在临床上尚无预防措施且容易恶变，癌前病变采用药物治疗效果差、花费高，化疗和手术治疗也不理想，因此研究和开发HPV16的预防和治疗性疫苗有重要的现实意义。
一、HPV的生物学特征HPV属乳头多瘤空泡病毒科(Papovaviridae)乳头瘤病毒属，是一类感染表皮和粘膜鳞状上皮的小DNA病毒。其基因组为双链环状DNA，长7.5～8.0kb，含8个开放阅读框(open reading frames，ORFs)，依功能不同分3个区(1)早期区(early region，E区)分别编码E1、E2、E4、E5、E6、E7等六个早期蛋白，参与病毒DNA的复制、转录、翻译调控和转化等功能。(2)晚期区(late region，L区)编码主要外壳蛋白L1和次要外壳蛋白L2。(3)非编码区(uncoding region，UCR)或上游调控区(URR)含有HPV基因组DNA的复制起点和HPV表达所必需的调控元件黄文林，分子病毒学，人民卫生出版社，2002).。目前已鉴定出110多个型别，按其致癌性大小可分为低危型、中危型和高危型三类。低危型HPV主要引起表皮细胞良性增生，如HPV6和11型可引起生殖器疣和儿童复发性乳头瘤。高危型(HPV16，18，31，45等)HPV与宫颈上皮内瘤的发生和恶变以及其他上皮性肿瘤的发生相关。HPV感染在人群中较为普通，大部分人在性生活开始后，都感染过该病毒。病毒通过受损的上皮组织进入基底层细胞，其复制周期受严格的调节，并依赖于病毒编码的蛋白质和宿主上皮细胞的分化程度。病毒感染通常为局部限制性，不引起炎症反应。大多数人都能自行清除病毒，只有一小部分人由于免疫系统的原因无法清除病毒，造成HPV持续存在，继而发展为宫颈癌。
由于HPV病毒体仅存在终末分化的复层鳞状上皮组织中，含量很少，到目前为止，缺乏完整的体外培养系统，也无法制备减毒活疫苗或灭活疫苗，因此HPV疫苗研制只有借助基因工程技术来完成。
二、HPV疫苗的研究现状目前，针对HPV16的疫苗主要包括预防性和治疗性疫苗(袁光文吴令英，癌症进展杂志2004，2(5)339-342)。预防性疫苗分为蛋白质水平(包括合成肽疫苗和基因工程亚单位疫苗)及核酸水平，均集中于HPV晚期基因(L1和L2基因)及/或其编码的蛋白产物(外壳蛋白)，这主要是因为外壳蛋白具有保守性以及天然病毒相似的抗原表位，可以诱导机体产生特异性体液免疫和粘膜免疫，保护机体免受HPV感染。HPV治疗性疫苗主要是针对HPV早期基因E6、E7及/或其编码的蛋白，目前各种形式以E6/E7为靶抗原治疗性疫苗蓬勃发展，种类有重组活载体疫苗、肽疫苗、蛋白疫苗、核酸疫苗以及细胞疫苗。
三、HPV治疗性疫苗治疗性疫苗主要是以早期基因产物E6、E7作为靶蛋白，其目的是诱导机体产生特异性细胞免疫反应，清除已感染的HPV，治疗由感染引起的癌前病变合肿瘤。大多数研究中靶抗原重要集中于E7蛋白，这是因为E7容易获得高水平的表达并易于用免疫学方法测定，而且E7的序列较E6更为保守。HPV E7是维持细胞转化状态所必需的。在转化细胞中整合于人类基因组中，且持续表达，含有多个B细胞表位、CD4细胞表位、CD8 CTL表位，与MHC分子亲和力高、抗原性强，E7蛋白的一些结合人类及小鼠淋巴细胞的表位已经被确定。然而由于E7蛋白本身具有转化活性，直接应用于人体有一定的危险性，去除E7的转化活性，保留其抗原性成为疫苗研制的前提。研究资料证明，同时改变E7蛋白氨基端的PRB结合位点中的两个关键氨基酸，既24位的Cys和26位的Glu，可完全消除其PRB结合活性和体外转化啮齿类细胞的功能。E7蛋白C末端对其稳定性有重要作用，其锌指结构的突变可显著降低E7蛋白的稳定性和致癌性(Barbosa MS，Lowy DR，Schiller JT.J Virol，1989；63(3)1404)，提高了DNA疫苗的安全性；Shi等设计了HPV16 E7DNA疫苗两个锌指结合区的突变，产生了快速降解的E7蛋白。突变的E7 DNA疫苗诱导出显著增强E7特异性CTI，反应及比野生型E7 DNA疫苗更强的体内抗瘤反应。(Shi W，et al.J Virol，1999，73)]。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人乳头病毒DNA嵌合病毒疫苗，该疫苗可显著加强特异的细胞毒性T淋巴细胞反应(cytotoxic T lymphocytes，CTL)应答及抗瘤作用，较其他HPVDNA疫苗有更强的免疫治疗效果，且安全和廉价，易于运输、储存，质量易控制及评价，可用于与HPV感染引起的相关肿瘤，如宫颈癌的免疫治疗。
一种人乳头病毒DNA嵌合病毒疫苗，其分类命名HPV16E7-HSP70DNA嵌合疫苗，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国.武汉.武汉大学，保藏时间2005年8月8日，保藏编号CCTCC NOM205087。
本发明另一个目的在于提供制备人乳头病毒DNA嵌合疫苗的方法，该方法技术成熟、稳定，操作简单，重复性强；制备的疫苗能够诱导免疫小鼠产生较强的特异性体液及细胞免疫反应。
本发明还涉及人乳头病毒DNA嵌合疫苗在治疗宫颈癌中的应用。
为了实现上述任务，本发明采用以下技术措施本发明提供的DNA疫苗是通过基因克隆等生物技术制备，涉及常规基因工程技术目的基因与载体的选定、获取；目的基因与载体体外重组；重组分子导入受体细胞；目的基因筛选、鉴定；真核细胞内表达；基因免疫小鼠；体液免疫检测；细胞免疫检测、蛋白的稳定性分析；安全性检测等。本发明的基因疫苗(又称DNA疫苗，核酸疫苗)是将编码特定抗原蛋白的基因序列克隆到合适的质粒载体上而制备成的核酸表达载体，通过肌肉注射，基因枪注射等将其直接接种入机体内，在宿主体内持续表达外源基因，合成抗原蛋白质，从而激发机体免疫系统产生针对外源蛋白质的特异性免疫应答(徐道华等免疫学志，200420(3)46-49)。DNA疫苗具有其他疫苗无法比拟的优点，通过外来抗原提呈给抗原提呈细胞，刺激CD4+和CD8+T细胞产生有效的细胞毒性T淋巴细胞和抗体反应。同时制备简便，成本低廉，易于运输、储存，质量易控制及评价，免除污染，可通过多种途径免疫接种，并能稳定地整合人基因或以游离形式长时间维持，延长目的抗原的表达，增强免疫记忆。
DNA疫苗可在细胞内合成具有真正天然构象的抗原蛋白，经宿主自身的MHC分子呈递，全面持久的激活机体的免疫系统；物理性能稳定，且易于构建，可将多种抗原的DNA联合构建，价格便宜尤其适合在发展中国家广泛应用。但DNA疫苗诱导的免疫效应较弱，必须想方设法增强其免疫原性，Chen等将HSP70与HPV16E7基因融合可加强MHC I/肽的呈递，提高CD8+T应答。E7/HSP70嵌合基因疫苗可显著加强E7特异的CTL应答及抗瘤作用(Chen Ch，etal.CancerRes，2000，60(4)1035-1042)]。另外将抗原基因串联融合形成的4种HPV16表位(CTL细胞，Th细胞及B细胞表位)的DNA疫苗，可使所有的免疫鼠免受肿瘤细胞的攻击同时联合免疫细胞因子等其他免疫分子如IL-12及B7-1等基因，亦可显著增强HPV16DNA疫苗的免疫效果(Journal international du cancer，1999 May 5，81(3)428-37)。
国内治疗性疫苗研究主要集中在针对高危型HPV16去除E7的转化活性，保留其抗原性(周小山等，中国肺癌杂志2004；7(5)379-382)、E6\E7融合蛋白疫苗(周小山等，中国肿瘤生物治疗杂志2005；12(1)19-22)；嵌合型病毒样颗粒是同时含HPV16L1E7部分表位(卞继峰等，山东医科大学学报，2000；38(2)113))本发明的DNA疫苗的安全性DNA疫苗接种在人体内的安全性和免疫原性的研究一直在进行。在第一批临床研究中就首先评价的疫苗包括肌肉注射编码免疫球蛋白单链可变区的DNA疫苗(Fvs)(该疫苗的抗原来自一名正在治疗B细胞淋巴瘤患者的淋巴瘤细胞表面免疫球蛋白，肌肉注射阳离子脂质体包裹的编码MHC单倍体抗原的质粒，用来治疗黑色素瘤，以及肌肉注射HIV病毒糖蛋白gp160/rev来治疗HIV阳性的无症状患者。后来HIVgp160/rev DNA疫苗的研究还延伸到正常未感染HIV的人身上。以及编码疟疾抗原的质粒被肌肉注射到健康志愿者身上。
在迄今为止的所有临床试验报道中，初步的研究结果显示DNA疫苗的耐受计量在分3次或更多次的肌肉注射或皮下照射的情况下可累积多达2.5mg之多(Le TP，Coonan KM，Vaccine 2000，181893-1901.)。在一项晚期黑色素瘤的研究中，将编码HLA-B7抗原的质粒注入患者肿瘤内，在剂量分别达30,100和300ug的情况下，只在患者的肿瘤中发现CTL细胞，而外周血中却未发祥增加的CTL细胞。在另一项试验中，在分三次注射编码p.falciparum蛋白的质粒累积达2.5mg的情况下，在试验者体内观察到强烈的CTL反应。
有大量的研究焦点集中在DNA疫苗与宿主基因组整合性的问题上(梁朝霞等，国外医学肿瘤学分册2004，31(9)658-661)。实际上，DNA疫苗构建时允许定位的，短期的表达目的基因，因此它不包括常见的整合序列，如缺乏的与人类基因同源的序列或真核细胞源性的复制子。对于传统的疫苗来说，监控只包括单次剂量的毒性，重复剂量的毒性和取决于靶群体的毒性试验。实验室评价也只包括相对标准的组织病理学和血液病理学的实验。但对于DNA疫苗来说必须加入关于整合的研究，生理分布的研究，抗核苷酸抗体产生的关注。成功的关键包括细致和全面的临床前研究和尽早的建立与监控者的沟通，以确保产品的安全性。
具体步骤如下疫苗构建1.癌组织DNA的提取将癌组织先研磨成匀浆后常规蛋白酶K消化，等体积酚、氯仿抽提后，加入50μL TE缓冲液溶解DNA，-20℃冻存备用。
2.HPV16-mE7基因与热休克蛋白的获取以癌组织提取DNA为模板PCR法扩增HPV-mE7。在50μl反应体系中加入DNA模板1μl，引物各50pmol，10×PCR缓冲液5μl，2.5mmol/L Mgcl25μl，dNTPs各100μmol/L，1U Taq DNA聚合酶。引物为P15’GGGAATTCATGCATGGAGATACACCT3’EcoRIP25’GGGGATCCTGGTTTCTGAGAACCGAT3’BamHI突变位点94℃预变性300秒后94℃变性60秒，55℃复性60秒，72℃延伸60秒，共30循环，末次循环后72℃延伸300秒。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶检测。
小量提取质粒pKs70(Suzue K，Young RA.J Immunol 1996156873-879.)用限制性内切酶BamHI、HindIII双酶切后，低熔点(60℃)琼脂糖回收HSP70，用于连接反应。
3.目的DNA片段与载体的连接按载体与外源片段1∶3(摩尔比)的量，与载体pcDNA3.1(Invitrogen公司v795-20)连接。
4.感受态细胞的制备与转化用冷CaCl2法制备感受态细胞，次日取连接反应混和物5μl加入感受态细胞，旋转混匀，冰浴30分钟后置水浴42℃热休克2分钟。冷却后加入400μlLB培养基，37℃100rpm轻摇45分钟。取50～150μl菌液涂于含Amp的LB平板上，37℃培养过夜。同时设立感受态菌阴性对照。
5.重组质粒的筛选、鉴定重组质粒DNA及空载体作双酶切(BamHI/HindIII)、(EcoR I/BamHI)。1％琼脂糖电泳，紫外透射反射检测仪上观察可见明显的目的片段和载体片段，与预期的结果相符，表明目的基因已被插入到载体pcDNA3.1中。将重组质粒pcd-HPV16E7-HSP70测序确定E7基因的突变位点及阅读框架。
重组质粒pcd-HPV16E7-HSP70构建流程见图1，对照质粒(对照DNA疫苗)的构建流程见图2；酶切鉴定见图3、4。重组质粒pcd-HPV16E7-HSP70突变序列如SEQ ID NO1所示。
人乳头病毒DNA嵌合疫苗的应用1.重组质粒转染真核细胞将重组质粒pcd-HPV16E7-HSP70脂质体法转染NIH3T3细胞，48h后收集转染的NIH3T3细胞约5×106个，提取总RNA进行逆转录PCR，可扩增出长度为310bp的特异性条带即HPV16E7m的cDNA，结果如图52.DNA疫苗免疫动物将4-6周龄的C57BL/6近交系小鼠随机分为7组，每组6只。预先用0.25％利多卡因50ul处理小鼠，3d后于胫前肌同一部位多点注射DNA疫苗，按100ug/只/次剂量注射，两周后加强免疫一次，共加强免疫两次。
3.MTT法检测小鼠脾淋巴细胞特异性增殖反应脾淋巴细胞悬液调整浓度为6×106/mL。以100μL/孔与5μL(15μg)的E7蛋白共同培养5天，以不加E7蛋白刺激的淋巴细胞作为对照(均设三个复孔)，然后加入MTT10μL/孔，37℃温育4小时，加酸化的异丙醇终止反应。酶标仪检测波长570nm处的吸光度值。淋巴细胞增殖能力等于实验组A570值减去对照组A570值。结果显示，与野生pcd-wE7组比较，嵌合pcd-HPVmE7-HSP70组能诱导更强的特异性淋巴细胞增殖反应(p＜0.05)，pcd-HPVmE7-HSP70和突变pcd-mE7组之间没有显著性差异(p＞0.05)。(表1)表1MTT法检测免疫小鼠淋巴细胞体外增殖情况
note*与PBS组比较，P＜0.01；#与wE7组比较，p＜0.01酶标仪检测波长570nm处的吸光度值。淋巴细胞增殖能力等于实验组A570值减去对照组A570值。结果显示，与野生pcd-wE7组比较，嵌合pcd-HPVmE7-HSP70组能诱导更强的特异性淋巴细胞增殖反应(p＜0.05)，pcd-HPVmE7-HSP70和突变pcd-mE7组之间没有显著性差异(p＞0.05)。
4.ELISPOT检测分泌IFN-γ的T淋巴细胞数量采用酶联免疫斑点法(Enzyme Linked Immunospot，ELISPOT)进行，严格按照说明书操作，结果显示，HPV16mE7-HSP70组频数显著高于HPV16mE7组和HPV16wE7组。说明HPV16mE7-HSP70 DNA疫苗可以显著增加小鼠体内分泌IFN-γ特异性T细胞数(图6)。
5.乳酸脱氢酶法检测CTL杀伤率将制备的免疫小鼠脾淋巴细胞与20μl的E7蛋白混合，用含10％小牛血清的1640培养液共同培养4天，进行细胞计数，调整细胞浓度，作为效应细胞。用表达E7基因的小鼠黑色素瘤细胞细胞作为DNA疫苗免疫小鼠后的CTL检测用靶细胞。结果显示，嵌合pcd-mE7-HSP70组特异性杀伤作用显著高于野生pcd-wE7和突变pcd-mE7组(p＜0.01)。说明嵌合DNA疫苗能诱导产生针对E7的特异性CTL反应，而且作用强于单独野生及突变的E7组。(图7)6.抗HPV16E7抗体的检测末次免疫后两周，眼球取血。采用间接ELISA法检测血清中抗HPV16E7的抗体水平。结果显示，与PBS组和空载体组比较，pcd-wE7 DNA疫苗、pcd-mE7DNA疫苗、和pcd-HPV16mE7-HSP70 DNA疫苗均能诱发HPV16E7特异性的体液免疫反应，但诱导的程度无差别。(图8)7.质粒DNA在染色体上的整合情况利用载体上的DNA序列设计引物对肌肉基因组中的整合情况进行反向PCR扩增，结果显示有反向PCR产物扩增出，大小约为5.6Kb，说明质粒DNA没有整合到染色体中。(图9)8.DNA疫苗对动物重要脏器影响的检测取DNA疫苗免疫2个月小鼠的重要脏器肝脏、肾脏、脾脏等，肉眼观察小鼠这些脏器生长无异常。光镜下，免疫小鼠肝细胞无肿大，细胞排列整齐、规则；肾脏肾小球结构完整，肾小管上皮无明显肿胀；脾脏组织细胞正常(图10)。提取上述组织的DNA和总RNA，进行PCR及RT-PCR扩增，以监测质粒DNA在体内分布，了解DNA疫苗注射的安全性。结果显示在小鼠主要脏器中没有疫苗DNA的摄入及表达。
9.Western-blot对HPV16mE7-HSP70融合蛋白的稳定性分析收获经蛋白酶抑制剂ALLN处理、未处理的稳定表达pcd-HPV16mE7-HSP70融合基因的NIH3T3细胞及未转染NIH3T3细胞，细胞裂解后SDS-PAGE分离细胞总蛋白，分离的总蛋白从凝胶上电转移到NC膜上后，E7特异性单克隆抗体检测细胞HPV16E7突变蛋白的表达，结果显示突变的E7蛋白在未加蛋白酶抑制剂的细胞中明显比加蛋白酶抑制剂的细胞中表达量低，说明HPV16mE7-HSP70融合蛋白在细胞中具有不稳定性，突变的E7蛋白降解速度增加，可增加抗原呈递，免疫效果更强。(图11)10.DNA疫苗对B16-HPV16E7肿瘤的治疗作用C57BL/6小鼠，雌性，6-8周龄，每组5只，共分7组。常规胰酶消化B16/E7细胞，PBS洗3次后，细胞计数并稀释为1×106/ml，将上述细胞接种于C57BL/6小鼠的右侧背部皮下，每只0.2ml。3天后，按2.3的分组和剂量接种各种质粒DNA免疫各组小鼠，每组小鼠右侧大腿肌肉注射，每7天重复一次，共三次；另取C57BL/6小鼠，15只，随机分为3组，其中两组每只接种1×106/ml的肿瘤细胞0.2ml，3天后一组接种PBS疫苗另一组接种HPV16mE7-HSP70疫苗；最后一组接种B16肿瘤细胞，然后用HPV16mE7-HSP70疫苗免疫。每周两次观察各组的出瘤期，记录肿瘤小鼠生存期和存活率。
小鼠皮下接种B16-HPV16E细胞后，采用DNA疫苗治疗三次，观察疫苗对荷瘤小鼠的治疗作用。结果发现，pcDNA3.1组、HSP70组和PBS组肿瘤生长迅速，HPV16wE7组，HPV16mE7组及HPV16mE7-HSP组对肿瘤抑制作用在60天的观察期内，HPV16mE7-HSP70 DNA疫苗组小鼠肿瘤并没完全消退，但生存期显著延长，其中一只小鼠带瘤存活(＞60天)，其余各组均在56天内全部死亡，如图5。说明DNA疫苗在体内能显著抑制表达HPV16E7抗原肿瘤的生长，显著提高荷瘤小鼠成瘤的潜伏期和生存率。(下表及图12.13)
本发明与现有相比，具有以下优点和效果免疫学研究证明，细胞免疫活性的高低和抗原分子降解的速度相关，即降解越快，CTL的活性越高。不稳定蛋白质相对于稳定蛋白质具有更强的刺激产生CTL反应的能力(Tobery，T.W)。申请人将E7蛋白C端锌指结构突变突变(第91位Cys)后使E7蛋白的稳定性下降，加速E7蛋白降解成小分子多肽，从而提高了E7抗原肽的递呈效率；同时锌指结构的突变将降低E7基因的致癌性，增加了DNA疫苗的安全性。由于结核杆菌热休克蛋白70作为分子伴侣参与抗原的折叠、装配、转运和加工递呈过程，具有载体分子效应和佐剂作用，显著增强了DNA疫苗的免疫效能。因此，申请人将突变C末端锌指结构的E7基因与结核杆菌HSP70基因融合在一起构建成pcd-HPV16mE7-HSP70嵌合DNA疫苗，并与pcd-mE7(突变型)、pcd-wE7(野生型)、pcd-HSP70(热休克蛋白70)三种重组质粒比较，分别免疫C57BL/6小鼠，比较几组疫苗诱导产生的免疫应答效果，结果显示pcd-HPV16mE7-HSP70嵌合DNA疫苗免疫组小鼠第四周可以检测到特异性HPV16 E7抗体，第七周抗体水平明显升高。嵌合疫苗免疫组小鼠脾淋巴细胞受E7蛋白体外刺激，MTT法检测到更强的特异性淋巴细胞增殖反反应，ELISPOT检测分泌IFN-γ的T淋巴细胞数量明显增加，LDH法检测到特异性CTL杀伤活性显著增强了。免疫小鼠接种肿瘤细胞后，生存期明显延长，肿瘤生长减慢。同时以大剂量(500ug/只)疫苗肌肉注射免疫小鼠，观察小鼠肝、脾、肾等重要脏器的组织切片，结果没有观察到病理性改变，RT-PCR也没有检测到E7基因表达。反向PCR结果显示，肌肉组织没有发现载体与宿主染色体整合的情况。
实验证明该嵌合DNA疫苗安全、有效，可诱导产生较强的体液免疫和细胞免疫应答，对表达HPV16E7蛋白的肿瘤细胞有很好的杀伤作用，表明该DNA疫苗是一种免疫原性强，特异性高的肿瘤治疗性疫苗。
图1为重组pcd-HPV16E7-HSP70融合质粒(DNA嵌合疫苗)构建流程图。
图2为重组质粒pcd-mE7、pcd-wE7、pcd-HSP70(对照质粒)构建图。
图3为重组质粒pcd-HPV16E7-HSP70酶切鉴定图重组质粒(即嵌合DNA疫苗)经EcoRI/BamHI双酶切后，产生310bp的E7片段和7.2kb的载体片段；经BamHI/HindIII双酶切，产生1.8bpHSP70片段和5.7载体片段，与预期的结果相符，表明目的基因已被插入到载体中。
图4为重组对照质粒鉴定图对照质粒pcd-mE7经BamHI、EcoRI双酶切；.pcd-wE7经BamHI、EcoRI双酶切；PcDNA3.1空载体酶切后电泳，片段大小与预期结果一致。
图5为嵌合质粒DNA在真核细胞中表达(RT-PCR)将重组质粒pcd-HPV16E7-HSP70转染NIH3T3细胞，提取细胞总RNA进行逆转录PCR，可扩增出长度为310bp的特异性条带即HPV16E7m的cDNA。
图6为ELISPOT检测DNA疫苗免疫小鼠分泌IFN-γ的T淋巴细胞频数HPV16mE7-HSP70组频数显著高于HPV16mE7组和HPV16wE7组。说明HPV16mE7-HSP70 DNA疫苗可以显著增加小鼠体内分泌IFN-γ特异性T细胞数。
图7为DNA疫苗免疫小鼠脾淋巴细胞对表达HPV16E7的B16-F0细胞特异性杀伤作用pcd-mE7-HSP70组特异性杀伤作用显著高于野生pcd-wE7和突变pcd-mE7组(p＜0.01)。说明嵌合DNA疫苗能诱导产生针对E7的特异性CTL反应，而且作用强于单独野生及突变的E7组。
图8为DNA疫苗免疫小鼠血清的HPV16E7抗体
pcd-wE7 DNA、pcd-mE7 DNA、和pcd-HPV16mE7-HSP70 DNA疫苗均能诱发HPV16E7特异性的体液免疫反应，诱导的程度无差别。
图9DNA整合实验为反向PCR检测肌肉组织质粒DNA在肌肉组织中的整合情况。结果显示有反向PCR产物扩增出，大小约为5.6Kb，说明质粒DNA没有整合到染色体中。
图10为动物安全性检测a小鼠肝组织HE染色(×200)，b小鼠肾组织HE染色(×200)，c小鼠脾组织HE染(×200)。
光镜下，免疫小鼠肝细胞无肿大，细胞排列整齐、规则；肾脏肾小球结构完整，肾小管上皮无明显肿胀；脾脏组织细胞正常。
图11为Western Blot检测融合蛋白稳定性1.转染细胞加蛋白酶抑制剂(ALLN)2.转染细胞未加ALLN3未转染细胞突变的E7蛋白在未加蛋白酶抑制剂的细胞中明显比加蛋白酶抑制剂的细胞中表达量低，说明HPV16mE7-HSP70融合蛋白在细胞中具有不稳定性，突变的E7蛋白降解速度增加，可增加抗原呈递，免疫效果更强。
图12为对照小鼠接种肿瘤细胞后肿瘤生长迅速、存活期短小鼠皮下接种B16-HPV16E细胞后，采用DNA疫苗治疗三次，结果发现，pcDNA3.1组、HSP70组和PBS组肿瘤生长迅速。
图13为嵌合疫苗免疫小鼠肿瘤生长受到抑制存活期长HPV16mE7-HSP70 DNA疫苗组小鼠肿瘤生长受到抑制，生存期显著延长。
具体实施例方式
下面结合附图对本发明作进一步详细描述一、PCR扩增HPV16 E7基因及热休克蛋白基因片段的获取及回收在0.5mlEppendorf管中依次加入10×Buffer 5μl，10×dNTP 5μl(终浓度200umol/L)，Primer 1，2各1μl(约30pmol)，模板DNA 1μl(约0.1ug)，ddH2O 31μl混匀，加TaqDNA聚合酶1U，石蜡油40μl。按下列条件循环30次，94℃1min，55℃1min，72℃1min，最后延伸5min。扩增产物1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。将扩增的产物310bp DNA片段经低熔点(60℃)琼脂糖回收。
提取质粒pKs70用限制性内切酶BamHI、HindIII双酶切后，低熔点(60℃)琼脂糖回收HSP70，用于连接反应。
二、连接反应体系如下表表1连接反应体系
总反应体积为20ul，在16℃时连接16小时。反应完毕，取10ul反应物电泳，与不加T4DNA连接酶的对照组比较，估计连接效率。另10ul冰冻保存，留作转化。
三、用冷CaCl2法小量制备感受态细胞及转化实验挑取LB平板上生长良好的单菌落DH5α接种于2ml培养液中37℃培养过夜。次日取上述100μl菌液转接到10ml新鲜培养液中，培养3小时左右至A600约为0.4。离心收获菌液中的细菌，加1/5原菌液体积的冰预冷的0.1mol/L CaCl2液重悬沉淀，冰浴溶液10分钟，再次沉淀细菌，加1/25原菌液体积的冰预冷的0.1mol/L CaCl2液重悬，100ul/管分装，4℃贮存。
次日取连接反应混和物5ul加入感受态细胞，旋转混匀，冰浴30分钟后置水浴42℃热休克2分钟。冷却后加入400μl培养基，37℃100rpm轻摇45分钟。取50～150μl菌液涂于含Amp的LB平板上，37℃培养过夜。同时设立感受态菌阴性对照。
四、重组质粒的筛选、鉴定用牙签挑取上述LB平板上长出的单菌落于3ml LB液体培养基中(含Amp)，37℃振摇过夜，然后快速提取质粒。
质粒DNA先进行1.2％琼脂糖电泳作初筛，选出分子量略大于空载体的质粒作进一步的鉴定。鉴定用PCR和双酶切(EcoRI/BamHI、BamHI/HindIII)，酶切后电泳。按上述步骤先构建pcd-HSP重组质粒后，再将mE7基因克隆入pcd-HSP得到pcd-HPV16E7-HSP70重组质粒。测序鉴定。
五、RT-PCR检测pcd-HPV16mE7-HSP70在真核细胞的表达重组质粒转染NIH3T3细胞，转染前24小时，细胞计数后，将1×105/mlNIH3T3细胞转种于6孔培养板，每孔3ml。将1.5μg pcd-HPV16E7-HSP70质粒DNA和4μl LipofactamineTM2000分别用PBS稀释至50μl，再将质粒溶液与脂质体溶液温和混匀于室温放置30min。将100μlDNA/脂质体复合物逐滴加入NIH3T3细胞中，同时温和摇动培养板混匀。37℃温育6小时后，更换3ml新鲜完全培养基，继续培养48小时。
将上述细胞常规胰酶消化后，室温下离心收集转染细胞约5×106个，加入1mlTrizol按照说明书提取细胞总RNA，提取的总RNA用无RNA酶的双蒸水溶解，再加DNA酶处理可能残余的DNA，然后用紫外分光光度计测A260/A280进行浓度与纯度测定后，-70℃保存。
取上述总RNA 5μg加入5×逆转录酶缓冲液4μl，10mmol/LdNTPs 2μl，10umol/L引物P21μl，AMV逆转录酶0.6μl(10U/μl)，RNAsin20U，双蒸水补足体积至20μl后石蜡油覆盖。瞬时离心后，置42℃反应1小时，95℃变性5分钟终止反应，置-20℃保存。
取10μl上述cDNA反应液，加入10×PCR缓冲液10μl，10mmol/LdNTPs 2μl，10umol/L引物P1及P2各2μl，TaqDNA聚合酶1μl(20U/μl)，加无菌双蒸去离子水补足至100μl。用石蜡油50μl覆盖，短暂离心后，置全自动扩增仪。92℃预变性5分钟后，进行30次如下循环92℃60秒，55℃60秒，72℃60秒，最后延伸72℃5分钟，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
六.Western blotting检测HPV16mE7-HSP70融合蛋白的稳定性1.稳定表达pcd-HPV16mE7-HSP70融合基因细胞株的获得用不含抗生素含10％小牛血清的DMEM培养基将2×105个NIH3T3细胞接种于24孔板，24hr后当细胞生长至90％汇合时进行转染。分别将0.8μg/μl的HPV16mE7-HSP70质粒DNA1μl或2μlLipofectamine2000用无血清的DMEM培养基稀释至50ul，然后将两液温和混匀室温静置30min。将上述100μlDNA/质脂体复合物/孔逐滴细胞中同时轻柔的晃动培养板混匀，空白对照组加入100μl的培养基。然后将培养板于37℃，5％CO2培养箱中孵育6hr后，更换完全培养基继续培养至48小时后，更换含G418 400μg/ml的选择培养基培养，每3天换液1次，两周后选稳定生长的细胞克隆胰酶消化传代后继续G418筛选并扩大培养。
2.蛋白酶抑制剂对表达HPV16mE7-HSP70融合基因细胞株的处理取上述稳定转染的NIH3T3细胞2×105个/孔，接种至24孔培养板，培养24hr后向部分孔中加入终浓度为20μg/ml的蛋白酶抑制剂ALLN，再继续培养24hr后，胰酶消化收集细胞用于表达产物的分析。
3.表达产物的SDS-PAGE分离及表达产物的Western blot分析取上述收集的不同培养细胞，PBS洗涤，离心，用细胞裂解液200μl重悬细胞，冰浴30分钟，12,000rmp离心10分钟，收集上清，-20℃冻存。电泳前取样，加等体积2×SDS上样缓冲液，沸水浴5分钟。采用BIO-RAD电泳仪进行SDS-PAGE不连续垂直电泳，电泳条件5％浓缩胶，8V/cm电泳至染料进入分离胶；12％分离胶，15V/cm电泳至染料凝胶底部约1cm处。
3.1将SDS-PAGE后的凝胶覆盖于0.22μmNC膜上，置于电转移仪中，4℃，10V电转移过夜。
3.2取出电转移后的NC膜，丽春红复染证实转印成功后，ddH2O洗膜。
3..3NC膜用5％脱脂奶粉-PBS(pH7.4)，37℃封闭2小时。
3.4NC膜同用封闭液稀释的1∶500的HPV16E7羊抗鼠单克隆抗体，在4℃下孵育6小时。
3.5PBS充分洗涤NC膜3次，每次15分钟。
3.6将NC膜与辣根过氧化物酶标记的IgG(1∶1000)在37℃孵育2小时。
3.7PBS充分洗涤NC膜3次，每次15分钟。
3.8滴加新鲜配置的DAB液，显色1-3分钟后，用水漂洗NC膜终止反应，观察及分析结果。
七、HPV16mE7-HSP70DNA疫苗安全性的检测1.检测DNA疫苗对动物重要脏器影响取C57BL/6小鼠8只，设立实验组和空白对照组。用1ml注射器取上述DNA溶液，并在注射针头上套上一小塑料管，使针头仅暴露3mm左右，以保证每次注射针头扎入的深度一致。注射时将针头垂直扎入股四头肌，缓慢注入100μlDNA溶液并保持针头10秒，注射前用1％利多卡因0.2ml肌肉麻醉小鼠，当药性发作，小鼠肌肉处于完全松弛状态后注射，每周一次共三次。肉眼观察小鼠生长情况，免疫小鼠2个月后处死小鼠，取小鼠肝、脾、肾组织，10％中性甲醛固定过夜，石蜡包埋，常规组织学HE染色，光镜下观察组织病理学变化。
2检测该DNA疫苗在各脏器的表达情况2.1取新鲜处死小鼠的肝肾脾等脏器，加入DNA抽提液(10mmol/l Tris-Cl，10mmol/l EDTA，300mmol/l NaCl，2％SDS)匀浆至不见组织块；加10mg/ml蛋白酶K至终浓度200μg/ml，50℃保温3小时并不时晃动；加等体积的平衡酚，振荡混匀，12,000g离心10分钟，；加等体积氯仿/异戊醇抽提两次，12,000g离心10分钟；上清加入2.5倍体积冰预冷的无水乙醇，0.1体积的醋酸钠，-20℃放置2小时，12,000g离心10分钟，沉淀DNA；70％乙醇洗涤沉淀，自然风干；溶DNA沉淀于TE缓冲液中，-20℃保存备用。
2.2组织总RNA的提取，按Trizol总RNA提取试剂说明书进行。
2.3组织DNA中E7基因的PCR扩增及总RNA中E7mRNA的RT-PCR扩增的反应条件和反应循环参数见前。
3.小鼠股四头肌中HPV16E7基因和及mRNA以及E7基因肌细胞基因组整合的检测3.1取新鲜处死小鼠质粒注射部位的肌肉组织，按参考文献和试剂说明书分别提取肌肉组织的DNA和总RNA，PCR及RT-PCR组织中的E7基因和总RNA中E7mRNA，反应条件和反应循环参数见前。
3.2反向PCR检测质粒DNA在肌肉细胞基因组中整合情况(1)反向PCR引物的设计根据逆转录病毒载体pLXSN的DNA序列，在pL(HPV16E7)SN中E7基因序列的两端，设计一对引物进行反向PCR以测定疫苗DNA分子是否与细胞染色体整合。序列如下5`primer(1515-1537)5`-GGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTC-3`3`primer(1420-1398)5`-GGTCGAACGAGGAGGTTCAAGGG-3`(2)反向PCR扩增质粒DNA分子以提取的肌肉组织DNA为模板，利用TaKaRa公司的扩增大片段的Taq酶进行PCR扩增，反应体系及条件如下TaKaRa ExTaq(5U/μl)0.25μl10×ExTaq Buffer5μlMgCl2(25mM)4μldNTP Mixture(各2.5mM) 4μl模板DNA 0.2μg引物1(20μM)1μl引物2(20μM)1μl灭菌蒸馏水 补充体积至50μl
八、动物的分组与免疫C57BL/6小鼠35只，雌性，6-8周龄，随机分为6组。分组如下PBS组 100μl/只/次PcDNA3.1 100μg/只/次pcd-HSP70组 100μg/只/次pcd-HPV16wE7组100μg/只/次pcd-HPV16mE7组100μg/只/次pcd-HPV16mE7-HSP70组 100μg/只/次九、细胞和体液免疫反应的检测1小鼠末次免疫后的第8天，小鼠球后动脉取血，颈椎脱臼处死后，70％乙醇浸泡10分钟消毒，然后无菌剪开腹腔，取出小鼠脾脏，置于盛有无血清的RPMI-1640培养基的小平皿中，用钢丝网研磨成细胞悬液，经200目尼龙网过滤，滤液室温1000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀加pH7.2的Tris-NH4Cl 5ml，毛细吸管吹打混匀，置37℃水浴中8分钟以裂解红细胞。室温下1000rpm离心10分钟，并用无血清的RPMI-1640培养基洗涤一次。沉淀细胞用10％NBS的RPMI-1640培养液悬浮，定容计数后，调细胞浓度至1×106/ml。
2.HPV16E7特异性T细胞的检测采用酶联免疫斑点法(Enzyme Linked Immunospot，ELISPOT)进行，严格按照说明书操作，将所需试剂置于室温平衡，捕获抗体浓缩液和稀释液1仍置于2-8℃备用，程序如下2.1向试验板条所用孔中加入200μl无菌培养基，于室温下孵育20分钟，以平衡试验孔。
2.2从试验孔中吸出培养基，每孔立即加入100μl(105个)小鼠脾细胞或各种对照(阳性对照重组的小鼠IFN-γ；阴性对照未刺激细胞；背景对照无菌的培养基；捕获抗体对照用磷酸缓冲液稀释的捕获抗体。)每个试验设一个复孔。
2.3细胞和刺激物(重组HPV16E7蛋白，本室纯化与保存)在37℃，5％CO饱和湿度培养箱孵育24小时。(注意孵育期间勿动细胞。)2.4吸出培养孔内液体，用洗涤液250-300μl充分洗涤培养孔，4次，最后一次洗涤完毕后，尽量甩干液体，并用洁净吸水纸吸干残余液体。
2.5加入100μl稀释的捕获抗体到每一个实验孔，2-8℃孵育过夜，重复步骤4。
2.6每个实验孔加入100μl稀释的Streptavidin-AP，室温下孵育2小时。
2.7重复步骤4。
2.8每个实验孔加入100μlBCIP/NBI显色液，室温，避光孵育1小时。
2.9到掉培养孔中的显色液，用去离子水洗涤实验孔，除尽孔中液体，37℃静置15-30分钟。
2.10在解剖显微镜下观察和统计形成的特异性圆形斑点，定量方法斑点形成细胞数/每孔加入细胞数。
3.细胞毒性试验用乳酸脱氢酶法检测免疫小鼠的CTL活性。
3.1小鼠脾淋巴细胞的制备免疫小鼠摘眼球放血后颈椎脱臼法处死，70％乙醇浸泡消毒。无菌操作解剖小鼠，左侧腹部取脾，加少量的Hank’s液，于100目钢网上研磨分散脾细胞，用3ml Hank’s液重悬脾细胞，2000rpm离心沉降细胞，用0.83％NH4Cl水浴15分钟低渗裂解红细胞；Hank’s液洗涤后，细胞沉淀用含2μg/mlConA10％小牛血清的1640培养基重悬，置于6孔细胞培养板中，37℃，5％CO2条件下培养。
3.2效应细胞的制备将制备的免疫小鼠脾淋巴细胞与20μl的E7蛋白混合，用含10％小牛血清的1640培养液共同培养4天，进行细胞计数，调整细胞浓度，作为效应细胞。
3.3靶细胞的制备B16-HPV16E7细胞作为DNA疫苗免疫小鼠后的CTL检测用靶细胞。
3.4乳酸脱氢酶法检测CTL杀伤率[15]在96孔培养板中建立如下表的组合，每孔平行3孔。37℃，5％CO2条件下培养8hr，其中靶细胞最大自发释放孔及校正液背景孔提前45分钟加入10μl10×Lysis裂解液。每孔取50μl上清加入基质缓冲液250μl、辅酶I50μl混匀后37℃水浴15分钟，加入2，4二硝基苯肼溶液250μl，混匀37℃水浴15分钟后加氢氧化钠溶液终止反应，室温放置3分钟，440nm测定各管吸光度。按公式计算CTL杀伤率乳酸脱氢酶法检测CTL杀伤率反应体系
计算时实验孔A值、效应细胞自释放孔A值和靶细胞自发释放孔要减去培养基背景A值，靶细胞最大释放孔A值要减去校正液背景A值。
4.脾细胞分泌IFN-γ，IL-4水平的测定4.1脾细胞培养上清的制备小鼠颈椎脱臼处死后，70％乙醇浸泡10分钟消毒，然后无菌剪开腹腔，取出小鼠脾脏，置于盛有无血清的RPMI-1640培养基的小平皿中，用钢丝网研磨成细胞悬液，经200目尼龙网过滤，滤液室温1000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀加pH7.2的Tris-NH4Cl 5ml，毛细吸管吹打混匀，置37℃水浴中8分钟以裂解红细胞。室温下1000rpm离心10分钟，并用无血清的RPMI-1640培养基洗涤一次。沉淀细胞用10％NBS的RPMI-1640培养液悬浮，定容计数后，调细胞浓度至5×106/ml。细胞悬液加至96孔细胞培养板，每孔加入100μl，板内预先加有100μl/孔用含10％NBS的细胞培养液配置的10μg/mlConA，每板均设置空白对照与阴性对照，每份样品设3复孔。置37℃。5％CO2饱和湿度培养箱中培养72小时后，2000rpm离心10分钟，收集上清，置-20℃冻存待测。
4.2脾细胞培养上清中IFN-γ的检测采用ELISA方法进行，严格按照说明书操作，程序如下a.从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条(用抗小鼠IFN-γ单抗包被)，其它板条密封后放回4℃。
b.留一个空白孔作空白对照，分别将不同浓度IFN-γ标准品(浓度分别为2000，1000，500，250，125，62.5pg/ml)与待测样品100μl/孔加入相应孔中。每份样品或每种浓度标准品均做复孔，用封板胶封住反应孔，室温(20-25℃)中孵育120分钟。
c.手工洗板5次甩尽孔内液体，加入洗涤液350μl/孔，静置3-秒钟后甩尽液体，在厚叠吸水纸上拍干。
d.除空白孔外，加入检测剂工作液(生物素化抗小鼠IFN-γ抗体与HRP标记的亲和素)100μl/孔，封住板孔，室温(20-25℃)孵育60分钟。
e.洗板5次后，加底物A，B各50μl/孔，避光，室温放置10-30分钟。
f.反应孔显示红色，加入终止液50μl/孔，混匀后5分钟内以空白孔调零，于酶联免疫检测仪上测量450nm处A值。
g.结果判断以标准品浓度为横坐标，A值作纵坐标绘制标准曲线，通过待测样品的A值查出相应IFN-γ的浓度。
4.3脾细胞培养上清中IL-4的检测采用ELISA方法进行，严格按照说明书操作，程序如下a.从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条(用抗小鼠IL-4单抗包被)，其它板条密封后放回4℃。
b.留一个空白孔作空白对照，分别将不同浓度IL-4标准品(浓度分别为2000，1000，500，250，125，62.5pg/ml)与待测样品100μl/孔加入相应孔中。每份样品或每种浓度标准品均做复孔，用封板胶封住反应孔，室温(20-25℃)中孵育120分钟。
c.手工洗板5次甩尽孔内液体，加入洗涤液350μl/孔，静置3-秒钟后甩尽液体，在厚叠吸水纸上拍干。
d.除空白孔外，加入检测剂工作液(生物素化抗小鼠IL-4抗体与HRP标记的亲和素)100μl/孔，封住板孔，室温(20-25℃)孵育60分钟。
e.洗板5次后，加底物A，B各50μl/孔，避光，室温放置10-30分钟。
f.反应孔显示红色，加入终止液50μl/孔，混匀后5分钟内以空白孔调零，于酶联免疫检测仪上测量450nm处A值。
g.结果判断以标准品浓度为横坐标，A值作纵坐标绘制标准曲线，通过待测样品的A值查出相应IL-4的浓度。
5.抗HPV16E7抗体的检测采用ELISA法，程序如下1.小鼠全血37静置30分钟，4放置2小时。2.2000g离心15分钟，吸出血清。3.将纯化的E7融合蛋白用包被液稀释后，以每孔1ug/μl的量包被ELISA板，4℃过夜。4.甩尽孔内液体后，用洗涤液充分洗板三次。5.每孔加入200μl的0.1％牛血清白蛋白封闭ELISA板，37℃孵育2h。6.用洗涤液充分洗涤三次，清空孔内液体。7.将动物血清适当稀释(1∶10)与ELISA板在37℃孵育1h，PBS洗涤3次。8.加入1∶1000稀释的HRP标记得羊抗鼠IgG，37℃孵育1h，PBS洗三次。9.加显色液显色5-10分钟，终止液终止显色。450nm波长下测各孔OD值。
十、DNA疫苗对B16-HPV16E7肿瘤的治疗作用C57BL/6小鼠，雌性，6-8周龄，每组5只，共分7组。常规胰酶消化B16/E7细胞，PBS洗3次后，细胞计数并稀释为1×106/ml，将上述细胞接种于C57BL/6小鼠的右侧背部皮下，每只0.2ml。3天后，按2.3的分组和剂量接种各种质粒DNA免疫各组小鼠，每组小鼠右侧大腿肌肉注射，每7天重复一次，共三次；另取C57BL/6小鼠，15只，随机分为3组，其中两组每只接种1×106/ml的肿瘤细胞0.2ml，3天后一组接种PBS疫苗另一组接种HPV16mE7-HSP70疫苗；最后一组接种B16肿瘤细胞，然后用HPV16mE7-HSP70疫苗免疫。每周两次观察各组的出瘤期，记录肿瘤小鼠生存期和存活率。
十一、数据处理所有数据用SPSS统计软件处理，ELISPOT，细胞因子水平和抗体水平采用t检验；以Fisher`s exact检验分析不同分组的生存期。P小于0.05认为有显著性差异。
SEQUENCE LISTING<110>武汉大学<120>人乳头病毒DNA嵌合疫苗及制备方法和应用<130>人乳头病毒DNA嵌合疫苗及制备方法和应用<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>480<212>DNA<213>人工合成<400>1tacattgcat gaatatatgt tagatttgca accagagaca actgatctct actgttatga60gcaattaaat gacagctcag aggaggagga tgaaatagat ggtccagctg gacaagcaga120accggacaga gcccattaca atattgtaac cttttgttgc aagtgtgact ctacgcttcg180gttgtgcgta caaagcacac acgtagacat tcgtactttg gaagacctgt taatgggcac240actaggaatt gtgtgcccca tcggttctca gaaaccagga tccatggctc gtgcggtcgg300gatcgacctc gggaccacca actccgtcgt ctcggttctg gaaggtggcg acccggtcgt360cgtcgccaac tccgagggct ccaggaccac cccgtcaatt gtcgcgttcg cccgcaacgg420tgaggtgctg gtcggccagc ccgccaagaa ccaggcggtg accaacgtcg atcgcaccgt480
权利要求
1.一种人乳头病毒DNA嵌合疫苗，其特征在于其分类命名为HPV16E7-HSP70DNA嵌合疫苗，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为M205087。
2.一种DNA片段，其具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
3.一种用于实现权利要求1所述的一种人乳头病毒DNA嵌合疫苗的制备方法，它包括下列步骤A、癌组织DNA的提取将癌组织先研磨成匀浆后常规蛋白酶K消化，等体积酚、氯仿抽提后，加入50μL TE缓冲液溶解DNA，-20℃冻存备用；B、HPV16-mE7基因与热休克蛋白的获取以癌组织提取DNA为模板PCR法扩增HPV-mE7，在50μl反应体系中加入DNA模板1μl，引物各50pmol，10×PCR缓冲液5μl，2.5mmol/L Mgcl25μl，dNTPs各100μmol/L，1U Taq DNA聚合酶，引物为P15’GGGAATTCATGCATGGAGATACACCT3’EcoRIP25’GGGGATCCTGGTTTCTGAGAACCGAT3’BamHI突变位点
94℃预变性300秒后94℃变性60秒，55℃复性60秒，72℃延伸60秒，共30循环，末次循环后72℃延伸300秒，扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶检测，提取质粒pKs70用限制性内切酶BamHI、HindIII双酶切后，60℃熔点琼脂糖回收HSP70，用于连接反应；C、目的DNA片段与载体的连接按载体与外源片段1∶3/摩尔比的量，与载体pcDNA3.1连接；D、感受态细胞的制备与转化用冷CaCl2法制备感受态细胞，次日取连接反应混和物5μl加入感受态细胞，旋转混匀，冰浴30分钟后置水浴42℃热休克2分钟，冷却后加入400μlLB培养基，37℃100rpm摇45分钟，取50～150μl菌液涂于含Amp的LB平板上，37℃培养过夜，同时设立感受态菌阴性对照；E、重组质粒的筛选、鉴定重组质粒DNA及空载体作双酶切，1％琼脂糖电泳，紫外透射反射检测仪上观察可见明显的目的片段和载体片段，与预期的结果相符，表明目的基因已被插入到载体中，将重组质粒测序确定E7基因的突变位点及阅读框架。
4.权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒DNA嵌合疫苗在治疗宫颈癌中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种人乳头病毒DNA嵌合疫苗及制备方法和应用，其步骤是首先是用PCR定点突变法将人乳头病毒疫苗的C末端锌指结构区的第91位半胱氨酸密码子变为甘氨酸密码子；其次是将结核杆菌热休克蛋白70基因与突变的E7基因C末端融合，并将该融合基因插入到真核表达载体pcDNA3.1(－)质粒中；第三是酶切和序列分析证明构建的DNA重组质粒正确，并能够在真核细胞内表达；第四是将嵌合DNA疫苗免疫小鼠，检测其诱导的细胞免疫、体液免疫反应及疫苗的安全性以及融合蛋白稳定性。人乳头病毒DNA嵌合疫苗可在宫颈癌的治疗中进行应用。该疫苗安全、有效，运输及储存方便，质量易控制。
文档编号A61P35/00GK1824325SQ20051002006
公开日2006年8月30日 申请日期2005年12月16日 优先权日2005年12月16日
发明者伍欣星, 熊金虎, 李辉, 王同祥, 赵旻, 魏芸, 丘小萍, 谭云 申请人:武汉大学