作为针对诺如病毒感染的疫苗的自装配肽纳米粒的制作方法
【专利摘要】本发明描述了包含T细胞表位和展示诺如病毒蛋白VP1的P结构域的自装配肽纳米粒(SAPN)。本发明的纳米粒由连续肽链的聚集体组成，所述连续肽链包含通过接头区段连接的两个卷曲螺旋寡聚化结构域，其中寡聚化结构域的一个或两个在它们的肽序列中包含T细胞表位。这些纳米粒可用作疫苗和佐剂，用于预防和治疗诺如病毒感染。
【专利说明】作为针对诺如病毒感染的疫苗的自装配肽纳米粒发明领域
[0001]本发明涉及包含诺如病毒(norovirus)衣壳蛋白和T细胞表位的自装配肽纳米粒。此外，本发明涉及所述纳米粒在针对诺如病毒感染的疫苗接种中的用途。
[0002]发明背景
“诺瓦克样病毒(Norwalk-Like Virus) ”目前通称为诺如病毒，可能是发达国家和发展中国家中出现的流行性急性肠胃炎的最重要病毒病原体。诺如病毒是二十面体的单链正链RNA病毒,属于杯状病毒科(Caliciviridae family)。其衣壳由180个拷贝的单一主要衣壳蛋白构成。过去，对人类诺如病毒的生物学分析受到了阻碍，因为该病毒抵抗在细胞培养中生长，并且缺乏合适的动物模型来进行病毒培养。病毒的唯一来源是得自人类志愿者研究和得自疾病爆发的人类粪便样品，但粪便中的病毒浓度极小以至于用标准电子显微镜术进行病毒检测是不可行的。然而，通过杆状病毒(其是双链DNA病毒)在昆虫细胞中重组表达诺如病毒衣壳蛋白，使得诺如病毒的流行病学、免疫学和发病机理研究成为可能。构成病毒衣壳的衣壳蛋白自装配成所谓的病毒样颗粒(VLPs)。这些VLPs与人类粪便中发现的真正病毒在抗原性和形态上不能区别，因此为受体-病毒相互作用的研究以及免疫测定的开发提供了有用的工具。
[0003]通过X射线晶体学已经测定了该衣壳蛋白的结构(Prasad BVV等人.，Science286，287-290, 1999)并且该结构可描述为具有两个主要结构域:S结构域和P结构域。二十面体壳主要由S结构域(N-末端225残基)构成,而P结构域(残基225至C-端)构成从壳伸出的二聚体突出物。N-末端S结构域的残基50-225折叠成经典的八链反向平行的β夹心，这是在许多病毒衣壳蛋白中见到的常见折叠。P结构域由两个亚结构域组成:Pl亚结构域由残基226-278和406-520组成；而Ρ2亚结构域由残基279-405组成。Ρ2亚结构域是开始于残基278和结束于残基406的大的插入。Ρ2亚结构域中氨基酸285-380的部分折叠成为紧密的桶-样结构，其由6条β链组成。
[0004]在Pl亚结构域内，残基226-278含有3个短的β链延伸，而C-末端114残基含有6条β链和良好限定的α螺旋。为了构成Τ=3 二十面体结构，衣壳蛋白必须适应3个准等价位置(quas1-equivalent posit1n)。在衣壳蛋白的模块结构中，S结构域参与二十面体接触，而P结构域仅参与二聚体接触。A和B亚单位的P结构域跨越准两重轴(quasitwofold axes)而相互作用，形成二聚体突出物，正如低温显微术重构(cryomicroscopyreconstruct1n)中所见。同样，C亚单位的P结构域跨越二十面体两重轴而相互作用。A/B和C/C二聚体主要通过参与单体的侧链间的相互作用而稳定，其总接触面积为约2000 A2。
[0005]与S结构域和Pl结构域形成对比，P2结构域具有高度序列变异性并因此认为对于免疫识别和受体结合是至关重要的。已经证实具有铰链的分离的P结构域(但缺乏S结构域)在体外构成二聚体，其维持与HBGA受体的结合。已经发现诺如病毒识别人类组织血型抗原为受体。在组织血型抗原中，最常见的血型是ABO (ABH)和Lewis。ABH、Lewis、P和I血型系统中用于形成抗原的生物合成途径是相互关联的。已经将组织血型抗原与若干细菌和病毒病原体感染相关联。这表明组织血型抗原是病原体的识别靶标，并可能促进病原体进入细胞，所述细胞表达或者形成与抗原的受体-配体结合(bond)。虽然这种相互作用的确切性质目前还不清楚，但抗原结合时发生的病原体的紧密关联可能在感染过程的初始步骤中起将病原体锚定到细胞上的作用。人类组织血型抗原是与糖蛋白或糖脂连接的复杂的碳水化合物，其存在于红细胞和粘膜上皮细胞上或作为游离抗原存在于生物液体(例如血、唾液、肠内容物和乳汁)中。通过若干糖基转移酶将单糖序贯添加到抗原前体而合成这些抗原，其受到基因的控制并被称为ABO、Lewis和分泌基因家族。
[0006]原型诺如病毒，诺瓦克病毒株，代表这些已鉴定的与A型和O分泌型(而不是非分泌型)的组织血型抗原结合的结合模式之一。其它已知的结合模式包括识别A、B和O分泌型的VA387株，和结合到A和B分泌型的Μ0Η。人类志愿者研究已经表明诺如病毒和HBGA结合与临床感染的关联，其证明了例如非分泌型的个体在攻击(challenge)之后天然地抵抗NV感染。因此，看来可合理预期 ，其它结合模式的每一种具有由血型所限定的其自身的宿主范围，尽管该假设的直接证据还有待确定。然而，使用一种基因型II，雪山病毒(SnowMountain Virus)(三种已知基因型的GII)诺如病毒株的近期人类志愿者研究，没有揭示出感染和血型之间的明确关联，表明除了组织血型抗原之外的其它因素可能在该毒株的感染中起作用。
[0007]鉴于以上，可有利的是，提供针对诺如病毒的疫苗，其包括对诺如病毒衣壳P结构域的免疫原性反应。
[0008]已经证明P结构域本身(即缺乏N-末端S结构域)独自地构成颗粒，所谓的P颗粒(TanM，等人Virology, 382，115-132，2008)。它们用于开发针对诺如病毒感染的疫苗，并且它们也用于展示其它病原体相关肽和蛋白，以工程改造多组分疫苗(Tan M,等人.，J.Virol, 85，753-764，2011)。
[0009]肽纳米粒描述于WO 2004/071493。包含T细胞表位的肽纳米粒描述于WO2009/109428。
[0010]发明概述
本发明涉及由多个式(I)结构单元的聚集体组成的自装配肽纳米粒(SAPN)，所述式(I)结构单元由包含肽寡聚化结构域D1、接头区段L、肽寡聚化结构域D2、以及诺如病毒蛋白VPl的P结构域或P2亚结构域的连续链组成，
Dl -L-D2 - P (I)，
其中Dl是形成m个亚单位Dl的寡聚体(Dl)ni的卷曲螺旋肽，D2是形成2个亚单位D2的二聚体(D2)2的卷曲螺旋肽，m是3或5，L是键或短接头区段，Dl或D2中的任一个或Dl和D2两者在寡聚化结构域中包含一个或更多个T细胞表位，且其中D2被代表诺如病毒VPl蛋白的P结构域或P2亚结构域的P取代。
[0011]附图简述图1:
pPEP-Τ载体图。用于亚克隆的插入位点以较大字母显示。对于外部插入位点NcoI和EcoRI,指出了原始载体的核苷酸数目。显示了起点、氨节青霉素(ampilicilin)抗性及启动子和T7启动子和终止子。用bp数指出了亚克隆的限制位点(NcoI和EcoRI)。
[0012]图2:
通过SDS-PAGE，分析包含SEQ ID NO:1所示序列的SAPN构建体在大肠杆菌(E coli)BL21 (DE3)细胞中的表达。
[0013]Ui=未诱导的，i=诱导的。在i道中，强条带归因于包含SEQ ID NO:1的构建体，Noro-SAPN，其分子量为44.3 kDa。第一道和最后一道:分子量(kDa)标记物；其它道:其它未诱导的批次。
[0014]图3:
通过SDS-PAGE，分析Noro-SAPN在镍亲和柱上的纯化:用pH 8.0至pH 4.5的逐步pH梯度，接着用高浓度咪唑。
[0015]FT =穿流液(Flow-through) ;M=单体；D=降解；IE=咪唑洗脱，以250 mM咪唑，pH 8.00
[0016]图4:
在pH 6.8，80 mM NaCl, 20 mM MES, 5%甘油中，Noro-SAPN重折叠的电子显微图。A、B、C是不同放大倍数(参见比例条)。
[0017]发明详述
本发明涉及由多个式(I)结构单元的聚集体组成的自装配肽纳米粒(SAPN)，所述式
(I)结构单元由包含肽寡聚化结构域D1、接头区段L、肽寡聚化结构域D2、以及诺如病毒蛋白VPl的P结构域或P2亚结构域的连续链组成，
Dl -L-D2 - P (I)，
其中Dl是形成m个亚单位Dl的寡聚体(Dl)ni的卷曲螺旋肽，D2是形成2个亚单位D2的二聚体(D2)2的卷曲螺旋肽，m是3或5，L是键或短接头区段，Dl或D2中的任一个或Dl和D2两者在寡聚化结构域中包含一个或更多个T细胞表位，且其中D2被代表诺如病毒VPl蛋白的P结构域或P2亚结构域的P取代。
[0018]在连续链Dl -L-D2 - P中，肽寡聚化结构域Dl可以在其N-末端被肽例如由
1-100个氨基酸、尤其是1-20个氨基酸组成的肽进一步取代。一个具体实例是HiS-标签序列，用于纯化目的。
[0019]在连续链Dl -L-D2-P中，肽寡聚化结构域D2和诺如病毒VPl蛋白的P结构域或P2亚结构域可以通过键相连，或备选地，通过1-20个、优选1-10个氨基酸的肽链相连。在其C末端，P结构域或P2亚结构域可被肽例如由1-100个氨基酸、尤其是1-20个氨基酸组成的肽进一步取代。
[0020]肽(或多肽)是通过酰胺键共价连接的氨基酸链或序列。肽可以是天然的、修饰的天然的、部分合成的或完全合成的。修饰的天然的、部分合成的或完全合成的应当理解为，表示不是天然存在的。术语氨基酸包括，选自20种必需的天然α-L-氨基酸的天然存在的氨基酸，合成的氨基酸，例如a-D-氨基酸、6-氨基己酸、正亮氨酸、高半胱氨酸等，以及已经以某些方式进行修饰而改变某些性质(例如电荷)的天然存在的氨基酸，例如磷酸丝氨酸或磷酸酪氨酸等。术语氨基酸进一步包括氨基酸衍生物，其中形成酰胺键的氨基被烷基化，或侧链氨基、羟基或硫官能团被烷基化或酰化，或侧链羧基官能团被酰胺化或酯化。
[0021]优选的是由天然存在的氨基酸和所述氨基酸的衍生物组成的肽，其中形成酰胺键的氨基被烷基化，或侧链氨基、羟基或硫官能团被烷基化或酰化，或侧链羧基官能团被酰胺化或酯化。
[0022]短接头区段L优选地是肽链，例如由1-20个氨基酸、尤其是1-6个氨基酸组成的肽链。
[0023]卷曲螺旋是肽序列，其具有间隔3和4个残基的主要疏水性残基的连续模式，其装配形成多聚体螺旋束，这将在下文中更详细地解释。
[0024]“包含T细胞表位的卷曲螺旋”是指，对应的表位包含在寡聚化结构域中，从而在侧接N-末端和C-末端表位的卷曲螺旋氨基酸序列迫使表位适应仍然是卷曲螺旋的构象，与包含所述表位的寡聚化结构域的寡聚化性质相一致。具体地讲，“包含的”不包括这样的情况:其中所述表位连接在卷曲螺旋寡聚化结构域的任一个末端。
[0025]在本文件的情况下，术语T细胞表位应当用于指CTL和HTL表位两者。
[0026]DU D2和P可以被靶向实体或增强纳米粒的佐剂性质的取代物任选进一步取代，所述取代物例如免疫刺激的核酸，优选含有脱氧肌苷的寡脱氧核苷酸，含有脱氧尿苷的寡脱氧核苷酸，含有CG基序的寡脱氧核苷酸，或含有肌苷和胞苷的核酸分子。增强纳米粒的佐剂性质的其它取代物是抗微生物肽，例如阳离子肽，它们是一类能促进和/或提高适应性免疫应答的免疫刺激性的、带正电荷的分子。这样的具有免疫增强性质的肽的实例是带正电荷的人工的抗微生物肽KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 2)，它在加强免疫接种后诱导有效的蛋白特异性2型驱动的适应性免疫。
[0027]任选的取代物，例如前述段落描述的那些任选的取代物，优选地与接近寡聚化结构域Dl的N-端末端的合适氨基酸连接或与在寡聚化结构域Dl的N-端末端被取代的额外肽连接。肽纳米粒自装配后，这样的取代物然后会呈现在SAPN的表面。
[0028]在最优选的实施方案中，取代物是另一个肽序列SI，它代表肽链Dl-L-D 2 -P在Dl的N-端末端的简单延伸，产生组合的单个肽序列，其可在重组蛋白表达系统中表达为单一分子。
[0029]肽寡聚化结构域是通过疏水的、亲水的或离子相互作用、尤其是氢键而缔合或聚集，从而具有形成寡聚体的倾向的肽。例如，肽二聚化结构域D是在溶液中、通常在生理条件下形成二聚体D2的肽。在溶液中，肽三聚化结构域D形成三聚体D3,四聚化结构域D形成四聚体D4，五聚化结构域D形成五聚体D5。形成寡聚体的倾向是指，这样的肽可取决于条件而形成寡聚体，例如在变性条件下，它们是单体，而在生理条件下，它们可以形成相应的寡聚体。在预定的条件下，它们采取一种单一的寡聚化状态，这是纳米粒形成所必需的。然而，它们的寡聚化状态可以随条件变化而变化，例如在增加盐浓度后，从二聚体变成三聚体(Burkhard P.等人.，Protein Science 2000, 9:2294-2301),或在降低 pH 后，从五聚体变成单体。
[0030]肽寡聚化结构域是众所周知的(Burkhard P.等人., Trends Cell B1l 2001,11:82-88)。在本发明中，寡聚化结构域Dl和D2是卷曲螺旋结构域。卷曲螺旋是肽序列，其具有间隔3和4个残基的主要疏水性残基的连续模式，通常在7个氨基酸(七肽(heptad)重复)或11个氨基酸^一肽(undecad)重复)的序列中，其装配(折叠)形成多聚体螺旋束。也涵盖具有包含3和4个间隔残基的某些不规则分布的序列的卷曲螺旋。疏水性残基尤其是疏水性氨基酸Val、lie、Leu、Met、Tyr、Phe和Trp。主要疏水性是指至少50%的残基必须选自所提到的疏水性氨基酸。
[0031]例如，在优选的式⑴单体结构单元中，Dl和D2是下式中任一个的肽:
[aa (a) _aa (b) _aa (c) _aa (d) _aa (e) _aa (f) _aa (g) ]x (IIa),
【权利要求】
1.由多个式(I)结构单元的聚集体组成的自装配肽纳米粒，所述式(I)结构单元由包含肽寡聚化结构域Dl、接头区段L、肽寡聚化结构域D2、以及诺如病毒蛋白VPl的P结构域或P2亚结构域的连续链组成， Dl -L-D2 - P (I)， 其中Dl是形成m个亚单位Dl的寡聚体(Dl)ni的卷曲螺旋肽，D2是形成2个亚单位D2的二聚体(D2)2的卷曲螺旋肽，m是3或5，L是键或短接头区段，Dl或D2中的任一个或Dl和D2两者在寡聚化结构域中包含一个或更多个T细胞表位，且其中D2被代表诺如病毒VPl蛋白的P结构域或P2亚结构域的P取代。
2.权利要求1的肽纳米粒，其中取代物P是诺如病毒VPl蛋白的P结构域。
3.权利要求1的肽纳米粒，其中取代物P是诺如病毒VPl蛋白的P2亚结构域。
4.权利要求1-3中任一项的肽纳米粒，其中所述寡聚化结构域Dl是色氨酸拉链或其衍生物的五聚化结构域。
5.权利要求1-4中任一项的肽纳米粒，其中至少一个表位是HTL表位。
6.权利要求1-5中任一项的肽纳米粒，其中序列Dl- L - D2 - P包含一系列任选重叠的T细胞表位。
7.组合物，包含权利要求1-6中任一项的肽纳米粒。
8.接种人或非人动物的方法，其包括将有效量的权利要求1-7中任一项的肽纳米粒给予需要所述接种的受试者。
9.式(I)的单体结构单元，由包含肽寡聚化结构域D1、接头区段L、肽寡聚化结构域D2、以及诺如病毒蛋白VPl的P结构域或P2亚结构域的连续链组成， Dl -L-D2 - P (I)， 其中Dl是形成m个亚单位Dl的寡聚体(Dl)ni的卷曲螺旋肽，D2是形成2个亚单位D2的二聚体(D2)2的卷曲螺旋肽，m是3或5，L是键或短接头区段，Dl或D2中的任一个或Dl和D2两者在寡聚化结构域中包含一个或更多个T细胞表位，且其中D2被代表诺如病毒VPl蛋白的P结构域或P2亚结构域的P取代。
10.权利要求9的单体结构单元，其是SEQID NO:1的肽。
【文档编号】C07K14/08GK104136454SQ201280061311
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2012年10月5日 优先权日:2011年10月12日
【发明者】P.布克哈德, C.库兰加拉 申请人:阿尔法-O肽股份公司