赋予针对诺如病毒的保护性免疫应答的疫苗的制作方法
【专利说明】赋予针对诺如病毒的保护性免疫应答的疫苗
[0001] 本申请是申请日为2008年9月18日、中国申请号为200880116659. 6、发明名称为 "赋予针对诺如病毒的保护性免疫应答的疫苗"的发明申请的分案申请。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求2007年9月18日提交的美国临时申请No. 60/973, 389和2007年11 月9日提交的美国临时申请No. 60/986, 826的优先权，通过述及将它们完整收入本文。 发明领域
[0004] 本申请属于疫苗，特别是针对诺如病毒（norovirus)的疫苗的领域。另外，本发明 涉及制备疫苗组合物的方法和诱导保护性免疫应答的方法。
[0005] 关于政府支持的声明
[0006] 本发明是在来自美国陆军医学研宄和物资司令部的政府支持下产生的，合同号 W81XWH-05-C-0135。政府对本发明可具有某些权利。
[0007] 发明背景
[0008] 诺如病毒是不可培养的人类杯状病毒，已经成为非细菌性胃肠炎的流行性爆发的 单一最重要起因（Glass et al.，2000 ;Hardy et al.，1999)。在灵敏的分子诊断测定法的 开发之前，对诺如病毒的临床意义的重视不够。原型基因小组I(genogroup I)诺沃克病毒 (NV)基因组的克隆和自重组杆状病毒表达系统生成病毒样颗粒（VLP)引起了测定法的开 发，其揭示了分布广泛的诺如病毒感染（Jiang et al. 1990 ;1992)。
[0009] 诺如病毒是单链、正义RNA病毒，含有不分段的RNA基因组。病毒基因组编码三个 可读框，其中后两个分别规定主要衣壳蛋白和次要结构蛋白的生成（Glass et al. 2000)。 当在真核表达系统中以高水平表达时，NV和某些其它诺如病毒的衣壳蛋白自组装成在结构 上模拟天然诺如病毒病毒粒（virion)的VLP。当通过透射电子显微术观看时，VLP在形态 上与自人粪样品分离的感染性病毒粒不可区分。
[0010] 针对诺如病毒的免疫应答是复杂的，而且现在正在阐明保护的关联（correlate)。 用天然病毒实施的人志愿者研宄证明了粘膜衍生的记忆免疫应答提供免于感染的短期保 护并提不疫苗介导的保护是可行的（Lindesmith et al. 2003 ;Parrino et al. 1997 ;Wyatt et al. , 1974) 〇
[0011] 虽然由于VLP的可得性和它们以大量生成的能力，诺如病毒不能在体外培养，但 是在限定诺如病毒衣壳的抗原拓扑学和结构拓扑学方面已经取得了可观的进步。VLP保留 病毒衣壳蛋白的真实构象（authentic confirmation)，但是缺乏感染性遗传物质。结果， VLP模拟病毒与细胞受体的功能相互作用，由此引发适宜的宿主免疫应答，但是缺乏繁殖 或引起感染的能力。与NIH联合，Baylor College of Medicine在学术性的、调查人发起 的I期临床试验中研宄了人志愿者中针对NV VLP的体液、粘膜和细胞免疫应答。口服施 用VLP在健康成人中是安全的且有免疫原性的（Ball et al. 1999 Jacket et al. 2003)。 在其它学术中心，在动物模型中进行的临床前实验已经证明了当与细菌外毒素佐剂一 起鼻内施用时针对VLP的免疫应答的增强（Guerrero et al. 2001 ;Nicollier_Jamot etal.2004；Periwaletal.2003；Souzaetal. (2007)Vaccine,doi:10.1016/j.vaccine. 2007. 09. 040)。然而，没有研宄报告使用任何诺如病毒疫苗能够实现针对诺如 病毒的保护性免疫。
[0012] 发明概述
[0013] 本发明提供了在受试者（特别是人类受试者）中诱导针对诺如病毒感染的保护性 免疫的方法，包括施用包含至少一种诺如病毒抗原的疫苗。在一个实施方案中，所述抗原是 诺如病毒病毒样颗粒（VLP)。本发明的方法中所使用的疫苗可进一步包含一种或多种佐剂。 所述诺如病毒VLP可以选自基因小组I或基因小组II病毒或其混合物。在一个实施方案 中，所述疫苗以约0.01%至约80% (以重量计）的浓度包含诺如病毒VLP。在另一个实施 方案中，所述疫苗包含约I U g至约IOOmg每剂的诺如病毒VLP剂量。
[0014] 在一些实施方案中，所述疫苗进一步包含投递剂，其功能为增强抗原摄取、提供贮 存效应、延长抗原在投递部位的保留时间、或经由投递部位的细胞紧密连接的松弛来增强 免疫应答。所述投递剂可以是生物粘着剂，优选选自下组的粘膜粘着剂：硫酸皮肤素、软骨 素、果胶、粘蛋白、藻酸盐、聚丙烯酸的交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖、羟丙 基甲基纤维素、凝集素、菌毛/伞毛蛋白质、和羧甲基纤维素。优选的是，所述粘膜粘着剂是 多糖。最优选的是，所述粘膜粘着剂是壳聚糖或含有壳聚糖的混合物，诸如壳聚糖盐或壳聚 糖碱。
[0015] 在其它实施方案中，所述疫苗包含佐剂。所述佐剂可以选自下组：toll样受体 (TLR)激动剂、单磷酰基脂质A (MPL_?)、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、铝盐、细胞因 子、皂苷、胞壁酰二肽（MDP)衍生物、CpG寡聚物、革兰氏阴性细菌的脂多糖（LPS)、聚磷腈 (polyphosphazenes)、乳剂、病毒体、Cochleates、聚（丙交醋-共-乙交醋）（PLG)微粒、泊 洛沙姆颗粒、微粒、内毒素（例如细菌内毒素）和脂质体。优选的是，所述佐剂是toll样受 体（TLR)激动剂。更优选的是，所述佐剂是MPL?。
[0016] 本发明的方法包括施用配制成液体或干粉的诺如病毒疫苗。干粉配制剂可含 有直径约10至约500微米的平均粒度。适合于施用所述疫苗的路径包括粘膜、肌肉内、 静脉内、表皮下（subcutaneous)、真皮内（intradermal)、真皮下（subdermal)、或经皮 (transdermal)。具体而言，施用路径可以是肌肉内或粘膜，优选粘膜施用路径，包括鼻内、 口服、或阴道施用路径。在另一个实施方案中，所述疫苗配制成鼻腔喷雾、滴鼻剂、或干粉， 其中所述疫苗是通过鼻道内的快速沉积自靠近鼻通道的装有疫苗的装置施用的。在另一个 实施方案中，所述疫苗是施用至一个或两个鼻孔的。
[0017] 本发明涉及下述各项。
[0018] 1. 一种在人类中引发针对诺如病毒感染的保护性免疫的方法，包括对人施用包含 诺如病毒病毒样颗粒（VLP)和至少一种佐剂的疫苗。
[0019] 2.项1的方法，其中所述诺如病毒VLP选自下组：诺如病毒基因小组I和基因小 组II病毒株。
[0020] 3.项1的方法，其中所述诺如病毒VLP是单价VLP。
[0021] 4.项1的方法，其中所述诺如病毒VLP是多价VLP。
[0022] 5.项1的方法，其中所述疫苗包含第二种类型的诺如病毒VLP。
[0023] 6.项5的方法，其中所述第一种和第二种诺如病毒VLP是来自不同基因小组的单 价 VLP0
[0024] 7.项6的方法，其中所述第一种诺如病毒VLP是诺沃克病毒VLP且所述第二种诺 如病毒VLP是休斯顿病毒VLP。
[0025] 8.项1的方法，其中所述疫苗进一步包含投递剂。
[0026] 9.项8的方法，其中所述投递剂是生物粘着剂。
[0027] 10.项9的方法，其中所述生物粘着剂是粘膜粘着剂。
[0028] 11.项10的方法，其中所述粘膜粘着剂选自下组：硫酸皮肤素、软骨素、果胶、粘蛋 白、藻酸盐、聚丙烯酸的交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖、羟丙基甲基纤维素、 凝集素、菌毛/伞毛蛋白质、和羧甲基纤维素。
[0029] 12.项11的方法，其中所述粘膜粘着剂是多糖。
[0030] 13.项12的方法，其中所述多糖是壳聚糖、壳聚糖盐、或壳聚糖碱。
[0031] 14.项1的方法，其中所述佐剂选自下组：toll样受体（TLR)激动剂、单磷酰基脂 质A(MPL)、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、铝盐、细胞因子、皂苷、胞壁酰二肽（MDP)衍 生物、CpG寡聚物、革兰氏阴性细菌的脂多糖（LPS)、聚磷腈、乳剂、病毒体、CochleatesJ (丙交酯-共_乙交酯）（PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒、和脂质体。
[0032] 15.项14的方法，其中所述佐剂是toll样受体（TLR)激动剂。
[0033] 16.项14的方法，其中所述佐剂是MPL。
[0034] 17.项1的方法，其中所述佐剂不是毒素佐剂。
[0035] 18.项1的方法，其中所述疫苗在粉末配制剂中。
[0036] 19.项1的方法，其中所述疫苗在液体配制剂中。
[0037] 20.项1的方法，其中所述疫苗是通过选自下组的路径对人施用的：粘膜、鼻内、肌 肉内、静脉内、表皮下、真皮内、真皮下、和经皮施用路径。
[0038] 21.项20的方法，其中所述疫苗是鼻内施用的。
[0039] 22.项21的方法，其中所述疫苗是通过鼻道内的快速沉积自一种或多种靠近鼻通 道的包含疫苗的装置施用至鼻粘膜的。
[0040] 23.项22的方法，其中将所述疫苗施用至一个或两个鼻孔。
[0041] 24.项1的方法，其中所述诺如病毒VLP是以约0. 01% (w/w)至约80% (w/w)的 浓度存在的。
[0042] 25.项1的方法，其中所述诺如病毒VLP是以约I yg至约IOOmg每剂的量存在的。
[0043] 26.项25的