一种登革病毒通用型ctl表位dna疫苗制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药生物技术领域；更具体地，本发明涉及登革病毒通用型CTL表位 DNA疫苗的构建和应用。
【背景技术】
[0002] 登革病毒（DENV)是一种引起登革热（DF)以及致死性登革出血热（DHF)和登革休 克综合征（DSS)的黄病毒属蚊媒病毒。DENV的四种不同的血清型（DENV-1，2,3,4)均可通 过埃及伊蚊和白纹伊蚊的叮咬传播给人类。DENV已流行于热带和亚热带的100多个国家和 地区，每年约有5000万-1亿的DF病例和25万-50万的DHF / DSS病例。目前，登革病毒 1型（DENV-I)是世界上流行的主要的血清型。自1978年中国广东重现DENV以来，广东、海 南、台湾、云南、广西等地区每隔几年就会出现DENV的流行和爆发，而且福建、浙江、上海、 贵州等地区也时有输入性登革病例报道。近年来，由于全球气候变暖、人口快速增长及频繁 流动、病毒株变异等因素的影响，DENV流行的国家和地区不断增加，其不但对全球人类健康 构成了极大的威胁，而且给公共卫生事业造成了极大的经济负担。虽然多年来的研究已经 广泛地了解了 DENV感染的特征，但在研制特异性的有效抗DENV的药物方面并没有取得突 破性的进展，因此研制具有较好免疫保护作用的预防性和治疗性疫苗具有重要的现实意义 和社会效应。
[0003] DENV感染或接种登革传统疫苗（灭活疫苗或减毒活疫苗）诱导机体产生的非中和 抗体具有介导抗体依赖性增强效应的作用（ADE作用，在机体二次感染不同DENV血清型时 可加重病情），而DENV感染机体诱导的细胞毒性T细胞（CTL，活化的CD8+T细胞）可以杀 伤DENV感染的细胞，对机体具有保护效应。由于，CTL表位是抗原中诱导特异性CTL反应 的最基本的结构和功能单位，不含有可诱导副作用（如ADE作用）的成分。因此，基于CTL 表位的CTL表位DNA疫苗（采用基因工程的方法将编码多个CTL表位的基因连接并插入表 达质粒）是一种很有希望的兼具免疫预防和免疫治疗作用的新型疫苗。此种DNA疫苗接种 后，蛋白质抗原在宿主细胞内表达并被加工释放出单个CTL表位，后者即可诱导CTL表位特 异性CTL反应。与传统疫苗相比，CTL表位DNA疫苗具有成本低、便于贮藏和运输、安全性 高、在体内维持时间长、制备简单、无潜在副作用（如ADE作用）等优点。
[0004] HLA-A的三个等位基因HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2402在不同种族人群中 总的覆盖率均超过80%。因而选择多个受HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2402限制的 CTL表位，将其基因片段串联起来插入真核表达载体，构建成CTL表位DNA疫苗，这样既增 加了 CTL表位的密度，又增加了重组抗原的人群覆盖范围（具有通用型）。HLA-A*0201转 基因小鼠、HLA-A*1101转基因小鼠和HLA-A*2402转基因小鼠分别表达人的HLA-A*0201、 HLA-A*1101、HLA-A*2402 分子，是研究 HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2402 限制性 CTL 反 应及评价多表位DNA疫苗免疫原性的重要动物模型。
[0005] 由于目前尚缺乏防治DENV感染的特效方法，因此迫切需要研发出可用于防治 DENV感染的新型疫苗，尤其是基于CTL表位的CTL表位DNA疫苗。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种利用DENV-I的CTL表位构建登革病毒通用型CTL表 位DNA疫苗的方法，及其在机体免疫以及疫苗制备中的应用。
[0007]本发明将编码 15 个 DENV-I 的 HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2402 限制性 CTL 表位的核苷酸以串联方式构建成一种具有简易制备，稳定表达、高特异性和覆盖人群范围 广的多表位DNA疫苗，以达到预防和治疗DENV感染的目的。
[0008] 本发明涉及一种通用型CTL表位DNA疫苗，其由一个真核表达质粒PCDNA3. 1(_) 载体中和一段如SEQ ID NO :1和图1所示的外源基因片段组成。考虑到宿主细胞表达外源 蛋白时对密码子的偏爱性，还对密码子进行了优化，以期获得最佳免疫效果。
[0009] 本发明的第一个方面提供了登革病毒通用型CTL表位DNA疫苗的制备方法。（1) 该CTL表位DNA疫苗是由真核表达质粒pcDNA3. 1 (-)和一段如SEQ ID NO :1所示的外源 基因序列构成，该基因片段起始密码子ATG的前面为Kozak序列，外源基因所编码的氨基酸 序列包括IgK链信号序列（SEQ ID NO :2)、15条DENV-I特异性CTL表位、小分子连接桥 (Linker)和通用型辅助性T细胞表位（PADRE)，表位序列如下表或SEQ ID NO :3~18所 示。该DNA疫苗具有广泛人群覆盖率，克服了不同人群的HLA分子识别不同抗原表位的不 足；（2)登革病毒多表位基因的设计：合成编码串联表位的核苷酸序列（编码单个CTL表位 的核苷酸之间以编码Linker的核苷酸连接），两端含限制性核酸内切酶Xba I和Hind III 的酶切位点；（3)重组质粒pcDNA3. 1 (-)的构建：上述核苷酸序列用Xba I和Hind III双 酶切，然后与用Xba I和Hind III双酶切的pcDNA3. 1 (-)质粒通过连接反应相连而成登革 病毒通用型CTL表位DNA疫苗；Ig K链信号序列可以引导串联表位进入内质网被蛋白酶体 加工（在Linker的位置切割）释放出单个CTL表位，后者即可诱导CTL反应。PADRE是一 个通用型辅助性T细胞表位（其可被绝大部分人群及小鼠的CD4+T细胞识别），其可辅助上 述释放出的CTL表位诱导CTL反应。
[0010] 本发明的第二个方面公布了登革病毒通用型CTL表位DNA疫苗的用途。登革 病毒通用型CTL表位DNA疫苗免疫HLA-A*0201转基因小鼠、HLA-A* 1101转基因小鼠和 HLA-A*2402转基因小鼠后，可诱导产生CTL表位特异性分泌IFN- Y的T细胞，后者可以杀 伤负载CTL表位的小鼠脾细胞和DENV-I感染的小鼠脾单核细胞。
【附图说明】
[0011]图1、登革病毒通用型CTL表位DNA疫苗的核苷酸与氨基酸序列及注释。其中，上 面为合成的编码串联CTL表位的核苷酸序列（两端为限制性核酸内切酶位点），经Xba I和 HindIII双酶切后连接入下面的pcDNA3. 1 (-)质粒中形成重组pcDNA3. 1 (-)质粒。
[0012] 图2、重组pcDNA3. 1 (_)质粒中插入的核苷酸序列测序图。
[0013] 图3、重组pcDNA3. 1(_)质粒双酶切电泳图。其中，"1"为Xba I和HindIII双酶 切的重组 pcDNA3. 1 (-)质粒；"2" 为重组 pcDNA3. 1 (-)质粒；"M-1" 和 "M-2" 为 Marker。
[0014] 图4、登革病毒通用型CTL表位DNA疫苗免疫转基因小鼠诱导表位特异性 CTL(ELISP0T检测分泌IFN- Y的细胞）。其中，表示与无表位刺激组比较有显著性差 异。
[0015] 图5、登革病毒通用型CTL表位DNA疫苗免疫转基因小鼠所诱导的表位特异性CTL 杀伤负载CTL表位的脾细胞。其中，"E :T"表示效应细胞与靶细胞的比率；表示与未负 载CTL表位脾细胞组比较有显著性差异。
[0016] 图6、登革病毒通用型CTL表位DNA疫苗免疫转基因小鼠所诱导的表位特异性CTL 杀伤DENV-I感染的脾单核细胞。其中，"E :T"表示效应细胞与靶细胞的比率；表示二 者比较有显著性差异。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合附图和实施例对本发明的实施方式作详细描述，但本发明的实施例仅用 于说明本发明而不是限制本发明的保护范围。
[0018] 本发明综合利用分子生物学、病毒学、免疫学、生物信息学等学科知识并结合基因 重组技术，针对DENV研究领域的经验和教训，并考虑到DENV特异性CTL的保护效应，构建 了一种针对DENV-I的不同流行株以及绝大部分人群均有治疗和预防作用的新型登革病毒 通用型CTL表位DNA疫苗。该疫苗通过接种机体，能够诱导特异性CTL反应，达到预防DENV 感染或特异性杀伤DENV感染细胞进而清除体内病毒的目的，既可以作为预防性疫苗用于 免疫接种，又可以作为治疗性疫苗用于DENV感染者的免疫治疗。
[0019] 实施例中采用的试剂、动物等如下：质粒pcDNA3. 1(_)、细菌DH5a菌株由本实验 室保存。HLA-A*