用于治疗冠状病毒感染的疫苗组合物的制作方法

专利名称：用于治疗冠状病毒感染的疫苗组合物的制作方法
技术领域：
本公开一般涉及冠状病毒抗原的疫苗组合物，更特别地，涉及包含一种或多种冠状病毒免疫原(包括S蛋白、N蛋白、M蛋白等等)和其变体的组合物，和此类组合物用于引起保护性免疫应答以治疗或预防冠状病毒感染的用途。
相关技术描述自从1979年以来，已经出现了30种新的人类病毒疾病，值得注意的是，多数病毒已经从动物传播到人类。最近的例子之一是最近爆发的严重急性呼吸器官综合症(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)。SARS是2002年11月在中华人民共和国的广东省突然出现的紧急疾病。在很短时间内，该疾病扩散到其他亚洲国家，然后快速连续扩散到北美和欧洲(WHO.Severe Acute Respiratory Syndrome(SARS).Wkly.Epidemiol，Rec.7881，2003)。在SARS最初出现的9个月内，报导了近8500个病例，死亡率为约10％。临床上，该疾病的特征是发热、呼吸困难、淋巴细胞减少和肺病变，表现为弥漫性肺泡损伤(Nicholls等人，Lancet 3611773，2003)。提出一些候选因素是该疾病的病因，但是研究最终确定为以前未知的冠状病毒(一种组2冠状病毒；SARS-CoV或SCV)，其单独或者与人类后肺病毒(metapneumovirus)一起被公认为是SARS的主要病因(Ksiazek等人，N.Engl J.Med.3481953，2003；Drosten等人，N.Engl.J.Med.3481967，2003；Kuiken等人，Lancet 362263，2003；Fouchier等人，Nature 423240，2003)。
冠状病毒是正链RNA病毒，其在动物和人类中引起疾病。冠状病毒感染可以是全身性的或者局部的。当是局部时，冠状病毒将仅感染一些细胞类型，如呼吸道或者肠道的上皮细胞，和巨噬细胞。
对于这种新的疾病，残留许多未解决的问题，甚至包括SARS的病原体的传播方式。从2003年的流行病可以收集一些线索(a)医院传播占在世界上不同的地点报导的病例的约20-60％；(b)卫生保健工作者占加拿大多伦多(Toronto)病例的约50％；和(c)传播在家庭内也是普遍的。该流行病学数据的含意是深奥的——例如，如果认为医院关闭是必要的，那么在美国多数医院将面临着财务崩溃(估计仅仅关闭两周将导致多数医院面临破产)，而在卫生保健工作者群体中高速感染将使得卫生保健工作者资源达到极限并且将对于员工造成重大牺牲。在2003年流行病期间，全部员工都被送到家中，并且工厂、公司、办公室和其他商业都暂时关闭。此外，认为是SARS热点的区域都被避开，会议被取消，并且旅游业遭受损失。从而，将来的流行将具有深远的经济反响。
SARS病毒的传播的主要危险显然是通过飞沫暴露和密切的人身接触；因此，减小SARS病毒的传播的策略将类似或者模拟用于限制其他呼吸道感染的策略，即，减小直接接触和使用屏障预防措施防止暴露于飞沫。然而，因为潜伏期持续2-10天，并且非特异性最初症状类似于其他呼吸道感染，如流感，所以SARS扩散的最大危险是未监测到的病例。
从而，需要备选的预防策略或者疗法来治疗或者预防冠状病毒感染，如在人类中发现的感染(例如，导致SARS的感染)。例如，需要鉴定和开发针对冠状病毒感染的疫苗组合物，其引起保护性免疫应答。此外，需要可以直接递送到感染部位或者紧密接近感染部位以最大化治疗有效性的疫苗制剂。本发明满足了此类需要并且还提供了其他有关的优点。
发明简述简言之，本发明涉及用于治疗或者预防冠状病毒感染，如SARS冠状病毒感染的组合物和方法。所述组合物包含，例如，本文描述的冠状病毒S蛋白免疫原和佐剂如蛋白体或者ProtollinTM，它们能够在受试者或者宿主中引起保护性免疫应答。在一个实施方案中，本发明提供了治疗或者预防冠状病毒感染的方法，其包括对需要其的受试者施用一种组合物，其组合物包含(a)佐剂；(b)药学上可接受的赋形剂；和(c)至少一种冠状病毒S蛋白免疫原，该免疫原包含SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、或SEQID NO18中给出的氨基酸序列，其中所述至少一种S蛋白免疫原能够引起针对冠状病毒的保护性免疫应答。在一些实施方案中，所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原与SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ IDNO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、或SEQ ID NO18中给出的氨基酸序列具有至少90％同一性或者至少80％同一性。在特定实施方案中，所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原还包含疏水部分，在一些具体实施方案中，疏水部分是疏水多肽或者脂类。在另一实施方案中，赋形剂是脂质体。在其他具体实施方案中，佐剂是明矾、弗氏佐剂、蛋白体，或者Protollin。在一个实施方案中，施用至少两种S蛋白免疫原。在另一实施方案中，至少一种冠状病毒S蛋白免疫原被连接到第二种氨基酸序列，并且在一些实施方案中，至少一种冠状病毒S蛋白免疫原融合第二种氨基酸序列以形成融合蛋白。在一个实施方案中，所述第二种氨基酸序列是标记或者酶。在一个实施方案中，所述标记是组氨酸标记。在一些实施方案中，所述冠状病毒感染由选自组1冠状病毒、组2冠状病毒、组3冠状病毒、和SARS组冠状病毒的至少一种或至少两种冠状病毒引起。在一个具体实施方案中，冠状病毒感染由人类冠状病毒引起，其中人类冠状病毒是SARS-CoV。在其他实施方案中，通过选自经肠、肠胃外、经皮、经粘膜、经鼻和吸入的途径施用组合物，在一个具体实施方案中，经鼻施用组合物。在本发明的一个实施方案中，所引起的免疫应答包含特异结合至少一种冠状病毒S蛋白免疫原的至少一种抗体。
本发明还提供了组合物，其包含(a)至少一种冠状病毒S蛋白免疫原，其包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ IDNO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24或SEQ ID NO26中给出的氨基酸序列；和(b)蛋白体或者Protollin，其中所述S蛋白免疫原能够引起保护性免疫应答。在一个实施方案中，所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原包含SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中给出的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原与SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQID NO16、或SEQ ID NO18中给出的氨基酸序列具有至少90％同一性或者至少80％同一性。在特定实施方案中，所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原还包含疏水部分，在一些具体实施方案中，疏水部分是疏水多肽或者脂类。在一个实施方案中，施用至少两种S蛋白免疫原。在另一实施方案中，至少一种冠状病毒S蛋白免疫原连接到第二种氨基酸序列，并且在一些实施方案中，所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原融合第二种氨基酸序列以形成融合蛋白。在一个实施方案中，所述第二种氨基酸序列是标记或者酶。在一个实施方案中，所述标记是组氨酸标记。在一个实施方案中，组合物还包含药学上可接受的赋形剂。在另一实施方案中，所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原融合到至少一种第二种S蛋白免疫原的框内从而形成融合蛋白，该第二种S蛋白免疫原包含选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO1 2、SEQ ID NO14、SEQID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24和SEQ ID NO26中给出的氨基酸序列的氨基酸序列。
在另一实施方案中，提供了组合物，其包含(a)蛋白体或者Protollin；和(b)多价融合冠状病毒免疫原多肽。在再一个实施方案中，提供了用于治疗或者预防冠状病毒感染的方法，其包括对需要其的受试者施用包含蛋白体或者Protollin和多价融合冠状病毒免疫原多肽的组合物。
本文还提供了用于治疗或者预防冠状病毒感染的方法，其包含组合物，该组合物包含(a)至少一种冠状病毒S蛋白免疫原，其包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ IDNO22、SEQ ID NO24或SEQ ID NO26中给出的氨基酸序列；和(b)蛋白体或者Protollin，其中所述S蛋白免疫原能够引起保护性免疫应答。在一个实施方案中，所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原包含SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中给出的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原与SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、或SEQ ID NO18中给出的氨基酸序列具有至少90％同一性或者至少80％同一性。在特定实施方案中，所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原还包含疏水部分，在一些具体实施方案中，疏水部分是疏水多肽或者脂类。在一个实施方案中，施用至少两种S蛋白免疫原。在另一实施方案中，至少一种冠状病毒S蛋白免疫原被连接到第二种氨基酸序列，并且在一些实施方案中，所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原融合第二种氨基酸序列以形成融合蛋白。在一个实施方案中，所述第二种氨基酸序列是标记或者酶。在一个实施方案中，所述标记是组氨酸标记。在一个实施方案中，组合物还包含药学上可接受的赋形剂。在另一实施方案中，所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原融合到至少一种第二种S蛋白免疫原的框内从而形成融合蛋白，该第二种S蛋白免疫原包含选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ IDNO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24和SEQ ID NO26中给出的氨基酸序列的氨基酸序列。在具体实施方案中，提供了治疗或者预防冠状病毒感染的方法，其中所述组合物包含Protollin和至少一种冠状病毒S蛋白免疫原，该免疫原包含SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中给出的氨基酸序列。
在另一实施方案中，本发明还提供了组合物，其包含(a)至少一种冠状病毒S蛋白免疫原，其包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24或SEQ ID NO26中给出的氨基酸序列；和(b)蛋白体或者Protollin，其中所述S蛋白免疫原能够引起保护性免疫应答。在一个具体实施方案中，所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原包含与SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24或SEQ ID NO26中给出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述S蛋白免疫原能够引起保护性免疫应答。在某些其他实施方案中，所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原包含与SEQID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24或SEQ ID NO26中给出的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，所述S蛋白免疫原能够引起保护性免疫应答(即，具有至少一个引起或者能够引起保护性免疫应答的表位)。在特定实施方案中，所述冠状病毒S蛋白免疫原包含与SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ IDNO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16或SEQ ID NO18中给出的氨基酸序列相同、具有90％同一性或者80％同一性的氨基酸序列，其中所述S蛋白免疫原能够引起保护性免疫应答。在其他具体实施方案中，所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原包含SEQ ID NO2或SEQ IDNO4中给出的氨基酸序列、与SEQ ID NO2或4有至少90％同一性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO2或4有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述S蛋白免疫原能够引起保护性免疫应答。在具体实施方案中，所述组合物包含(1)蛋白体或者Protollin和(2)至少一种冠状病毒S蛋白免疫原，其中所述S蛋白免疫原包含SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中给出的氨基酸序列。在具体实施方案中，所述S蛋白免疫原还包含疏水部分，在其他具体实施方案中，疏水部分是疏水多肽或者脂类。在其他实施方案中，至少一种S蛋白免疫原被连接到第二种氨基酸序列，并且在一个具体实施方案中，所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原融合第二种氨基酸序列以形成融合蛋白。在一些实施方案中，所述第二种氨基酸序列是标记或者酶，在特定实施方案中，第二种氨基酸序列是组氨酸标记。本发明还提供了前述组合物，其还包含至少一种冠状病毒N蛋白免疫原，其中所述N蛋白免疫原包含选自SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ IDNO34、SEQ ID NO36、和SEQ ID NO38的氨基酸序列。在另一实施方案中，前述组合物还包含至少一种M蛋白免疫原，其中所述至少一种M蛋白免疫原能够引起免疫应答。在特定实施方案中，所述M蛋白免疫原包含GenBank检索号AAU07933中给出的序列(SEQ ID NO39)。
在其他实施方案中，提供了包含蛋白体或者Protollin和至少一种S蛋白免疫原(如本文描述的)的组合物，其中所述至少一种S蛋白免疫原融合到至少一种第二种S蛋白免疫原的框内以形成融合蛋白，所述第二种S蛋白免疫原包含选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ IDNO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、和SEQ IDNO26中给出的氨基酸序列的氨基酸序列。在再一个实施方案中，所述至少一种S蛋白免疫原融合到冠状病毒N蛋白免疫原的框内，所述N蛋白免疫原包含选自SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36和SEQ ID NO38中给出的氨基酸序列的氨基酸序列。
本发明还提供了组合物，其包含(a)至少一种N蛋白免疫原，该N蛋白免疫原包含选自SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ IDNO34、SEQ ID NO36或SEQ ID NO38中给出的氨基酸序列；和(b)蛋白体或者Protollin，其中所述N蛋白免疫原能够引起保护性免疫应答。在一些实施方案中，所述N蛋白免疫原包含与选自SEQ ID NO28、SEQ IDNO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36和SEQ ID NO38中给出的氨基酸序列的氨基酸序列有至少90％同一性的氨基酸，在一些其他实施方案中，所述N蛋白免疫原包含与选自SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36和SEQ ID NO38中给出的氨基酸序列的氨基酸序列有至少80％同一性的氨基酸。在一些实施方案中，所述N蛋白免疫原还包含疏水部分，在其他实施方案中，疏水部分是疏水多肽或者脂类。
在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其包含(a)蛋白体或者Protollin；和(b)多价融合冠状病毒免疫原多肽。在一些实施方案中，该多价融合冠状病毒免疫原包含至少两个S蛋白免疫原或者其片段。在一些实施方案中，该多价融合冠状病毒免疫原包含至少两个S蛋白免疫原，该S蛋白免疫原选自包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ IDNO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、或SEQ IDNO26中给出的氨基酸序列的S蛋白免疫原。在一些其他实施方案中，所述多价融合冠状病毒免疫原包含至少一个包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQID NO24、或SEQ ID NO26中给出的氨基酸序列的S蛋白免疫原和至少一个包含SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36或SEQ ID NO38中给出的氨基酸序列的冠状病毒N蛋白免疫原。
在特定实施方案中，本文描述的任一种组合物(包括上面描述的那些)还包含药学上可接受的赋形剂。在其他特定实施方案中，本文提供了本文描述的任一种组合物(包括上面描述的那些)，其用于治疗或预防冠状病毒感染。本文还提供了本文描述的任一种组合物(包括上面描述的那些)用于生产治疗或预防冠状病毒感染的药物的用途。在具体实施方案中，所述冠状病毒感染由组1冠状病毒、组2冠状病毒、组3冠状病毒、和SARS组冠状病毒的至少一种引起，在其他实施方案中，冠状病毒感染由组1、组2、组3和SARS组冠状病毒的至少两种引起。在特定实施方案中，冠状病毒感染由人类冠状病毒引起，在其他具体实施方案中，人类冠状病毒是SARS-CoV。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗或预防冠状病毒感染的方法，其包括对需要其的受试者施用任一种本文描述的组合物。在具体实施方案中，治疗或预防冠状病毒感染的方法包括需要其的受试者施用一种组合物，该组合物包含(a)蛋白体或者Protollin；(b)至少一种冠状病毒S蛋白免疫原，其包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ IDNO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24或SEQ ID NO26中给出的氨基酸序列；和(c)至少一种N蛋白免疫原，该N蛋白免疫原包含选自SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36或SEQ ID NO38中给出的氨基酸序列。在具体实施方案中，所述至少一种冠状病毒N蛋白免疫原与SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36或SEQ ID NO38中给出的氨基酸序列具有至少90％同一性，在另一具体实施方案中，所述至少一种冠状病毒N蛋白免疫原与SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36或SEQ ID NO38中给出的氨基酸序列具有至少80％同一性。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗或预防冠状病毒感染的方法，其包括对需要其的受试者施用一种组合物，该组合物包含(a)蛋白体或者Protollin；(b)至少一种冠状病毒S蛋白免疫原，其包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ IDNO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24或SEQ ID NO26中给出的氨基酸序列。在具体实施方案中，所述S蛋白免疫原包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16或SEQ ID NO18中给出的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述方法包括一种冠状病毒S蛋白免疫原，其中该S蛋白免疫原与SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ IDNO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24或SEQ ID NO26中给出的氨基酸序列具有至少90％同一性。在另一实施方案中，所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原与SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24或SEQ ID NO26中给出的氨基酸序列具有至少80％同一性。在另一具体实施方案中，所述S蛋白免疫原包含SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中给出的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中给出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中给出的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述S蛋白免疫原能够引起保护性免疫应答。在一些实施方案中，所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原还包含疏水部分，其中疏水部分是疏水多肽或者脂类。在其他实施方案中，其中该方法包括施用至少一种S蛋白免疫原和至少一种N蛋白免疫原，所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原还包含疏水部分，或者所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原还包含疏水部分，或者所述至少一种N蛋白免疫原和所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原包含疏水部分，其中该疏水部分是疏水多肽或者脂类。在这些方法的其他实施方案中，组合物还包含至少一种M蛋白免疫原，其中该M蛋白免疫原能够引起免疫应答。在特定实施方案中，M蛋白免疫原包含GenBank检索号AAU07933中给出的序列(SEQ ID NO39)。在一些其他实施方案中，所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原被连接到第二种氨基酸序列，在特定实施方案中，S蛋白免疫原融合到第二种氨基酸序列以形成融合蛋白。在特定实施方案中，所述第二种氨基酸序列是标记或者酶，在其他特定实施方案中，所述标记是组氨酸标记。在其他具体实施方案中，其中该方法包括至少一种N蛋白免疫原，该至少一种冠状病毒N蛋白免疫原被连接到第二种氨基酸序列，在特定实施方案中，N蛋白免疫原融合到第二种氨基酸序列以形成融合蛋白。在特定实施方案中，所述第二种氨基酸序列是标记或者酶，在其他特定实施方案中，所述标记是组氨酸标记。在另一实施方案中，所述冠状病毒感染由组1冠状病毒、组2冠状病毒、组3冠状病毒、和SARS组冠状病毒的至少一种引起，在其他实施方案中，冠状病毒感染由组1、组2、组3、和SARS组冠状病毒的至少两种引起。在特定实施方案中，组1冠状病毒、组2冠状病毒、组3冠状病毒、和SARS组冠状病毒的至少一种引起由人类冠状病毒引起，在另一特定实施方案中，人类冠状病毒是SARS-CoV。在该方法的一些实施方案中，通过选自经肠、肠胃外、经皮、经粘膜、经鼻和吸入的途径施用组合物。在一个具体实施方案中，经鼻施用组合物。在具体实施方案中，所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原包含SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中给出的氨基酸序列。在另一具体实施方案中，本发明提供了治疗或预防冠状病毒感染的方法，其包括对需要其的受试者施用包含Protollin和至少一种冠状病毒S蛋白免疫原的组合物，其中所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原包含SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中给出的氨基酸序列。
本发明提供了还治疗或预防冠状病毒感染的方法，其包括对需要其的受试者施用包含药学上可接受的赋形剂和至少一种冠状病毒S蛋白免疫原的组合物，所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原包含SEQ ID NO4、SEQID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16或SEQ ID NO18中给出的氨基酸序列，其中所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原能够引起针对冠状病毒的保护性免疫应答。在一些实施方案中，所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原与SEQ ID NO4、SEQID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16或SEQ ID NO18中给出的氨基酸序列有至少90％同一性，在一些其他实施方案中，所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原与SEQID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16或SEQ ID NO18中给出的氨基酸序列有至少80％同一性。在具体实施方案中，所述冠状病毒S蛋白免疫原还包含疏水部分，在其他具体实施方案中，该疏水部分是疏水多肽或者脂类。在另一实施方案中，组合物还包含佐剂，在一个具体实施方案中，佐剂是明矾、弗氏佐剂、蛋白体，或者Protollin。在另一实施方案中，组合物还包含至少一种M蛋白免疫原，其中该M蛋白免疫原能够引起免疫应答，在具体实施方案中，M蛋白免疫原包含GenBank检索号AAU07933中给出的氨基酸序列。在一些实施方案中，该方法包括施用至少两种S蛋白免疫原。在另一实施方案中，至少一种冠状病毒S蛋白免疫原被连接到第二种氨基酸序列，并且在另一具体实施方案中，所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原融合第二种氨基酸序列以形成融合蛋白。在一个实施方案中，所述第二种氨基酸序列是标记或者酶，在一个具体实施方案中，所述标记是组氨酸标记。在具体实施方案中，所述冠状病毒感染由选自组1冠状病毒、组2冠状病毒、组3冠状病毒、或者SARS组冠状病毒引起。在其他实施方案中，冠状病毒感染由组1、组2、组3和SARS组冠状病毒的至少两种引起。在特定实施方案中，冠状病毒感染由人类冠状病毒引起，在另一特定实施方案中，人类冠状病毒是SARS-CoV。在再一个实施方案中，通过选自经肠、肠胃外、经皮、经粘膜、经鼻和吸入的途径施用组合物。在一个具体实施方案中，经鼻施用组合物。在具体实施方案中，免疫应答包含引起特异结合所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原的至少一种抗体。
在再一个实施方案中，本发明提供了治疗或预防冠状病毒感染的方法，其包括对需要其的受试者施用组合物，该组合物包含(a)药学上可接受的赋形剂；(b)至少一种冠状病毒S蛋白免疫原；和(c)至少一种冠状病毒N蛋白免疫原，所述至少一种S蛋白免疫原选自SEQ ID NO4、SEQ IDNO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQID NO14、SEQ ID NO16和SEQ ID NO18中给出的氨基酸序列，并且其中所述至少一种N蛋白免疫原选自SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36或SEQ ID NO38中给出的氨基酸序列，其中所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原和至少一种冠状病毒N蛋白免疫原能够引起针对冠状病毒的保护性免疫应答。在一些实施方案中，所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原与SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16和SEQID NO18中给出的氨基酸序列具有至少90％同一性，在其他实施方案中，所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原与SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16和SEQ ID NO18中给出的氨基酸序列具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述至少一种冠状病毒N蛋白免疫原与SEQ ID NO30、SEQID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36或SEQ ID NO38中给出的氨基酸序列具有至少90％同一性，在一些其他实施方案中，所述至少一种冠状病毒N蛋白免疫原与SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36或SEQ ID NO38中给出的氨基酸序列具有至少80％同一性。在具体实施方案中，所述冠状病毒S蛋白免疫原还包含疏水部分，在其他具体实施方案中，该疏水部分是疏水多肽或者脂类。在具体实施方案中，所述冠状病毒N蛋白免疫原还包含疏水部分，在其他具体实施方案中，该疏水部分是疏水多肽或者脂类。在另一实施方案中，组合物还包含佐剂，在一个具体实施方案中，佐剂是明矾、弗氏佐剂、蛋白体，或者Protollin。在另一实施方案中，组合物还包含至少一种M蛋白免疫原，其中该M蛋白免疫原能够引起免疫应答，在具体实施方案中，M蛋白免疫原包含GenBank检索号AAU07933中给出的氨基酸序列。在一些实施方案中，该方法包括施用至少两种S蛋白免疫原。在另一实施方案中，至少一种冠状病毒S蛋白免疫原被连接到第二种氨基酸序列，并且在另一具体实施方案中，所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原融合第二种氨基酸序列以形成融合蛋白。在一个实施方案中，所述第二种氨基酸序列是标记或者酶，在一个具体实施方案中，所述标记是组氨酸标记。在一些实施方案中，该方法包括施用至少两种N蛋白免疫原。在另一实施方案中，至少一种冠状病毒N蛋白免疫原被连接到第二种氨基酸序列，并且在另一具体实施方案中，所述至少一种冠状病毒N蛋白免疫原融合第二种氨基酸序列以形成融合蛋白。在一个实施方案中，所述第二种氨基酸序列是标记或者酶，在一个具体实施方案中，所述标记是组氨酸标记。在具体实施方案中，所述冠状病毒感染由选自组1冠状病毒、组2冠状病毒、组3冠状病毒、或者SARS组冠状病毒引起。在其他实施方案中，冠状病毒感染由组1、组2、组3和SARS组冠状病毒的至少两种引起。在特定实施方案中，冠状病毒感染由人类冠状病毒引起，在另一特定实施方案中，人类冠状病毒是SARS-CoV。在再一个实施方案中，通过选自经肠、肠胃外、经皮、经粘膜、经鼻和吸入的途径施用组合物。在一个具体实施方案中，经鼻施用组合物。在具体实施方案中，免疫应答包含引起特异结合至少一种冠状病毒S蛋白免疫原的至少一种抗体，在其他具体实施方案中，免疫应答包含引起特异结合至少一种冠状病毒N蛋白免疫原的至少一种抗体。
在另一实施方案中，提供了治疗或预防冠状病毒感染的方法，其包括对需要其的受试者施用组合物，该组合物包含药学上可接受的赋形剂和至少一种冠状病毒N蛋白免疫原，该免疫原包含SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO.36或SEQ ID NO38中给出的氨基酸序列，其中所述至少一种冠状病毒N蛋白免疫原能够引起针对冠状病毒的保护性免疫应答。在一些实施方案中，所述至少一种冠状病毒N蛋白免疫原与SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36或SEQ ID NO38中给出的氨基酸序列具有至少90％同一性，在一些其他实施方案中，所述至少一种冠状病毒N蛋白免疫原与SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQID NO34、SEQ ID NO36或SEQ ID NO38中给出的氨基酸序列具有至少80％同一性。在具体实施方案中，所述冠状病毒N蛋白免疫原还包含疏水部分，在其他具体实施方案中，该疏水部分是疏水多肽或者脂类。在具体实施方案中，所述冠状病毒N蛋白免疫原还包含疏水部分，在其他具体实施方案中，该疏水部分是疏水多肽或者脂类。在具体实施方案中，赋形剂是脂质体。在另一实施方案中，组合物还包含佐剂，在一个具体实施方案中，佐剂是明矾、弗氏佐剂、蛋白体，或者Protollin。在另一实施方案中，组合物还包含至少一种M蛋白免疫原，其中该M蛋白免疫原能够引起免疫应答，在具体实施方案中，M蛋白免疫原包含GenBank检索号AAU07933中给出的氨基酸序列。在一些实施方案中，该方法包括施用至少两种N蛋白免疫原。在另一实施方案中，至少一种冠状病毒N蛋白免疫原被连接到第二种氨基酸序列，并且在另一具体实施方案中，所述至少一种冠状病毒N蛋白免疫原融合第二种氨基酸序列以形成融合蛋白。在一个实施方案中，所述第二种氨基酸序列是标记或者酶，在一个具体实施方案中，所述标记是组氨酸标记。在具体实施方案中，所述冠状病毒感染由组1冠状病毒、组2冠状病毒、组3冠状病毒、或者SARS组冠状病毒引起。在其他实施方案中，冠状病毒感染由组1、组2、组3和SARS组冠状病毒的至少两种引起。在特定实施方案中，人类冠状病毒感染由人类冠状病毒引起，在另一特定实施方案中，人类冠状病毒是SARS-CoV。在再一个实施方案中，通过选自经肠、肠胃外、经皮、经粘膜、经鼻和吸入的途径施用组合物。在一个具体实施方案中，经鼻施用组合物。在具体实施方案中，免疫应答包括引起特异结合至少一种冠状病毒N蛋白免疫原的至少一种抗体。
本发明还提供了通过一种方法产生的许多分离的抗体，所述方法包括对受试者施用组合物，该组合物包含药学上可接受的赋形剂和至少一种冠状病毒S蛋白免疫原，该免疫原包含SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ IDNO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16或SEQ ID NO18中给出的氨基酸序列，其中所述至少一种S蛋白免疫原能够引起针对冠状病毒的保护性免疫应答。在另一实施方案中，本发明还提供了通过一种方法产生的许多分离的抗体，所述方法包括对受试者施用组合物，该组合物包含(a)药学上可接受的赋形剂；(b)至少一种冠状病毒S蛋白免疫原；和(c)至少一种冠状病毒N蛋白免疫原，其中所述至少一种S蛋白免疫原选自SEQ ID NO4 SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16和SEQ IDNO18中给出的氨基酸序列，并且其中所述至少一种N蛋白免疫原选自SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36或SEQ ID NO38中给出的氨基酸序列，其中所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原和至少一种冠状病毒N蛋白免疫原能够引起冠状病毒的保护性免疫应答。在再一实施方案中，本发明还提供了通过一种方法产生的许多分离的抗体，所述方法包括对受试者施用组合物，该组合物包含药学上可接受的赋形剂和至少一种冠状病毒N蛋白免疫原，该免疫原包含SEQID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36或SEQ ID NO38中给出的氨基酸序列，其中所述至少一种N蛋白免疫原能够引起针对冠状病毒的保护性免疫应答。
在另一实施方案中，提供了组合物，其包含(a)特异结合至少一种冠状病毒S多肽的至少一种分离的抗体或者其抗原结合片段，所述S多肽包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24或SEQ ID NO26中给出的氨基酸序列；和(b)特异结合至少一种冠状病毒N多肽的至少一种分离的抗体或者其抗原结合片段，所述N多肽包含SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36或SEQ ID NO38中给出的氨基酸序列，其中该组合物抑制冠状病毒感染。在具体实施方案中，该组合物还包含药学上可接受的赋形剂。在另一实施方案中，提供了治疗或预防冠状病毒感染的方法，其包括对需要其的受试者施用组合物，该组合物包含(a)特异结合至少一种冠状病毒S多肽的至少一种分离的抗体或者其抗原结合片段，所述S多肽包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ IDNO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24或SEQ ID NO26中给出的氨基酸序列；和(b)特异结合至少一种冠状病毒N多肽的至少一种分离的抗体或者其抗原结合片段，所述N多肽包含SEQID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36或SEQ ID NO38中给出的氨基酸序列。
当参考下面的详细描述和附图时，本发明的这些和其他实施方案将变得显而易见。此外，本申请中提到的和/或申请数据单中列出的所有美国专利、美国专利申请公布、外国专利申请公布和非专利出版物都完整引入本文作为参考。
附图简述

图1显示了全长S蛋白(STM)和S蛋白变体(STM-del)的示意图。示意图的上方显示了对应于S蛋白的前面、中间和后面部分的核苷酸序列。有阴影线的方框代表跨膜(TM)结构域。
图2显示了仅仅施用不同量的STM-del蛋白质(STM-del蛋白质i.n.)或者用ProtollinTM(STM-del蛋白质+ProtollinTMi.n.)作为佐剂施用的小鼠中血清(IgG)剂量反应。
图3A图解了用ProtollinTM作为佐剂的STM-del蛋白质或者仅STM-del蛋白质鼻内免疫的小鼠中，和用明矾作为佐剂的STM-del蛋白质肌内免疫的小鼠中，和仅仅接受PBS的小鼠中血清IgG的效价。图3B显示了来自用Protollin作为佐剂的STM-del蛋白质或者仅STM-del蛋白质鼻内(i.n.)免疫的小鼠或者在用明矾作为佐剂的STM-del蛋白质肌内免疫的小鼠中，和仅仅接受PBS的小鼠中肺IgA的效价。
图4A-4F代表来自SARS冠状病毒株Tor2的S蛋白的核苷酸序列(SEQID NO1)和氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
图5A-5B代表来自SARS冠状病毒株Urbani的N蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO27)和氨基酸序列(SEQ ID NO28)。
图6图解了鼻内接受10μg SARS S-蛋白(全长)或者STM-del蛋白质(跨膜缺失的(ΔTM缺失的))组合不同浓度的ProtollinTM的小鼠(麻醉(用)或者非麻醉的(不用))的血清IgG效价。额外组的小鼠接受肌内注射10μg吸附到Alhydrogel(F.L.i.m.)的SARS S-蛋白或者10μg STM-del蛋白质(Del i.m.)。
图7给出了来自如图6的简述中描述的经免疫的小鼠的肺灌洗液和鼻洗涤液中的IgA效价。
图8图解了来自用全长S蛋白和Protollin(S(FL)+ProtollinTM)；全长S蛋白和Alhydrogel(S(FL)+明矾)；和仅PBS免疫的小鼠的体外再刺激的脾细胞的细胞因子的释放。
发明详述如上面阐明的，本文描述了包含至少一种冠状病毒S蛋白免疫原、至少一种N蛋白免疫原、或至少一种S蛋白免疫原和至少一种N蛋白免疫原，其片段或者变体的组合物，所述组合物能够引起提供保护使抵抗冠状病毒引起的感染的免疫应答。本文还描述了制备和使用这些S和N蛋白免疫原以治疗或预防冠状病毒感染的方法。本发明的冠状病毒免疫原(抗原)包含至少一种冠状病毒编码的多肽，如冠状病毒S蛋白免疫原或者N蛋白免疫原，或者其变体或者片段，它们能够引起免疫应答，该免疫应答包括中和性抗体应答和/或细胞介导的免疫。冠状病毒抗原(免疫原)可以包含一种或多种重组或合成产生的冠状病毒多肽或者可以包含从冠状病毒颗粒或者从冠状病毒感染的宿主细胞分离的一种或多种冠状病毒多肽。下面更详细地讨论了冠状病毒S和N蛋白免疫原，其片段、衍生物和变体，以及代表性组合物和治疗用途。
在一些实施方案中，提供了添加佐剂的冠状病毒S或者N蛋白免疫原，其片段、衍生物或变体。例如，冠状病毒S或者N蛋白免疫原可以与蛋白体或者ProtollinTM组合或者混合。蛋白体(也称作Projuvant)组合或混合物包含从革兰氏阴性细菌得到的外膜蛋白。备选地，蛋白体可以与内源或者外源脂糖类(即，OMP:LPS，也称作Protollin)结合。因此，这些免疫原性组合物(疫苗组合物或制剂)相比其他更常见的添加佐剂的疫苗具有优点，因为基于蛋白体技术的佐剂当“装载”一种或多种目的免疫原(或者抗原)(如冠状病毒S或者N蛋白免疫原，和其片段、衍生物或者变体，或者其他免疫原)时，能够帮助引起先天性免疫应答、增强的血清学和粘膜应答，和特异性免疫应答。
本文所用的“蛋白体”或者“Projuvant”指从革兰氏阴性细菌如奈瑟菌属(Neisseria)物种制备的外膜蛋白(OMP，也称作孔蛋白)的制剂(见例如，Lowell等人，J.Exp.Med.167658，1988；Lowell等人，Science240800，1988；Lynch等人，Biophys.J.45104，1984；Lowell，in″NewGeneration Vaccines″第二版，Marcel Dekker，Inc.，New York，Basil，Hong Kong，193页，1997；美国专利号5,726,292；美国专利号4,707,543)，它们用作载体或者免疫原(如细菌或病毒抗原)的佐剂。蛋白体是疏水的并且是人用安全的，并且在大小上与某些病毒相当。蛋白体能够自动装配成约20nm到约800nm的小泡或者小泡样OMP簇，并且非共价地掺入、配位、结合(例如，静电或者疏水地)，或者与蛋白质抗原(Ags)协作，尤其与具有疏水部分的抗原协作。在蛋白体的定义中包括导致形成小泡或者小泡样形式的外膜蛋白质组分，包括多分子膜结构或者一种或多种OMP的熔化的球形OMP组分的方法。例如，可以如本领域描述的制备蛋白体(见，例如，美国专利号5,726,292或5,985,284)。根据本文提供的方法制备的蛋白体可以还含有来自用于产生OMP孔蛋白的细菌(例如，奈瑟氏菌)的内源脂多糖或者脂寡糖(分别为LPS或者LOS)，它们通常小于总OMP制剂的2％。
本文所用的“脂糖(liposaccharide)”指来自革兰氏阴性细菌的天然的(分离的或者合成制备的，具有天然结构)或者修饰的脂多糖或者脂寡糖(总称作“LPS”)，如弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)或者类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)，或者其他革兰氏阴性细菌(包括产碱杆菌属(Alcaligenes)、拟杆菌属(Bacteroides)、博德特氏菌(Bordetella)、Borrellia、布鲁氏菌属(Brucella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、衣原体属(Chlamydia)、柠檬酸杆菌属(Citrobactr)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、Ehrlicha、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、弗朗西丝氏菌属(Franciseila)、梭杆菌属(Fusobacterium)、加德纳氏菌属(Gardnerella)、嗜血杆菌属(Hemophilus)、螺杆菌属(Helicobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、军团菌属(Legionella)、钩端螺旋体属(Leptospira)(包括Leptospirainterrogans))、莫拉氏菌属(Moraxella)、摩根氏菌属(Morganella)、奈瑟氏菌属(Neiserria)、巴斯德菌属(Pasteurella)、变形菌属(Proteus)、普罗威登斯菌属(Providencia)、其他邻单胞菌属(Plesiomonas)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)(包括牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis))、普雷沃氏菌属(Prevotella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、立克次体(Rickettsia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、其他志贺氏菌属(Shigella)、螺菌属(Spirillum)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、弧菌属(Vibrio)、或耶尔森菌属(Yersinia)物种。脂多糖可以是去毒的形式(即，除去了脂类A核心)或者可以是没有去毒的形式。例如，含有多种脂类A种类的LPS，如牙龈卟啉单胞菌LPS可以用于本文描述的组合物中(见，例如，Darveau等人，Infect.Immun.725041-51(2004))。在本公开中，脂糖不必，并且优选不去毒。例如，可以如美国专利申请公布号2003/0044425中描述的制备脂糖。如本文所用的“蛋白体LPS或者Protollin或者IVX或者IVX-908”指用至少一种脂糖制备如本文描述的混合的projuvant(例如，通过外源加入)以提供OMP-LPS组合物(其可以作为免疫调节组合物)。从而，OMP-LPS佐剂可以包含Protollin的两种基本组分，其包括(1)从革兰氏阴性细菌如脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)制备的蛋白体的外膜蛋白制备物(即，projuvant)，和(2)一种或多种脂糖的制备物。脂糖可以是内源的(即，天然包含在OMP蛋白体制备物中)，可以与来自外源制备的脂糖的OMP制备物(即，从不同与OMP制备物的培养物或者微生物制备)混合或者组合，或者可以是它们的组合。此类外源加入的LPS可以来自与OMP制备物从中制备的相同的革兰氏阴性细菌或者来自不同的革兰氏阴性细菌。Protollin将还应该理解为任选包括脂类、糖脂、糖蛋白、小分子等等，和其组合。例如，可以如美国专利申请公布号2003/0044425中描述的制备Protollin。
Projuvant通常与具有天然发生的、修饰的或者补充的疏水部分(也称作“足”或者“锚”)的(天然发生的或者经修饰的)抗原结合使用。Protollin(含有外源加入的LPS)可以与不含有疏水足结构域并且可以本质上十分亲水的抗原一起使用。Protollin可以与含有疏水足的抗原、缺少疏水足的抗原，或者与具有和不具有疏水部分或者足的抗原的组合混合或者组合。
本文所用的免疫原性组合物指能够引发、加强、激活、引起、刺激、增强、加强、扩大或者强化适应性(特异性)免疫应答的任何一种或多种化合物或者试剂或者免疫原，所述免疫应答可以是细胞的(T细胞)或者体液的(B细胞)免疫应答，或其组合。优选地，适应性免疫应答是保护性的，其可以包括病毒的中和(减小或者消除病毒感染力)。免疫原的代表性实例是微生物抗原(如一种或多种冠状病毒抗原)。
除非另外说明，在本说明书中，任何浓度范围、百分比范围、比例范围或者整数范围都理解为包括所引用的范围内的任一整数，并且当合适时，其分数(如整数的十分之一和百分之一，等等)。本文所用的“约”或者“基本上包含”指±15％。不定冠词如“一个”的使用应该理解为指名词或者名词短语的单数和复数(即，指所列举元件或组件的“一个或多个”或者“至少一个”)。备选物的使用(例如，“或者”)将理解为指备选物的一个或两个或者其任一组合。此外，将理解来自本文描述的序列、结构和取代基的多种组合的个体化合物或者化合物的组被本申请公开的程度与每种化合物或化合物组被单独阐明一样。从而，具体序列、结构或者取代基的选择在本发明的范围内。
冠状病毒免疫原本文描述的用于治疗和/或预防冠状病毒感染的组合物包含免疫原性冠状病毒多肽，如S蛋白、其片段、和变体，还包括冠状病毒免疫原与其他肽或者多肽(例如，疏水氨基酸序列或者组氨酸标记或者非-S蛋白冠状病毒多肽或者其片段)的融合或者其他修饰(例如，糖基化)。在一些实施方案中，免疫原S多肽可以包含S蛋白的任一部分，其具有能够引起针对冠状病毒感染的保护性免疫应答(例如，引起产生中和性抗体和/或刺激细胞介导的免疫应答)的表位。如本文描述的免疫原性多肽可以以线性形式排列、组合或者融合，并且每种免疫原可以反复或者不反复，其中反复可以发生一次或多次，并且可以位于免疫原性S或者其他冠状病毒多肽免疫原的线性序列的N-末端、C-末端或者内部。此外，可以选择许多不同的冠状病毒免疫原性多肽(例如，其他S蛋白、N蛋白、M蛋白或者其他冠状病毒多肽，和其变体或片段)并混合或者组合到混合组合物中以提供多价疫苗，其用于引起保护性免疫应答而无有害或者不需要的相关的免疫应答或者副作用。本发明还提供了产生合成或者重组多价冠状病毒多肽免疫原，包括融合蛋白的方法。例如，含有编码S蛋白免疫原的核酸表达构建体的宿主细胞可以经培养以产生重组S蛋白免疫原，或者其变体(例如，缺失C-末端跨膜结构域的缺失突变体或者S多肽片段)。还预期使用S蛋白免疫原或者其变体，或者多肽的组合(包括融合蛋白)治疗或预防冠状病毒感染或者引起免疫应答的方法。
作为背景并且不希望被理论束缚，冠状病毒具有正义、非区段化的单链RNA基因组，其编码至少18种病毒蛋白质(如非结构蛋白质(NSP)1-13、结构蛋白质E、M、N、S)和依赖RNA的RNA聚合酶)。冠状病毒具有三种主要表面糖蛋白(称作S、E和M)，一些冠状病毒具有另一种表面糖蛋白，称作血凝酯酶(HE)，其在SARS病毒中没有找到，此外，N(核壳体)蛋白是碱性磷蛋白，其通常与基因组结合并且已经报导是抗原性的(Holmes和Lai，Fields Virology，Chapter 34，1996)。S(刺突)蛋白是冠状病毒的主要抗原，具有两个结构域S1，认为其参与受体结合和S2，认为其介导病毒和靶细胞之间的膜融合(Holmes和Lai，1996，上文)。
S(刺突)蛋白可以形成非共价连接的同源三聚体(寡聚体)，其可以介导受体结合和病毒感染力。S蛋白的同源三聚体可能对于受体结合结构域呈现正确的天然构象和引起中和性抗体应答是必要的。此外，S蛋白的细胞内加工与重要的翻译后寡糖修饰有关。通过N-聚糖基序分析预期的翻译后寡糖修饰(糖基化)表明S蛋白对于此类修饰有多达23个位点。此外，C-末端半胱氨酸残基也可以参与蛋白质折叠和保存天然的(功能的)S蛋白构象。一些冠状病毒(例如，组II和III病毒的一些毒株)的S蛋白可以在S蛋白的中心附近被高尔基体中的胰蛋白酶样蛋白酶或者细胞外定位的酶蛋白水解加工成连接的多肽，其含有N-末端S1和C-末端S2。II类组的冠状病毒和组I病毒的一些成员可能不这样加工。直到将SARS相关的病毒剂表征为冠状病毒时，冠状病毒才被基于血清学和遗传学性质分成三组，这些组称作组1、组2和组3，它们在本领域中也被称作组I、组II和组III(见，例如，Holmes等人，Fields Virology，上文；Stadler等人，Nat.Rev.Microbiol.209-18(2003)；Holmes，J Clin.Invest.1111605-609(2003))。当前，将冠状病毒细分成组1、组2、组3和SARS-CoV(SARS-相关的冠状病毒)(见，例如，Stadler等人，上文；Holmes，J Clin.Invest.，上文)。
示例性SARS-CoV S蛋白具有1,255个氨基酸(见例如，SEQ ID NO2和图4)，具有12个氨基酸信号序列，S1结构域在氨基酸12-672之间(见，例如，SEQ ID NO20)，S2结构域在氨基酸673-1192之间(见，例如，SEQID NO22)。在一些实施方案中，在用于治疗或者预防冠状病毒感染的组合物中包括冠状病毒S或者N多肽和其变体，它们具有一个或多个表位(即为免疫原)并且能够引起中和性(例如，IgA或IgG抗体)或细胞介导的免疫应答。本文中还描述了非糖基化并且能够引起中和性免疫应答的S蛋白免疫原(含有一个或多个免疫原性表位)的鉴定。在一个实施方案中，S蛋白免疫原是全长S蛋白的部分或者片段。例如，包括SEQ ID NO2的417-560位的氨基酸的S蛋白免疫原的一部分不含有N-聚糖取代位点并且是亲水区。该区域也对应于认为参与细胞受体结合的S1结构域的区域。因此，包含SEQ ID NO2的417-560位的氨基酸的片段或者其部分(例如，SEQ IDNO12和SEQ ID NO14)可以是免疫原性的，并且对该序列内一个或多个表位特异的免疫应答可以防止冠状病毒进入靶细胞。此外，S蛋白的不含有糖基化位点的此类免疫原性片段的鉴定提供了如下优点可以在不能糖基化蛋白质的细胞，如细菌中以与哺乳动物细胞相同的方式产生所述片段。还值得注意的是，从猫科感染性腹膜炎病毒(FIPV)的S蛋白表达的痘苗病毒涉及病毒感染的抗体诱导的增强(ADE)(Vennema等人，Adv.Exp.Med.Biol.276217(1990)；Klepfer等人，Adv.Exp.Med.Biol.380235(1995))。因此，鉴于本领域的描述，不能预期到S蛋白免疫原能够在如本文描述的宿主中引起免疫应答并从而提供作为疫苗的优点。
如本文描述的，S蛋白免疫原包括S蛋白的片段或者S蛋白变体(其可以是如本文描述的全长S蛋白的变体或者S片段)，其分别保留或者具有在全长S蛋白或者野生型S蛋白内所含的至少一个表位，所述表位引起针对冠状病毒，优选针对SARS冠状病毒的保护性免疫应答。S蛋白片段或者S蛋白变体具有全长或者野生型(天然的)S蛋白的至少一种生物学活性或者功能(如受体结合或者细胞融合活性)，或者具有多种S蛋白特异的生物学活性或者功能。例如，S蛋白变体可以含有诱导免疫应答(例如，诱导产生特异结合野生型或者全长S多肽的抗体)的表位或者可以具有蛋白质受体结合活性。在一个实施方案中，S蛋白片段是截短的S蛋白，其包含SEQ ID NO2的1-1200位给出的氨基酸(SEQ ID NO4)。S蛋白的被缺失的部分是跨膜区；剩余的片段也在本文中称作STM-del或者ΔTMS-蛋白。在一些其他实施方案中，示例性S蛋白片段包括SEQ ID NO2的12-254位给出的氨基酸序列(SEQ ID NO6)；或者SEQ ID NO2的255-834位给出的氨基酸序列(SEQ ID NO8)；或者SEQ ID NO2的835-1255位给出的氨基酸序列(SEQ ID NO10)；或者或者SEQ ID NO2的12-672位给出的氨基酸序列(SEQ ID NO20；S1结构域)；或者SEQ ID NO2的673-1195位给出的氨基酸序列(SEQ ID NO22；S2结构域)。在一些其他实施方案中，S多肽片段包括或者SEQ ID NO2的300-550位给出的氨基酸序列(SEQID NO12)；或者SEQ ID NO2的380-580位给出的氨基酸序列(SEQ IDNO14)；或者SEQ ID NO2的380-480位给出的氨基酸序列(SEQ ID NO16)；或者SEQ ID NO2的481-580位给出的氨基酸序列(SEQ ID NO18)；或者SEQ ID NO2的673-960位给出的氨基酸序列(SEQ ID NO24)；或者SEQ IDNO2的961-1200位给出的氨基酸序列(SEQ ID NO26)。S蛋白免疫原性片段还可以包括S蛋白的前述氨基酸片段的更小的部分或者片段。包含刺激、诱导或者引起免疫应答的表位的S蛋白片段可以包含SEQ ID NOS2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、或26任一种的从8个氨基酸到150个氨基酸之间的任一数目氨基酸(例如，8、10、12、15、18、20、25、30、35、40、50个氨基酸等等)的连续氨基酸序列。
在相关实施方案中，冠状病毒S多肽变体与SEQ ID NO2(其来自SARS-CoV Tor2毒株；SEQ ID NO1是编码SEQ ID NO2的氨基酸序列的核酸序列)中给出的全长S蛋白的氨基酸序列有至少50％到100％的氨基酸同一性(即，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％同一性)，或者与SEQ ID NOS4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24和26任一种中给出的S蛋白片段具有50％到100％的氨基酸同一性(即，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或者99％同一性)。此类S多肽变体和片段保留至少一种S蛋白特异的生物学活性或者功能，如(1)能够引起保护性免疫应答(即，S多肽变体含有诱导或者引起保护性免疫应答的表位)，例如，针对冠状病毒，如SARS-CoV的中和应答和/或细胞介导的免疫应答；(2)能够通过受体结合介导病毒感染；和(3)能够介导病毒体和宿主细胞之间的膜融合。
全长SARS冠状病毒S(刺突)多肽序列的额外实例在本文中提供并且可以在本领域中得到。例如，SARS冠状病毒Frankfurt 1毒株的全长S蛋白在SEQ ID NO45中提供，其由SEQ ID NO44中给出的多核苷酸序列编码。SARS冠状病毒TW5毒株的全长S蛋白在SEQ ID NO47中提供，其由SEQ ID NO46中给出的多核苷酸序列编码。SARS冠状病毒GD03T0013毒株的全长S蛋白在SEQ ID NO49中提供，其由SEQ ID NO48中给出的多核苷酸序列编码。SARS冠状病毒BJ01毒株的全长S蛋白在SEQ ID NO51中提供，其由SEQ ID NO50中给出的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，这些全长S多肽的任一种的片段(如缺失跨膜结构域的截短的S蛋白)和变体可以用作免疫原来引起针对冠状病毒，尤其针对SARS冠状病毒的免疫应答。
在其他实施方案中，N蛋白的片段，或者片段的变体或者全长N蛋白的片段的变体包括保留或者具有至少一种N蛋白相关的生物学活性或功能的免疫原，所述活性或功能为诸如(1)能够诱导保护性免疫应答(即，N多肽变体含有诱导或者引起免疫应答的表位)，其可以是例如，针对冠状病毒，如SARS-CoV的体液应答(即，引起产生特异结合野生型或者全长N多肽的抗体)和/或细胞介导的免疫应答；(2)能够结合核酸，如RNA；和(3)能够促进冠状病毒的发病(见，例如，Chen等人CHn.Chem.50988-95(2004)(描述位于N蛋白内的氨基酸序列，其含有与核定位信号有关的基序))。
本文还描述了其他N蛋白和其变体，该变体具有至少一种N蛋白相关的生物学活性(如核酸结合活性或者能够特异结合特异结合N蛋白的抗体)。在一些实施方案中，示例性N蛋白免疫原片段和其变体包括具有SEQID NO28的1-211位的氨基酸序列(SEQ ID NO30)；或者SEQ ID NO28的212-422位的氨基酸序列(SEQ ID NO32)；SEQ ID NO28的100-300位的氨基酸序列(SEQ ID NO34)的片段。在其他实施方案中，N多肽片段包括SEQ ID NO28的50-250位的氨基酸序列(SEQ ID NO36)；或者SEQID NO28的150-400位的氨基酸序列(SEQ ID NO38)。N蛋白免疫原性片段还包括N蛋白的前述氨基酸片段的更小的部分或者片段。包含刺激或者引起免疫应答的表位的N蛋白片段可以包含SEQ ID NO28、30、32、34、36和38任一个的8到150个氨基酸之间的任意数目的氨基酸范围的连续氨基酸序列(例如，8、10、12、15、18、20、25、30、35、40、50个氨基酸等等)。
N多肽的变体或者全长N蛋白的片段或者其变体与SEQ ID NOS28、30、32、34、36和38中给出的氨基酸序列有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性。如本文描述的，N多肽变体保留至少一种N蛋白特异的活性，如能够引起保护性体液或者细胞介导的针对冠状病毒，如针对SARS-CoV的免疫应答，或者保持至少一种其他N蛋白相关的生物活性，如核酸结合活性。在相关实施方案中，冠状病毒N多肽与SEQ ID NO28(来自SARS-CoV Urbani毒株，见图5；也见SEQ IDNO27，其给出编码SEQ ID NO28的氨基酸序列的核苷酸序列)中给出的全长N蛋白的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的氨基酸同一性。
全长SARS冠状病毒N(核壳体)多肽序列的额外实例在本文中提供并且可以在本领域中得到。例如，SARS冠状病毒HB毒株的全长N蛋白在SEQID NO55中提供，其由SEQ ID NO54中给出的多核苷酸序列编码。
两种或多种冠状病毒多核苷酸和多肽和其变体的核苷酸序列和氨基酸序列可以用任何标准软件程序(如BLAST、tBLAST、pBLAST或MegAlign)比较。其他程序还包括Lasergene生物信息学计算软件包中提供的程序，该软件包由DNASTAR(Madison，Wisconsin)生产。关于如ALIGN或BLAST的算法的参考文献可以见例如，Altschul，J.MoL Biol.219555-565，1991；或Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sd.USA8910915-10919，1992。BLAST可以在NCBI网站得到。关于通过确定最佳比对来比较多个核苷酸或氨基酸序列的其他方法是本领域技术人员公知的(见，例如，Peruski和Peruski，The Internet and the New BiologyTools for Genomic and Molecular Research(ASM Press，Inc.1997)；Wu等人(eds.)，″Information Superhighway and Computer Databases ofNucleic Acids and Proteins，″in Methods in Gene Biotechnology，pages 123-151(CRC Press，Inc.1997)；和Bishop(ed.)，Guide to HumanGenome Computing，第二版，Academic Press，Inc.，1998)。
如本文所用的，“百分比同一性”或者“％同一性”是使用计算机实现的算法，通常用默认参数，通过比较整个主题多肽、肽或者其变体序列与测试序列所返回的百分数值。本文描述的变体多肽和免疫原可以使其包括一种或多种突变，如点突变、移码突变、错义突变、加入、缺失，等等，或者变体可以通过修饰，如通过某些化学取代基，包括糖基化、烷基化等等来产生。如本文所用的，两种肽或多肽之间的“相似性”通常通过比较一种肽或多肽的氨基酸序列与另一种肽或者多肽的氨基酸序列和其保守氨基酸替代来确定。
如本文描述的，本文描述的S或者N蛋白免疫原、其片段和变体含有引起或者诱导免疫应答，优选保护性免疫应答的表位，所述免疫应答可以是体液应答和/或细胞介导的免疫应答。保护性免疫应答可以表现为至少一种下面方面防止冠状病毒对宿主的感染；改变或者限制感染；帮助、改善、增强或者刺激宿主从感染恢复；和产生免疫学记忆，其将防止或者限制冠状病毒以后的感染。体液应答可以包括产生抗体，所述抗体中和感染性，裂解病毒和/或受感染的细胞，促进宿主细胞除去病毒(例如，促进吞噬作用)，和/或结合并促进病毒抗原性物质的除去。体液应答还可以包括粘膜应答，其包括引起或诱导特异性粘膜IgA应答。
本文描述的冠状病毒多肽、片段或者变体对受试者或者宿主(人或非人动物)中免疫应答的诱导可以通过本文描述的方法确定或表征并且是本领域常规实践的。这些方法包括体外测定法，如动物免疫接种研究(例如，使用兔、小鼠、白鼬、麝猫、非洲绿猴，或者猕猴模型)，和许多体外测定法的任一种，如用于检测和分析抗体的免疫化学方法，包括蛋白质免疫印迹分析、ELISA、免疫沉淀、放射免疫测定、等等，和它们的组合。作为实例，动物模型可以用于确定冠状病毒抗原引起和诱导动物中的保护性免疫应答的能力，其可以通过与具体模型有关的终点来确定。用于研究猕猴中SARS的动物模型的实例在Kuiken等人，Lancet 362263-70(2003)中描述。猫和白鼬动物模型也可以用于研究SARS(见，例如，Martina等人，Nature 425915(2003))。
可以用于分析和表征免疫应答的其他方法和技术包括中和测定法(如空斑数降低测定法或者测量细胞致病作用(CPE)的测定法或者本领域技术人员实践的任何其他中和测定法)来评估S或者N蛋白免疫原或者其变体能否引起免疫应答，尤其中和免疫应答(见，例如，Schmidt等人，Diagnostic Procedures for Viral，Rickettsial and ChlamydialInfections，第六版，American Public Health Association(Washington1989)；Marra等人，Science 3001399-404(2003)；Guo等人，Virology324251-56(2004))。简言之，将动物用S或者N蛋白免疫原或者含有至少一种S蛋白免疫原或者至少一种N蛋白免疫原的组合物，或者含有至少一种S蛋白免疫原和至少一种N蛋白免疫原的混合组合物免疫，这可以通过皮下、腹膜内、鼻内、静脉内或者本文描述的和本领域技术人员实践的其他合适的施用途径来进行。从经免疫的动物收集血清并测试血清中存在的抗体抑制细胞培养物单层的冠状病毒感染的能力(例如，通过导致病毒裂解的冠状病毒引起的单层中空斑(即，“洞”)的数目来测量感染(空斑数减少测定法)或者通过显微术测定CPE测定中的细胞致病作用)。此外，用根据本文描述的方法和本领域技术人员已知的一种或多种S或N蛋白免疫原免疫后，通过测定用冠状病毒刺激的动物中细胞因子表达模式，可以鉴定和表征引起或诱导的免疫应答(即，与免疫前的免疫应答相比已经改变或者变更)。例如，通过用S或者N蛋白免疫原免疫后随后用冠状病毒刺激后，用核糖核酸酶保护测定法(RPA)来测定1型或2型应答是否占优势，可以测量目的组织中的特异细胞因子水平。另一种示例性测定法是ELISA，其使用OptEIA试剂盒(BD Biosciences，San Jose，CA)测量一种或多种细胞因子的水平。
用于检测和表征保持生物学活性的冠状病毒多肽和其变体(例如，S蛋白变体或S蛋白变体)的体外测定法包括，例如，竞争性ELISA技术或者竞争性受体结合技术，其可以用于鉴定冠状病毒多肽和变体的存在和/或测定它们的功能(生物学活性)。冠状病毒抗原(如至少一种S蛋白免疫原、一种N蛋白免疫原，或者可以在生理学赋形剂中组合(混合、掺合或配制)的S和N蛋白免疫原的每一种的至少一种和/或如本文描述的基于蛋白体的组合物，包括Protollin)可以引起(诱导产生或者引出)中和性抗体应答，其取决于天然冠状病毒多肽中存在的表位的呈递。构象表位或者序列表位的存在可以例如，通过蛋白质结合测定法(其可以包括使用单克隆抗体)来测定，或者通过竞争性结合测定形式来测定，其使用已知结合所述抗原的抗体或者使用配体(例如，冠状病毒蛋白质，S蛋白或N蛋白或其片段)，或者受体。
本文的天然多肽(或者蛋白质)指如在装配的病毒或者在病毒的装配期间发现的处于天然构象的冠状病毒，即，该蛋白质已经采用了其天然拓扑结构。重组表达的冠状病毒多肽也可以采取天然构象。诱导体液应答，即抗体应答的表位(在本文和本领域中也称作抗原决定簇)也可以是构象表位，并且从而，如天然冠状病毒蛋白质中发现的一样。备选地，表位或者抗原决定簇可以是序列的，即表位包含本文描述的一种或多种冠状病毒蛋白质序列的连续氨基酸。通过构象表位或者序列表位或者通过表位的组合可以诱导体液免疫应答。包括T细胞识别的细胞介导的应答可以取决于所处理的冠状病毒蛋白质片段(或者几种片段)的呈递，所述片段仅保留一级结构和二级结构(例如，序列表位)。
本领域已知的这些和其他测定法可以用于鉴定和表征S或者N蛋白免疫原和其变体，它们具有引起针对冠状病毒的保护性体液或者细胞介导的免疫应答的至少一个表位。在不同测定法中得到的结果的统计学显著性可以根据相关领域技术人员通常实践的方法计算和理解。
冠状病毒S或N蛋白免疫原(全长蛋白质、其变体、片段和融合蛋白)，以及编码此类免疫原的对应的核酸，被以分离形式提供，并且在一些实施方案中，被纯化至同质性。本文所用的术语“分离的”是指核酸或者多肽从其最初的或者天然的环境除去。例如，活的动物或者细胞中存在的天然发生的核酸分子或者该核酸编码的多肽不是分离的，但是该相同的核酸分子或者多肽当与天然系统中一些或者所有共存物质分开时，是分离的。例如，核酸分子可以是载体的部分，和/或此类核酸或者多肽可以是组合物的部分并且仍然是分离的，因为此类载体或者组合物不是该核酸分子或者多肽的天然环境的部分。
冠状病毒S或N蛋白免疫原(和对应的免疫原性表位)和其片段和变体可以合成或重组产生。含有诱导针对冠状病毒的免疫应答的表位的冠状病毒蛋白质片段可以通过标准化学方法合成，包括通过自动化方法合成。通常，基于标准固相Fmoc保护策略，用HATU作为偶联剂合成免疫原性肽。用含有合适的清除剂的三氟乙酸从固相树脂切除免疫原性肽，所述清除剂也去保护侧链官能团。粗品免疫原性肽可以用制备性反相层析进一步纯化。也可以使用其他纯化方法，如分配层析、凝胶过滤、凝胶电泳，或者离子交换层析。本领域已知的其他合成技术也可以用于产生类似的免疫原性肽，如tBoc保护策略、使用不同的偶联试剂，等等。此外，可以使用任何天然发生的氨基酸或者其衍生物，包括D-氨基酸或L-氨基酸，和它们的组合。在一些实施方案中，合成的S蛋白免疫原SEQ ID NOS2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26相同或者具有至少80％同一性(其包括至少85％、90％或者95％或者80％到100％之间的任一百分数的同一性)。在其他实施方案中，本发明的合成的N蛋白免疫原与SEQIDNOS28、30、32、34、36或38相同或者具有至少80％同一性(其包括至少85％、90％或者95％或者80％到100％之间的任一百分数的同一性)。
如本文描述的，S或者N蛋白免疫原可以是重组的，其中所希望的S或者N蛋白免疫原单独或者组合地从在核酸表达构建体中与表达控制序列(例如，启动子)有效连接的多核苷酸表达。在一些实施方案中，重组S蛋白抗原将包含与SEQ ID NO2相同或者至少80％同一性(其包括至少85％、90％或者95％或者80％到100％之间的任一百分数的同一性)。在另一实施方案中，重组S蛋白免疫原由SEQ ID NO2中给出的氨基酸序列组成。在其他实施方案中，重组S蛋白免疫原和其变体为SEQ ID NO2的片段，其可以包含SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24和SEQ ID NO26的氨基酸序列，或者与前述氨基酸序列每一种相同或者具有至少80％同一性(其包括至少85％、90％或者95％或者80％到100％之间的任一百分数的同一性)的序列。在一些其他实施方案中，重组N蛋白免疫原和其变体包含SEQID NO28中给出的氨基酸序列，或者为其变体，或者包含SEQ ID NO28的片段，该片段可以包含SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36和SEQ ID NO38的氨基酸序列，或者与这些氨基酸序列每一种相同或者具有至少80％同一性(其包括至少85％、90％或者95％或者80％到100％之间的任一百分数的同一性)的序列。
多核苷酸、核酸，或者核酸分子指任意单链或者双链的脱氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸(RNA)多核苷酸、寡核苷酸、或者其片段。多核苷酸可以从生物来源分离和/或可以通过聚合酶链式反应(PCR)扩增和产生。多核苷酸片段可以从PCR产物得到或者通过任一连接、分裂、内切酶和/或外切核酸酶活性从分离的多核苷酸得到。核酸可以由天然发生的核苷酸单体(如脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸)、天然发生的核苷酸的类似物(例如，天然发生的核苷酸的α-对映异构体形式)，或者它们的组合组成。经修饰的核酸可以在糖部分和/或在嘧啶或嘌呤碱基部分中具有修饰。糖修饰包括例如，将一个或多个羟基基团用卤素、烷基、胺、和叠氮基取代，或者糖可以官能化为醚或者酯。此外，整个糖部分可以用立体或者电子上相似的结构置换，如用氮杂糖和碳环糖类似物置换。碱基部分的修饰的实例包括烷基化嘌呤和嘧啶、酰化嘌呤和嘧啶，或者其他公知的杂环取代。核酸单体可以通过磷酸二酯键或者此类键的类似物连接。磷酸二酯键类的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、phosphoroanilothioate、phosphoranilidate、氨基磷酸酯，等等。术语“核酸”还包括“肽核酸”，其包含天然发生的或者经修饰的连接到聚酰胺主链的核酸碱基。
此外，分离的核酸分子指分离片段形式的核酸分子(多核苷酸或者核酸)，或者作为更大的核酸构建体的组分，其已经以基本上纯的形式从其源细胞(如果适用，包括它天然位于的染色体)和病毒分离。例如，编码冠状病毒多肽、肽或者其变体的、从冠状病毒颗粒或者从受冠状病毒感染或者含有冠状病毒的宿主细胞分离的DNA分子是分离的DNA分子。分离的核酸分子的另一实例是化学合成的核酸分子。核酸分子可以包含多种核苷酸，包括DNA、cDNA、RNA、核酸类似物，或者其一定的组合。
在一个实施方案中，分离的核酸分子包含编码S蛋白免疫原的序列，该序列包含与SEQ ID NO2相同或者具有至少80％同一性(其包括至少85％、90％或者95％或者80％到100％之间的任一百分数的同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述核酸分子编码S蛋白免疫原，其具有引起保护性免疫应答的抗原表位，所述免疫应答包括针对冠状病毒的体液应答(例如，引起和产生粘膜IgA和/或系统IgA或者IgM或者IgA)和/或细胞介导的免疫应答。在另一实施方案中，分离的核酸分子包含编码S蛋白免疫原的序列，该序列具有由SEQ ID NO2组成的氨基酸序列。在再一个实施方案中，分离的核酸分子编码SEQ ID NO2的S蛋白免疫原片段，该片段可以包含与选自SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ IDNO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24和SEQ ID NO26的氨基酸序列相同或者具有至少80％同一性(其包括至少85％、90％或者95％或者80％到100％之间的任一百分数的同一性)的氨基酸序列。在其他实施方案中，分离的核酸分子包含编码N蛋白免疫原的序列，该序列具有包含或由SEQ ID NO28组成的氨基酸序列，或者其变体。在另一个实施方案中，分离的核酸分子编码SEQ ID NO28的N蛋白免疫原片段，该片段可以包含与选自SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36和SEQ ID NO38的氨基酸序列相同或者具有至少80％同一性(其包括至少85％、90％或者95％或者80％到100％之间的任一百分数的同一性)的氨基酸序列。
本文还提供了核酸载体和构建体，其包括编码冠状病毒免疫原的核酸序列，尤其涉及核酸表达构建体(也称作重组表达构建体)，其包括如本文描述的编码冠状病毒多肽或者片段或者其变体的任一多核苷酸，和调节核酸序列。宿主细胞可以经遗传工程化以包含此类载体或者构建体，所述宿主细胞可以经产生和用于治疗或预防冠状病毒感染或者引起针对冠状病毒感染的免疫应答的方法中。冠状病毒多肽和其片段或变体可以在哺乳动物细胞、酵母、细菌或者其他细胞(例如，昆虫细胞)中在合适的表达控制序列(包括启动子序列)的控制下表达。无细胞的翻译体系也可以用于使用核酸，包括RNA和表达构建体来产生冠状病毒蛋白质。用于原核生物和真核生物的合适的克隆和表达载体被本领域技术人员常规使用并且描述于例如Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，SecondEdition，Cold Spring Harbor，NY，(1989)和第三版(2001)，并且可以包括质粒、粘粒、穿梭载体、病毒载体，和包含如本文公开的染色体复制起点的载体。
在一个实施方案中，核酸表达载体包含有效连接多核苷酸的表达控制序列，如启动子，所述多核苷酸编码S蛋白免疫原或者其变体，该S蛋白免疫原或者其变体包含与SEQ ID NO2相同或者具有至少80％同一性(其包括至少85％、90％或者95％或者80％到100％之间的任一百分数的同一性)的氨基酸序列，其中S蛋白免疫原具有至少一个引起针对冠状病毒感染，如针对SARS冠状病毒感染的体液应答(例如包括中和性抗体)和/或细胞介导的免疫应答的表位。在一些实施方案中，核酸表达构建体包含有效连接多核苷酸的表达控制序列，该多核苷酸编码具有由SEQ ID NO2组成的氨基酸序列的S蛋白免疫原。在其他实施方案中，核酸表达构建体包含有效连接至少一个多核苷酸的表达控制序列，如启动子序列，所述多核苷酸编码至少一种S蛋白免疫原或者其变体，其是SEQ ID NO2的片段，该片段包含与选自SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24和SEQ ID NO26的氨基酸序列相同或者具有至少80％同一性(其包括至少85％、90％或者95％或者80％到100％之间的任一百分数的同一性)的氨基酸序列。
在其他实施方案中，核酸表达构建体包含有效连接至少一个多核苷酸的表达控制序列，如启动子序列，所述多核苷酸编码至少一种N蛋白免疫原或者其变体，或者是N蛋白免疫原或者其变体的片段并且具有与SEQ IDNO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36、或SEQ ID NO38相同或者具有至少80％同一性(其包括至少85％、90％或者95％或者80％到100％之间的任一百分数的同一性)的氨基酸序列。在相关实施方案中，核酸表达构建体包含有效连接多核苷酸的表达控制序列，如启动子序列，所述多核苷酸编码这样的N蛋白免疫原或者其变体，其中该N蛋白免疫原具有引起针对冠状病毒感染，如针对SARS冠状病毒感染的体液应答(包括中和性抗体)和/或细胞介导的免疫应答的表位。
如本领域普通技术人员将理解的，编码冠状病毒多肽或者其变体的核苷酸序列可以由于例如，遗传密码简并性而与本文给出的序列不同。编码冠状病毒多肽变体的核苷酸序列包括编码同源物或者株变体或者其他变体的序列。变体可以从天然多态性产生或者可以通过重组方法合成(例如，以得到密码子优化用于在特定宿主中表达或者导入氨基酸突变)或者化学合成，并且可以通过一个或多个氨基酸替代、插入、缺失等等而与野生型多肽不同。编码冠状病毒多肽变体的多核苷酸变体包括优选编码保守氨基酸替代的多核苷酸。保守替代的实例包括将一种脂肪族氨基酸用另一种脂肪族氨基酸(如Ile、Val、Leu或者Ala)替代，或者将一个极性残基用另一个极性残基替代，如Lys和Arg、Glu和Asp，或者Gln和Asn之间的替代。类似的氨基酸或者保守氨基酸替代还有其中将一个氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替换，所述氨基酸残基包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)；具有不带电极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、组氨酸)；具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；具有β分枝侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，和具有芳族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。被认为较难分类的脯氨酸与具有脂肪族侧链的氨基酸(例如，Leu、Val、Ile和Ala)共有性质。在一些情况下，用谷氨酰胺替代谷氨酸或者天冬酰胺替代天冬氨酸可以认为是相似的替代，因为谷氨酰胺和天冬酰胺分别是谷氨酸和天冬氨酸的酰胺衍生物。
本文公开的冠状病毒免疫原序列中氨基酸的保守和相似替代可以根据本文描述和本领域实践的方法容易地制备并且所述方法提供了变体，该变体保持相似的物理性质和功能或生物活性，如能够诱导或引起免疫应答，其可以包括体液应答(即，引起结合野生型(或者非变体)免疫原的抗体和与特异结合野生型(或者非变体)免疫原的抗体具有相同的生物活性的抗体和/或结合特异结合野生型或非变体免疫原的抗体的抗体)。其S蛋白免疫原变体优选保留结合细胞受体和介导感染性的能力。N蛋白免疫原和其变体例如保留与核酸复合或结合的能力。
一些变体包括编码S蛋白免疫原的核酸序列，所述S蛋白免疫原与SEQ ID NOS2、4、6、8、10、1 2、14、16、18、20、22、24或26的一个或多个中给出的氨基酸序列具有至少50％到100％或者大于90％或95％的同一性或者与所述氨基酸序列相同或者具有至少80％同一性(其包括至少85％、90％或95％，或者80％到90％之间的任一百分数)。一些其他变体包括编码N蛋白免疫原的核酸序列，所述N蛋白免疫原与SEQ IDNOS28、30、32、34、36或38的一个或多个中给出的氨基酸序列具有至少50％到100％或者大于90％或95％的同一性或者与所述氨基酸序列相同或者具有至少80％同一性(其包括至少85％、90％或95％，或者80％到90％之间的任一百分数)。多核苷酸变体还包括编码S蛋白免疫原的所有简并核酸分子，所述S蛋白免疫原包含SEQ ID NOS2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中给出的氨基酸序列，或者其变体。在另一实施方案中，多核苷酸变体还包括编码N蛋白免疫原的所有简并核酸分子，所述N蛋白免疫原包含SEQ ID NOS28、30、32、34、36或38中给出的氨基酸序列，或者其变体。
如本文所述，S蛋白免疫原的变体保留至少一种生物学或者功能活性，如能够引起或者诱导保护性免疫应答，其可以包括体液应答(包括粘膜IgA应答)和/或细胞介导的免疫应答。还如本文描述，冠状病毒S多肽变体还可以具有与天然或野生型S蛋白基本相似的生物学活性，如能够特异结合S蛋白抗体，其是中和性抗体(即，中和病毒感染性)；能够引起或诱导产生特异结合S蛋白的抗体；能够引起或诱导产生能够中和病毒感染的抗体；能够引起或诱导细胞介导的免疫应答；和/或能够结合S蛋白细胞受体。如本文所述，N蛋白免疫原的变体保留至少一种生物学或者功能活性，如能够引起或者诱导保护性免疫应答，其可以包括体液应答(包括粘膜IgA应答)和/或细胞介导的免疫应答。还如本文描述，冠状病毒N蛋白变体保留与天然N蛋白基本上相似的至少一种生物活性，如能够结合N蛋白特异性抗体，该抗体是保护性抗体，如中和性抗体；能够引起或诱导产生特异结合N蛋白免疫原的抗体；能够引起或诱导免疫应答(体液和/或细胞介导的免疫应答)，或者能够结合核酸分子，如冠状病毒基因组RNA。如本文所述，核酸分子变体编码S或者N多肽衍生物或者变体，其具有保守氨基酸替代，从而冠状病毒多肽变体保留或者具有能够引起对一种或多种冠状病毒毒株特异的抗体的至少一个表位(分别来自野生型S或者N多肽)，和/或分别保留S或者N蛋白的至少一种生物活性。
在一些实施方案中，可以修饰核酸序列以编码冠状病毒S或者N片段或者其功能变体，其中该核酸序列的特异密码子已经改变成具体宿主偏爱的密码子并且可以导致增强的表达水平(见，例如，Haas等人，Curr.Biol.6315，1996；Yang等人，Nucleic Acids Res.244592，1996)。例如，可以最优化免疫原性肽或多肽的一些密码子以提高在大肠杆菌(Escherichia coli)中的表达而不改变肽的一级序列。作为阐明并且不作为限制，可以将精氨酸(Arg)密码子AGG/AGA改变成Arg密码子CGT/CGC。类似地，可以将AGG/AGA Arg密码子改变成CGT/CGC密码子。如本领域理解的，可以为将表达杂种多肽的具体宿主最优化密码子，所述宿主包括细菌、真菌、昆虫细胞、植物细胞，和哺乳动物细胞。此外，还可以改变编码不同氨基酸的密码子，其中可以同时改变编码不同氨基酸的一个或多个密码子使其最好地适合具体宿主(例如，精氨酸、甘氨酸、亮氨酸、和丝氨酸和其任一组合的密码子都可以被最优化)。备选地，密码子优化可以导致一级氨基酸序列中一个或多个改变，如保守氨基酸替代、添加、缺失和其组合。
如本文描述的，编码冠状病毒S蛋白免疫原的多核苷酸包括在SEQ IDNOS1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23或25中给出核苷酸序列的任一种，它们分别编码具有SEQ ID NOS2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24和26中给出的氨基酸序列的S蛋白免疫原。编码冠状病毒S蛋白免疫原的变体多核苷酸包括与SEQ ID NOS1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23或25中给出的核苷酸序列有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的多核苷酸。由于遗传密码简并性，此类变体多核苷酸分别编码包含在SEQ IDNOS2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26中给出的氨基酸序列的S蛋白免疫原，或者可以编码如本文描述的S蛋白变体免疫原(S蛋白变体免疫原保留至少一种生物或者功能活性，如能够特异结合S蛋白抗体，该抗体是中和性抗体(即，中和病毒感染性)，引起或者诱导产生特异结合S蛋白的抗体，引起或诱导产生能够中和病毒感染的抗体，引起或诱导细胞介导的免疫应答，和/或能够结合S蛋白细胞受体)。从而，在一些实施方案中，分离的核酸(或者多核苷酸)包括SEQ ID NOS1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23或25中的变体，所述变体与这些序列基本上相似，因为变体核苷酸序列编码天然或非天然冠状病毒S多肽，这些多肽具有相似的结构并且能够引起针对SEQ ID NOS2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26的冠状病毒S蛋白多肽中所含的至少一个S蛋白表位的特异性抗体。
本文还描述了分离的核酸，其编码冠状病毒N蛋白免疫原并且这些核苷酸序列的实例在SEQ ID NOS27、29、31、33、35和37中给出，它们分别编码具有在SEQ ID NOS28、30、32、34、36和38中给出的氨基酸序列的多肽。编码状病毒N蛋白免疫原的变体多核苷酸包括与SEQ IDNOS27、29、31、33、35和37中给出的核苷酸序列有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的多核苷酸。由于遗传密码简并性，此类变体多核苷酸编码包含在SEQ ID NOS28、30、32、34、36或38中给出的氨基酸序列的N蛋白免疫原，或者可以编码如本文描述的冠状病毒N蛋白变体免疫原(其保留至少一种生物或者功能活性，如能够结合N蛋白特异性抗体，该抗体是保护性抗体，如中和性抗体；能够引起或诱导产生特异结合N蛋白免疫原的抗体；能够引起或诱导免疫应答(体液和/或细胞介导的免疫应答)，或者能够结合核酸分子，如冠状病毒基因组RNA)。对一种或多种分离的核酸的参考包括这些序列的变体，所述变体与这些序列基本上相似，因为它们编码天然或非天然冠状病毒N多肽，这些多肽具有相似的结构并且能够引起针对SEQ ID NOS28、30、32、34、36或38的冠状病毒N蛋白来源的多肽中所含的至少一个N蛋白表位的特异性抗体。从而在一些实施方案中，分离的核酸(或者多核苷酸)包括SEQ ID NOS27、29、31、33、35和37的变体，这些变体与这些序列基本上相似，因为变体核苷酸序列编码天然或非天然冠状病毒N多肽，这些多肽具有相似的结构并且能够引起针对SEQ ID NOS28、30、32、34、36或38中给出的冠状病毒N蛋白多肽中所含的至少一个N蛋白表位的特异性抗体。
如本文所用，认为核苷酸序列与编码冠状病毒S蛋白或者N蛋白、其变体或者片段的核苷酸序列“基本上相似”的条件是(a)所述核苷酸序列来自冠状病毒S或者N蛋白基因的编码区(包括例如，本文提供的和本领域已知的核苷酸序列(如可以在GenBank和其他序列数据库中找到)；来自不同毒株的冠状病毒，如SARS冠状病毒毒株的序列，或者此类序列的部分)并且含有一个S或N蛋白表位，该表位具有基本上相同的引起免疫应答(体液或细胞介导的免疫应答)，优选保护性免疫应答的能力；(b)包含基本上相似的核苷酸序列的多核苷酸能够与编码S或者N蛋白免疫原的如本文描述的核苷酸序列或者其互补序列在中度或者高度严格条件下杂交；和/或(c)该核苷酸序列是简并产物(即，该序列包含不同但是编码相同氨基酸的密码子序列)；或者(d)该序列是(a)、(b)或(c)中描述的任一序列的互补序列。
如本文所用的，当在基本上互补的核酸序列之间在所指定的严格性条件下形成稳定杂种分子时，说这两个核苷酸序列“杂交”。杂交的严格性是指环境或者条件的描述，在所述环境或条件下杂种分子退火并洗涤，通常包括离子强度和温度。可以影响杂交的其他因素包括探针大小和允许形成杂种分子的时间长度。例如，“高”、“中”和“低”严格性包括下面的示例性条件或其等同条件高严格性是0.1 x SSPE或SSC，0.1％SDS，约65℃下；中严格性是0.2 x SSPE或SSC，0.1％SDS，约50℃下；低严格性是1.0 x SSPE或SSC，0.1％SDS，约42℃下。如本文所用的术语“高严格性条件”指仅当一个或多个杂交的核苷酸序列具有至少95％或至少97％同一性时，所述序列将保持杂交。合适的中等严格条件包括例如，在5X SSC，0.5％SDS，1.0mM EDTA(pH 8.0)的溶液中预洗涤；在50℃-70℃，5XSSC下杂交1-16小时；然后在22-65℃用每种含有0.05-0.1％SDS的2X、0.5X和0.2X SSC的一个或多种洗涤一次或两次。关于额外的严格性，条件可以包括在0.1 X SSC和0.1％SDS中50-60℃下洗涤15分钟。
如本领域技术人员已知的，通过改变用于预杂交、杂交和洗涤步骤的时间、温度和/或溶液的浓度，可以实现杂交条件的严格性的改变。此外，可以根据本领域已知的方法改变杂交条件，例如，通过向杂交溶液中加入甲酰胺并同时降低杂交的温度。
在一些实施方案中，保持与编码冠状病毒多肽的核酸分子的杂交的核酸序列编码的多肽保留在SEQ ID NOS2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26的任一个中给出的S蛋白或片段的至少一个表位，或者保留如在SEQ ID NOS28、30、32、34、36、或38的任一个中给出的N蛋白或片段的至少一个表位，其中一个或多个表位分别具有与天然或野生型S或N蛋白基本上相同的引起免疫应答(体液的和/或细胞介导的免疫应答)，优选保护性免疫应答的能力。与SEQ ID NOS1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23或25的任一个或SEQ ID NOS27、29、31、33、35和37的任一个分别给出的核苷酸序列保持杂交的核酸分子编码的S或者N蛋白也可以显示出本文描述的分别S或N蛋白的至少一种其他的功能或者生物活性。
使用本文描述的和本领域实践的多种技术可以构建或产生本文描述的蛋白质。用于产生冠状病毒多肽的方法包括在宿主细胞中表达编码这些多肽的核酸分子。在一个实施方案中，产生S或者N蛋白免疫原(具有至少一个引起针对冠状病毒感染的保护性免疫应答的表位)的方法包括在一定条件下培养宿主细胞并培养足够分别表达S或N免疫原的时间，所述宿主细胞含有核酸表达载体，该载体包含有效连接核酸分子的至少一个表达控制序列，如启动子，所述核酸分子编码冠状病毒多肽，如SEQ ID NOS2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26的任一个中给出的冠状病毒多肽(或者如本文描述的该多肽的变体或片段)，或如SEQ IDNOS28、30、32、34、36、或38的任一个中给出的冠状病毒多肽(或者如本文描述的该多肽的变体或片段)。这些包括编码所希望的蛋白质的多核苷酸序列的表达载体或载体构建体优选有效连接合适的转录或者翻译调节元件。合适的调节元件的选择取决于所选的宿主细胞并且可以由本领域技术人员容易地实现。调节元件的实例包括转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列、转录终止子，和核糖体结合序列，包括翻译起始信号。任选地，载体可以包括多腺苷酸化序列，或者一个或多个限制性位点，以及一个或多个选择标记，如新霉素磷酸转移酶或者潮霉素磷酸转移酶或者本领域已知的任意其他标记。此外，取决于所选的宿主细胞和所用的载体，其他遗传标记，如复制起点、额外的核酸限制性位点、增强子、赋予转录诱导能力的序列，和选择标记也可以结合入到本文描述的载体中。
细菌表达载体优选包含在宿主细胞中有功能的启动子、一种或多种选择性表型标记，和细菌复制起点。在一些实施方案中，本文描述的核酸表达构建体具有诱导型启动子，其可以是lac、tac、trc、ara、trp、λ噬菌体、T7噬菌体和T5噬菌体启动子，或者可以是如美国专利申请公布号2003/0143685中描述的T5噬菌体启动子/lac操纵子基因表达控制序列(质粒pT5)。表达控制序列指足够使得目的蛋白质在宿主细胞中表达的任意序列，包括一种或多种启动子序列、增强子序列、操纵基因序列(例如，lacO)等等。在一些实施方案中，冠状病毒多肽编码核酸(如编码S或者N蛋白免疫原的核酸，或者其变体)掺入到质粒，如质粒pT75中，并且宿主细胞是细菌，如大肠杆菌。
其他代表性启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统(见Chang等人，Nature 275615，1978)、T7 RNA聚合酶启动子(Studier等人，Meth.Enzymol.18560-89，1990)、λ启动子(Elvin等人，Gene87123-126，1990)、trp启动子(Nichols和Yanofsky，Meth.inEnzymology 101155，1983)、和tac启动子(Russell等人，Gene 20231，1982)。额外的启动子包括能够识别T4、T3、Sp6和T7聚合酶的启动子、λ噬菌体的PR和PL启动子、大肠杆菌的recA、热休克、lacUV5、tac、lpp-lacSpr、phoA、和lacZ启动子、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的启动子、芽孢杆菌噬菌体的启动子、链霉素启动子、λ噬菌体的int启动子、pBR322的bla启动子，和氯霉素乙酰转移酶基因的CAT启动子。原核生物启动子已经由Glick，J.Ind.Microbiol.1211，1987，Watson等人，Molecular Biology of the Gene，第四版(Benjamin Cummins 1987)，和Ausubel等人(1995)综述。代表性选择标记包括多种抗生素抗性标记，如卡那霉素或者氨苄青霉素抗性基因。许多适于转化宿主细胞的质粒是本领域公知的，包括pBR322(见Bolivar等人，Gene 295，1977)、pUC质粒pUC18、pUC19、pUC118、pUC119(见Messing，Meth.in Enzymology10120-77，1983和Vieira和Messing，Gene 19259-268，1982)，和pNH8A、pNH16a、pNH18a和Bluescript M13(Stratagene，La Jolla，California)。
在一些实施方案中，S和N蛋白免疫原或者其变体在相同细胞中表达，或者来自相同的表达载体，或者作为杂种融合多肽来自同一表达载体。此外，通过合成含有侧翼为限制性位点的突变序列的寡核苷酸，使得其连接到天然序列的片段，可以在特定基因座导入突变。连接后，所重建的序列编码具有所希望的氨基酸插入、替代或者缺失的衍生物或者变体。
备选地，寡核苷酸指导的位点特异(或者区段特异)诱变方法可以用于提供具有根据替代、缺失或插入改变的特定密码子的经改变的多核苷酸。产生上面提到的改变的方法的实例由Walder等人(Gene 42133，1986)；Bauer等人(Gene 3773，1985)；Craik(BioTechniques，January 1985，12-19)；Smith等人(Genetic EngineeringPrinciples and Methods，Plenum Press，1981)；和Sambrook等人(上文)公开。通过使用与所希望的缺失相邻的方便的限制性内切酶位点也可以构建蛋白质(例如，可溶性细胞外部分)的缺失或截短衍生物。限制性切割后，可以填充突出端并且重新连接DNA。产生上面提出的改变的方法的实例由Sambrook等人(Molecular CloningA Laboratory Manual，第三版，Cold Spring HarborLaboratory Press(2001))公开。
在核酸分子中产生的突变优选保留编码序列的读框。此外，突变将优选不产生互补区，互补区当转录时可以杂交而产生二级mRNA结构，如环或者发夹，其将不利地影响mRNA的翻译。尽管可以预定突变位点，但是突变的性质本身不必预先确定。例如，为了选择给定位点的突变的最佳特征，可以在靶密码子进行随机诱变并且筛选表达的突变体的得到、损失或者保持生物学活性。备选地，可以通过合成含有突变序列的寡核苷酸可以在特定基因座上导入突变，所述突变序列侧翼是限制性位点，使得连接到天然序列的片段。连接后，所得重建的序列编码具有所希望的氨基酸插入、替代或缺失的衍生物。编码本发明的蛋白质的核酸分子还可以用诸如聚合酶链式反应(PCR)诱变、化学突变(Drinkwater和Klinedinst，Proc.Natl.Acad.ScL USA 833402-3406，1986)；强行核苷酸错误掺入(例如Liao和Wise Gene 88107-111，1990)；或使用随机诱变的寡核苷酸(Horwitz等人，Genome 3112-117，1989)的技术来构建。
包含编码本文描述的任一种冠状病毒蛋白质的克隆的多核苷酸序列的载体构建体可以导入培养的哺乳动物细胞中，导入可以通过例如脂质体介导的转染、磷酸钙介导的转染(Wigler等人，Cell 14725，1978；Corsaro和Pearson，Somatic Cell Genetics 7603，1981；Graham和Van der Eb，Virology 52456，1973)、电穿孔(Neumann等人，EMBO J.1841-845，1982)、和DEAE-葡聚糖介导的转染(Ausubel等人(eds.)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，NY，1987)；逆转录病毒、腺病毒和原生质体融合介导的转染(见Sambrook等人，上文)。为了鉴定用含有克隆的DNA的载体稳定转染的细胞，通常将选择标记与目的多核苷酸一起导入细胞。用于培养的哺乳动物细胞中的优选的选择标记包括赋予药物(如新霉素、潮霉素和氨甲蝶呤)抗性的基因。选择标记可以是可扩增的选择标记。优选的可扩增的选择标记是DHFR基因和新霉素抗性基因。选择标记由Thilly(Mammalian Cell Technology，Butterworth Publishers，Stoneham，Massachusetts)综述。
多价疫苗本文描述的多核苷酸和宿主细胞可以用于制备多价免疫原，其可以例如用作多价疫苗，并且可以包含至少一种S蛋白免疫原，或者一种和多种S蛋白免疫原，即，多种不同的S蛋白免疫原的混合物或组合。在另一实施方案中，多价疫苗包含至少一种N蛋白免疫原，或者一种和多种N蛋白免疫原，即，多种不同的N蛋白免疫原的混合物或组合。备选地，多价疫苗可以包含一种或多种S蛋白免疫原与一种或多种冠状病毒N蛋白免疫原和/或其他冠状病毒免疫原，如M蛋白的组合。在另一实施方案中，多价疫苗是多价杂种疫苗并且包含至少两种或多种前述免疫原，它们以某种方式连接，如作为融合蛋白融合在框内。此外，免疫原融合蛋白可以具有该融合蛋白内重复至少一次的一种或多种免疫原(从而在融合蛋白的至少两个位置上含有所述至少一种免疫原)，所述重复可以在所选多价免疫原多肽的氨基或羧基末端，或者在多价融合蛋白质的内部发生。例如，此类多价杂种冠状病毒免疫原(多价融合蛋白)可以包含(1)如本文描述的一种或多种S蛋白免疫原或S蛋白的多肽片段(如SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO1 2、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQID NO24和SEQ ID NO26，和其变体和片段)；(2)如本文描述的一种或多种N蛋白免疫原或N蛋白的多肽片段(如SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36、和SEQ ID NO38，和其变体和片段)；(3)或者一种或多种S蛋白免疫原(或者其片段)和一种或多种N蛋白免疫原(或者其片段)。认为至少两种或多种冠状病毒S蛋白免疫原或至少两种或多种冠状病毒N蛋白免疫原分别是多种S蛋白免疫原或N蛋白免疫原。在其他实施方案中，多价杂种冠状病毒免疫原与佐剂，如蛋白体或Protollin，或者与佐剂如明矾、弗氏佐剂或Ribi佐剂(CorixaCorporation，Seattle，WA)组合。
此外，此类多价杂种冠状病毒免疫原疫苗组合物可以组合来自不同的冠状病毒抗原组的免疫原性表位，所述抗原组为例如组1(例如，传染性胃肠炎病毒，TGEV；人呼吸道冠状病毒，HcoV-229E)；组2(例如，小鼠肝炎病毒，MHV)；组3病毒(例如，鸟类IBV)；和SARS组(例如，SARS-CoV毒株Tor2(见GenBank检索号AY274119)；Urbani(见GenBank检索号AY278741)；Frankfurt 1见GenBank检索号AY291315)，TW5(见GenBank检索号AY502928)；BJ01(见GenBank检索号AY278488)；GD03T0013(见GenBank检索号AY525636)；等等)；或者其组合(或者所鉴定的例如感染人类的任何冠状病毒组)。
在一些实施方案中，相同或不同的冠状病毒免疫原可以通过至少两个氨基酸连接，所述氨基酸由作为限制酶识别位点的核酸序列编码，其中限制性位点可以是BamHI、ClaI、EcoRI、HindIII、KpnI、NcoI、NheI、PmlI、PstI、SalI、XhoI等等的任意一个或多个。额外的氨基酸接头也可以如本文描述的通过合成加入。优选地，额外的氨基酸不在人蛋白质的一段5个氨基酸序列内产生任何序列同一性。此外，杂种冠状病毒免疫原多肽还可以包含至少一个额外的羧基末端氨基酸，其中该额外的氨基酸是D-氨基酸或者L-氨基酸。可以加入20种天然发生的氨基酸的任一种或其衍生物，如半胱氨酸、组氨酸、亮氨酸和谷氨酸。例如，在融合多肽的羧基末端加入至少一个半胱氨酸可以用于附着或连接其他成分，如脂类、载体蛋白、标记、酶，等等。
在一些实施方案中，冠状病毒S蛋白免疫原和/或冠状病毒N蛋白免疫原连接到第二种氨基酸序列；在一个具体实施方案中，S蛋白免疫原和/或冠状病毒N蛋白免疫原与第二种氨基酸序列融合在框内。该第二种氨基酸序列可以包含载体蛋白(例如，在本领域中理解促进抗原的增加或提高的免疫原性的蛋白质和多肽)、标记(例如，组蛋白标记)，或者酶。
如本文描述，冠状病毒免疫原融合蛋白可以包含融合到额外的功能或者非功能的非冠状病毒多肽序列的S或者N蛋白免疫原、其片段或者变体，所述非冠状病毒多肽序列允许例如，检测、分离或者纯化杂种多肽融合蛋白。例如，额外的功能多肽序列可以是标记序列，其在一些实施方案中允许可以通过蛋白质-蛋白质亲和(例如，受体-配体)、金属亲和性，或者电荷亲和性方法检测、分离和/或纯化融合蛋白。在一些其他实施方案中，可以通过融合蛋白的特异性蛋白酶切割来检测，所述融合蛋白的序列包含蛋白酶识别序列，从而杂种冠状病毒多肽可以与额外的多肽序列分离。此外，可以通过合成制备杂种多肽，其包括额外的氨基酸、载体蛋白、疏水部分(例如，脂类)，或者标记序列，其可以位于氨基或羧基末端。在一个实施方案中，例如，重组冠状病毒免疫原融合到标记的框内，该标记可以是碱性磷酸酶、硫氧还蛋白、β-半乳糖苷酶、六聚组氨酸(6×His)、FLAG表位标记(DYKDDDDK，SEQ ID NO40)，或者GST，等等。
在一些实施方案中，融合到杂种冠状病毒多肽融合蛋白的标记方便了亲和检测和杂种冠状病毒多肽融合蛋白的分离，并且可以包括例如，美国专利号5,011,912和Hopp等人，(1988 Bio/Technology 61204)中描述的聚-His或者确定的抗原性肽表位，或者XPRESSTM表位标记(DLYDDDDK，SEQ ID NO41；Invitrogen，Carl sbad，CA)或者硫氧还蛋白。亲和序列可以是如载体提供的六聚组氨酸标记。例如，pBAD/His(Invitrogen)或者pQE-30(Qiagen，Valencia，CA)载体可以提供用于使用镍亲和柱从特定宿主(如细菌)纯化成熟的蛋白质融合的聚组氨酸标记。备选地，亲和序列可以通过合成加入或者工程化到引物中，该引物用于重组产生编码冠状病毒的免疫原性多肽的核酸序列(例如，使用聚合酶链式反应)。例如，在一个实施方案中，冠状病毒免疫原融合到硫氧还蛋白并且冠状病毒免疫原硫氧还蛋白融合蛋白由重组核酸序列编码。
治疗性制剂和使用方法在一些实施方案中，提供了含有一种或多种冠状病毒免疫原的药物组合物，其可以用于引起或者诱导针对冠状病毒的免疫应答。此类组合物可以用于治疗和/或预防冠状病毒感染，这可以通过对受试者以足够引起针对冠状病毒的特异性抗体的剂量施用S蛋白免疫原、其片段或变体、S免疫原融合蛋白或者多价免疫原，或者此类免疫原的混合物来实现，如本文描述。在另一个实施方案中，用于治疗和/或预防冠状病毒感染的方法包括对受试者以足够引起针对冠状病毒的特异性抗体的剂量施用N蛋白免疫原、其片段或变体、N免疫原融合蛋白或者多价免疫原，或者此类免疫原的混合物。在再一个实施方案中，用于治疗和/或预防冠状病毒感染的方法包括对受试者以施用至少一种S蛋白免疫原和至少一种N蛋白免疫原(或者S或者N蛋白免疫原的变体或片段)；或者包含至少一种S蛋白免疫原和至少一种N蛋白免疫原的融合蛋白或多价免疫原；或者此类免疫原的混合物。
如本文所述，提供了用于治疗和/或预防冠状病毒感染的方法。在一些实施方案中，对具有冠状病毒感染或者有发生冠状病毒感染的危险的受试者或宿主施用一种或多种冠状病毒蛋白质抗原(免疫原)。至少一种冠状病毒蛋白质(例如，S蛋白免疫原和/或N蛋白免疫原)的施用优选诱导或刺激保护性免疫应答。如本文描述的保护性免疫应答可以包括体液应答，即对受试者施用冠状病毒蛋白质(免疫接种)刺激或者引起产生特异结合冠状病毒蛋白质的抗体。体液应答的刺激或引起优选包括产生抗体，所述抗体是中和冠状病毒感染性的中和性抗体。体液应答还可以包括粘膜免疫应答，其包含产生冠状病毒特异的粘膜IgA抗体，并且可以包括产生多种免疫球蛋白类别的任一种，包括IgM、IgG和IgA，它们可以在受试者或者宿主的血清中检测到。至少一种冠状病毒免疫原的施用还可以诱导细胞介导的应答，其包括T细胞的刺激、免疫刺激分子的产生，如免疫细胞产生的细胞因子，和应答特定冠状病毒蛋白免疫原而引起的特定T细胞的克隆扩充。
在一个实施方案中，用作治疗和/或预防冠状病毒感染的免疫原性组合物的组合物含有如本文描述的能够引起免疫应答的至少一种冠状病毒抗原(免疫原)(包括多价疫苗和多价杂种融合蛋白)和Protollin或蛋白体佐剂(见，例如，美国专利号5,726,292和5,985,284，和美国专利申请公布号2001/0053368和2003/0044425)。如本领域理解的，佐剂可以增强或提高免疫原的免疫原性(即，作为免疫刺激剂)，并且许多抗原是弱免疫原性的，除非与佐剂组合或混合或掺合。多种来源可以用作抗原来源，如活的减毒病毒、被杀灭的病毒、分裂抗原制剂、亚基抗原、重组或合成的病毒抗原，和它们的组合。为了最大化亚基、重组的或者合成疫苗的有效性，抗原可以与有效的免疫刺激剂或者佐剂组合。其他代表性佐剂包括明矾(氢氧化铝，REHYDRAGEL)；磷酸铝；病毒体；具有和不具有脂类A的脂质体；Detox(Ribi/Corixa)；MF59；或者其他油和水乳剂类型的佐剂，如纳米乳剂(见，例如，美国专利号5,716,637)或者亚微米乳剂(见，例如，美国专利号5,961,970)；和弗氏完全和不完全佐剂。
基于蛋白体的佐剂(即，Protollin或蛋白体)可以用于疫苗组合物或制剂中，疫苗组合物或制剂可以包括任意一种或多种如本文描述的多个冠状病毒抗原(免疫原)来源。蛋白体通常包含来自奈瑟氏菌物种的外膜蛋白(OMP)，但是可以来自其他革兰氏阴性细菌(见，例如，Lowell等人，J.Exp.Med.167658，1988；Lowell等人，Science 240800，1988；Lynch等人，Biophys.J.45104，1984；美国专利号5,726,292；美国专利号4,707,543)。蛋白体能够自动装配成20-800nm的小泡或者小泡样OMP簇，和非共价地掺入、配位、结合或者在其它情况下与蛋白质抗原，尤其与具有疏水部分的抗原协作。蛋白体是疏水的，对于人用安全，并且与某些病毒大小相当。作为背景，并且不希望被理论束缚，将蛋白体与抗原如蛋白质抗原混合，提供了这样的组合物，该组合物包含抗原和蛋白体之间的非共价结合或配位，当例如通过透析选择性除去增溶去污剂或者减小增溶去污剂的浓度时，形成所述结合或配位。可以如美国专利申请号2001/0053368和2003/0044425中描述的制备蛋白体。
导致形成小泡或者小泡样外膜蛋白质的任意制备方法，包括一种或多种OMP的熔化的球状OMP组合物，包括在“蛋白体”的定义内。在一个实施方案中，蛋白体来自奈瑟氏菌物种，并且更优选地来自脑膜炎奈瑟氏菌。在一些其他实施方案中，蛋白体可以是佐剂和抗原递送组合物。在优选实施方案中，免疫原性组合物包含一种或多种冠状病毒抗原和佐剂，其中佐剂包含Projuvant或Protollin。如本文描述，冠状病毒抗原可以从病毒颗粒、受冠状病毒感染的细胞，或者从重组来源分离和/或可以包含例如，(去污剂)分裂抗原。
在一些实施方案中，免疫原性组合物还包含第二种免疫刺激剂，如脂糖。从而，可以制备佐剂以包括额外的免疫刺激剂。例如，Projuvant可以与脂糖混合以提供OMP-LPS佐剂。从而，OMP-LPS(Protollin)佐剂可以包含两种组分。第一种组分包括从革兰氏阴性细菌，如脑膜炎奈瑟氏菌制备的蛋白体(即，Projuvant)的外膜蛋白制备物，第二种组分包括脂糖制备物。脂糖可以如美国专利申请号2001/0053368和2003/0044425中描述的制备。还预期第二种组分可以包括脂类、糖脂、糖蛋白、小分子等等，和其组合。如本文描述，OMP-LPS佐剂的两种组分可以以特定的初始比例组合(混合或配制)以优化组分之间的相互作用，导致用于制备免疫原组合物的组分的稳定结合和配制。该方法一般包括将组分在所选的去污剂溶液(例如，EmpigenBB、TritonX-100或者Mega-10)中混合，然后实现OMP和LPS组分的复合物形成，而通过透析或者渗滤/超滤方法减小预定的去污剂的量，优选浓度。两种组分的混合、共沉淀或者冻干也可以用于实现足够和稳定的结合、组合物，或者制剂。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含一种或多种冠状病毒抗原和佐剂，其中佐剂包含Projuvant(即，蛋白体)和脂糖。
在一个具体实施方案中，作为总蛋白体蛋白质的重量百分数的最终脂糖含量可以为约1％到约500％，更优选约10％到约200％，或者约30％到约150％。另一个实施方案包括佐剂，其中从脑膜炎奈瑟氏菌制备蛋白体并且从弗氏志贺氏菌或者类志贺氏毗邻单胞菌制备脂糖，最终的脂糖含量为总蛋白体蛋白质重量的约50％到150％。在另一实施方案中，制备蛋白体，内源智寡糖(LOS)的含量为总OMP的约0.5％到约5％。在另一实施方案中，蛋白体的内源脂糖为约12％到约25％，在另一实施方案中，内源脂糖为总OMP的约15％到约20％。本公开还提供了含有来自任何革兰氏阴性细菌的脂糖的组合物，脂糖可以来自与蛋白体的来源相同的革兰氏阴性细菌物种或者可以来自不同的细菌物种。
在一些实施方案中，免疫原性组合物中蛋白体或者Protollin与冠状病毒抗原的比率大于1∶1，大于2∶1，大于3∶1或大于4∶1。在其他实施方案中，免疫原性组合物中蛋白体或者Protollin与冠状病毒抗原的比率为约1∶1、2∶1、3∶1或4∶1。该比率可以为8∶1或者更高。在其他实施方案中，免疫原性组合物的蛋白体或者Protollin与冠状病毒抗原的比率为约1∶1到约1∶500，和至少1∶5，至少1∶10，至少1∶20，至少1∶50，或至少1∶100，或至少1∶200。Protollin∶冠状病毒抗原比率为1∶2到1∶200的一个优势是可以显著减少基于蛋白体的佐剂的量而不显著影响冠状病毒抗原引起免疫应答的能力。
在另一实施方案中，组合物包含与蛋白体或者Protollin组合(混合或配制)的一种或多种冠状病毒S蛋白免疫原，其中S蛋白免疫原包含与SEQ ID NO2或者其片段相同或者有至少80％同一性(其包括至少85％、90％或95％，和80％到100％之间的任一百分数)的氨基酸序列，并且其中S蛋白免疫原或者其片段具有引起针对冠状病毒感染的保护性免疫应答的表位。示例性S蛋白免疫原包含如SEQ ID NO2中给出的氨基酸序列或者由SEQ ID NO2组成。在其他实施方案中，S蛋白免疫原是SEQ ID NO2的片段，该片段包含与选自SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24和SEQ ID NO26的氨基酸序列相同或有至少80％同一性(其包括至少85％、90％或95％，和80％到100％之间的任一百分数)的氨基酸序列。
在其他实施方案中，免疫原性组合物包含一种或多种冠状病毒N蛋白免疫原、其片段、或片段和佐剂，其中该佐剂包含蛋白体或者Protollin。在一些实施方案中，N蛋白免疫原包含SEQ ID NO28中给出的氨基酸序列，在一些其他实施方案中，该组合物包含N蛋白免疫原变体，该变体具有与SEQ ID NO28中给出的氨基酸序列有至少80％同一性(其包括至少85％、90％或95％，和80％到100％之间的任一百分数)的序列。用于这些免疫原性组合物的示例性N蛋白免疫原或者其变体包括为SEQ ID NO28的片段的氨基酸序列并且例如，包含SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQID NO34、SEQ ID NO36或SEQ ID NO38，或者与这些序列具有至少80％同一性(其包括至少85％、90％或95％，和80％到100％之间的任一百分数)的序列。
在另一实施方案中，免疫原性组合物包含至少一种(一种或多种)冠状病毒S免疫原、其片段或变体和至少一种(一种或多种)冠状病毒N免疫原、其片段或变体，和佐剂，其中佐剂包含Projuvant或Projuvant和脂糖。
备选地，如本文描述的任一S或N蛋白免疫原或者S和N蛋白免疫原的任一组合可以与脂质体组合(混合或配制)在免疫原性组合物中。优选地，含有一种或多种冠状病毒免疫原的脂质体还包含Deinococcusradiodurans脂类或者α-半乳糖基磷脂酰甘油烷基胺。脂质体中此类脂类的添加可以通过增强保护性免疫而增强冠状病毒疫苗组合物的功效。
本发明的冠状病毒多肽和免疫原可以还包括共价连接的疏水部分。疏水部分可以例如，是如美国专利号5,726,292中公开的氨基酸序列或者脂类。具有SEQ ID NO2中给出的序列的天然发生的冠状病毒S蛋白和重组表达的S蛋白含有作为疏水部分的疏水跨膜结构域(从SEQ ID NO2的氨基酸1195到约1240)与S蛋白免疫原片段(例如，SEQ ID NOS16或18可以具有来自与其融合的S蛋白的疏水跨膜结构域)或者N蛋白免疫原(例如，SEQ ID NOS30或32可以具有来自与其融合的S蛋白的疏水跨膜结构域)。在一个实施方案中，冠状病毒组合物(例如，疫苗组合物)包含与蛋白体(见，例如美国专利号5,726,292和5,985,284)或Protollin(见，例如美国专利申请号2003/0044425)组合、混合、复合或者配制的冠状病毒S蛋白或者N蛋白免疫原，或者其变体，其中S或者N蛋白免疫原还包含疏水部分或者足。当与蛋白体组合时，S或者N蛋白免疫原优选包括疏水部分，其可以由疏水氨基酸序列或者脂类(如本文所用的，脂类指溶解性特征，并且因此包括烷基、芳烷基、芳基、脂肪酸、甘油酯和甘油醚、磷脂、鞘脂、长链醇、类固醇、维生素等等)组成。在一个实施方案中，S蛋白的疏水部分(例如，跨膜结构域)可以融合到冠状病毒N蛋白免疫原。在一些其他实施方案中，具有或不具有疏水部分的S或者N蛋白免疫原可以还含有第二种氨基酸序列以形成融合蛋白，其中第二种氨基酸序列是标记、载体或者酶，如本文所述。在其他实施方案中，S和N免疫原可以组合在免疫原性组合物中，作为分离的组分或者融合而形成杂种的、多价免疫原，其具有或不具有疏水部分，并且还具有或备选地具有如本文描述的第二种氨基酸序列。
在其他实施方案中，免疫原性组合物可以包含(Projuvant或Protolli)，或者还包含组分(例如，受体配体)，其能够通过与疫苗受体的一种或多种宿主细胞产生的某些受体(例如，Toll样受体，TLR)相互作用而刺激宿主免疫应答。根据一个实施方案，包含冠状病毒蛋白质的免疫原性表位的组合物可以含有能够与Toll样受体(TLR)相互作用的多肽表位，从而促进先天性免疫应答，其可以引起或不引起随后的适应性免疫应答。
先天性免疫应答是非特异的保护性免疫应答，其不是依赖特定抗原或者抗体的应答(即，不涉及T细胞和/或B细胞的克隆扩充)并且可以由本文描述的多种抗原、免疫原或者冠状病毒的任一种引起。本文描述的免疫刺激组合包含蛋白体和脂糖(Protollin)，它们的任一种或者两种都可以引起非特异保护性应答。不被理论束缚，本文公开的疫苗组合物或制剂的一种或多种组分可以与Toll样受体(TLR)相互作用，Toll样受体与疫苗接受者的先天性或适应性免疫应答有关。描述了至少10中TLR(见，例如，Takeda等人，Annu.Rev.Immunol.21335，2003)。已经鉴定了一种或多种配体与一些TLR相互作用并随后将TLR激活，TLR8和TLR10是例外。脑膜炎奈瑟氏菌的一些外膜蛋白质，例如OMP2(也称作Por B)与TLR2相互作用，而多数但不是所有革兰氏阴性细菌的LPS与TLR4相互作用。因此，本文描述的可以促进生物学效应的疫苗组合物或制剂的一种活性包括激活TLR2和TLR4的一种或两种。其他TLR(不同于TLR2和TLR4)的活化可以发挥相似的功能或者进一步增强所表达的细胞因子的定性或者定量图谱，并且可以与宿主Th1/Th2免疫应答结合。还预期除了LPS和PorB的TLR配体可以单独使用或者组合使用以激活TLR2或者TLR4。预期一种或多种TLR的定性或定量激活引起、实现或者影响Th1(1型)或Th2(2型)免疫应答的相对刺激(平衡或不平衡的)，伴随或不伴随着体液抗体应答。与除了TLR2和TLR4之外的TLR相互作用的配体还可以用于本文描述的疫苗组合物中。此类疫苗组分可以单独或者组合用于影响足够治疗或者保护免于病毒感染的宿主免疫应答的产生，如本文所述。此类TLR和结合的配体是本领域已知的，其包括表1中给出的那些。
表1.TLR和配体
在包含如本文描述的冠状病毒S蛋白免疫原、N蛋白免疫原或者至少一种S蛋白免疫原和N蛋白免疫原的疫苗组合物中加入、组合或配制的TLR配体组合的任一种或者任意组合可以激活所鉴定的TLR(表1)的任一种或任意组合。使用适于施用途径(例如，鼻内、注射等等)的浓度的任一种或多种TLR配体，可以完成一种或多种TLR的刺激。因此，疫苗组合物或者制剂可以包括任何一种或多种TLR配体，包括与抗原性(免疫原性)疫苗组分组合或配制的重组配体(融合蛋白或者其片段)，加入或不加入外源脂糖组分。
有效的免疫应答依赖于先天性和适应性免疫应答之间的通讯。T淋巴细胞对于通过控制效应分子的释放协调适应性免疫应答是重要的。例如，T辅助(Th)1细胞产生白介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、和γ干扰素(IFN-γ)，它们对于产生细胞介导的免疫是重要的(Mosmann等人，J.Immunol.1362348，1986；Street和Mosmann，FASEB J.5171，1991)。相比，Th2细胞产生IL-4、IL-13、IL-5、IL-9、IL-6和IL-10。这些效应分子可以根据本领域技术人员通常实践的方法从来自用本文描述的冠状病毒免疫原的任一种免疫的受试者或宿主的生物样品中容易地测量。
细胞介导的免疫(CMI)应答包括确定免疫应答是否已经从主要是Th2的应答偏移到平衡的或者混合的Th1和Th2应答(由于Th1应答的增加或者Th1的伴随增加和Th2应答的减小)，或者偏移到主要是Th1的应答。类似地，可以确定从Th1应答向平衡的或混合的Th1/Th2应答或者增加的或者主要Th2应答的偏移。例如，可以根据本文描述的和本领域实践的方法，包括ELISA、ELISPOT和流式细胞术(用于测量细胞内细胞因子)测定Th1细胞因子，如IFN-γ、IL-2和TNF-β，和2型细胞因子，如IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13的水平。1型应答预测其他CMI相关的应答的诱导，如细胞毒性细胞(CLT)的发生，所述应答表明Th1免疫性。免疫应答的抗原特异性引起或刺激导致的免疫细胞增殖和克隆扩充可以如下测定分离淋巴细胞，如脾细胞或者来自淋巴结的细胞，用抗原刺激所述细胞，并测量细胞因子的产生、细胞增殖和/或细胞存活，如通过氚化胸腺嘧啶的掺入或者非放射性测定法，如MTT测定法等等。
本文描述的免疫刺激性、免疫原性和/或免疫调节组合物可以诱导特异性抗抗原免疫应答，包括下面的一种或多种。可以引起、诱导或者刺激特异体液应答，其导致产生抗原特异性抗体，所述抗体可以包括任一种类别的免疫球蛋白，包括IgG、IgA、IgM和/或IgE，和这些类别的同种型。例如，血清、鼻洗液、肺灌洗液和粘膜分泌物(尤其是IgA)或者其他组织中特异IgM、IgG和IgA的存在可以通过本文描述和本领域已知的多种免疫测定法的任一种测定，所述免疫测定法包括但不限于，ELISA、免疫印迹、放射免疫印迹、免疫组织化学、荧光激活的细胞分选(FACS)、Ochterlony等等。为了检测免疫测定中的抗原或者冠状病毒特异的抗体，可以允许生物学样品与经纯化、分离、部分分离的抗原或者其片段相互作用或者接触，或者与病毒相互作用或接触，所述病毒可以是被固定的(例如，用乙醇或者甲醛)或者未固定或非变性的。粘膜分泌物包括从呼吸道，包括鼻咽和肺收集的分泌物。还可以进行功能测定法，如抗原特异性抗体促进微生物的吞噬或者调理作用，或者防止微生物进入宿主细胞，或者防止微生物如病毒进入、融合到宿主细胞或者在宿主细胞中增殖的能力。此类方法在本文中描述并且由技术人员常规实践。
药物组合物除了至少一种(一种或多种)冠状病毒免疫原或者其融合蛋白之外，将优选包括至少一种药学上可接受的运载体、载体、稀释剂或者赋形剂，和任选地，其他组分。例如，药学上可接受的载体适于与S蛋白免疫原或者其融合蛋白，或者两者或多种S蛋白免疫原或者其融合蛋白的混合物，或者S、N和/或M免疫原或者其融合蛋白的混合物组合物一起施用。治疗用途的药学上可接受的载体是药学领域公知的，例如见Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro，编者，第18版，1990)和CRC Handbook of Food，Drug，andCosmetic Excipients，CRC Press LLC(S.C.Smolinski，ed.，1992)。组合物还可以包括增稠剂、缓冲剂、溶剂、湿润剂、防腐剂、螯合剂，和佐剂，等等，和其组合。
药学上可接受的盐指从此类化合物与有机或无机酸的组合得到的化合物的盐(酸加成盐)或者与有机或无机碱的组合得到的化合物的盐(碱加成盐)。化合物可以以游离的碱或盐的形式使用。
此外，药物组合物可以还包括稀释剂，如水或磷酸缓冲盐水(PBS)。在一些实施方案中，稀释剂是PBS，其经配制以向宿主递送生理学的最终磷酸盐浓度和最终氯化钠浓度。PBS的最终磷酸盐浓度可以为约0.1mM到约50mM，更优选约0.5mM到约40mM，甚至更优选约1mM到约25mM，最优选约2.5mM到约10mM；最终盐浓度范围为约100mM到约200mM，最优选约125mM到约175mM。优选地，最终PBS浓度为约5mM磷酸盐和约150mM盐(如NaCl)。在一些实施方案中，任一种前述药物组合物包含如本文描述的并且优选为无菌的冠状病毒免疫原的混合物。
通过在无菌条件下制备组合物和/或通过使用本领域可利用的方法将组合物最终灭菌使得本文描述的组合物无菌。许多药物生产出来都是无菌的并且该标准由USP XXII<1211>定义。该该实施方案中，灭菌可以通过工业中接受的和USP XXII<1211>中列出的许多方法完成，所述方法包括气体灭菌、离子辐射或者过滤。通过也在USP XXII<1211>中定义的所称作的无菌操作保持无菌。用于气体灭菌的可接受的气体包括环氧乙烷。用于电离辐射方法的可接受的辐射类型包括γ辐射，例如，来自钴60源和电子束。γ辐射的典型剂量是2.5MRad。合适时，可以使用具有合适的孔径，例如，0.22μm和合适的材料，例如Teflon的过滤器进行过滤。术语“USP”指美国药典(Rockville，MD)。
本文还描述了治疗和/或预防冠状病毒感染的方法，其包括对需要其的受试者施用包含至少一种冠状病毒S蛋白免疫原和药学上可接受的载体、稀释剂或者赋形剂的组合物，其中S蛋白免疫原包含与SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24或SEQ ID NO26相同或者具有至少80％同一性(其包括至少85％、90％，或者95％或者80％到100％之间的任一百分数)的氨基酸序列，并且其中S蛋白免疫原具有引起保护性免疫应答的表位，该应答是体液免疫应答(包括例如，粘膜IgA、系统IgA、IgG、IgM应答)和/或细胞介导的免疫应答。将S蛋白免疫原组合物以足够引起对所施用的S蛋白免疫原或者免疫原或者其变体特异的免疫应答的剂量施用。在一些实施方案中，被预防或治疗的感染可以通过组1冠状病毒、组2冠状病毒、组3冠状病毒、SARS组冠状病毒，或者其组合导致。
在其他实施方案中，用于治疗和/或预防冠状病毒感染的方法包括对需要其的受试者施用包含至少一种冠状病毒N蛋白免疫原和药学上可接受的载体、稀释剂或者赋形剂的组合物，其中N蛋白免疫原包含与SEQ IDNO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36、或者SEQ ID NO38相同或者具有至少80％同一性(其包括至少85％、90％，或者95％或者80％到100％之间的任一百分数)的氨基酸序列，并且其中N蛋白免疫原具有引起保护性免疫应答体液免疫应答(包括例如，粘膜IgA、系统IgA、IgG、IgM应答)和/或细胞介导的免疫应答)的表位。将N蛋白免疫原组合物以足够引起对所施用的N蛋白免疫原或者其变体特异的免疫应答的剂量施用。在一些实施方案中，被预防或治疗的感染可以通过组1冠状病毒、组2冠状病毒、组3冠状病毒、SARS组冠状病毒，或者其组合导致。
在其他实施方案中，用于治疗和/或预防冠状病毒感染的方法包括对需要其的受试者施用包含多种冠状病毒免疫原的组合物。所述多种冠状病毒免疫原可以包含至少两种S蛋白免疫原，其中至少两种S蛋白免疫原的每一种包含与SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24和SEQ ID NO26相同或具有至少80％同一性(其包括至少85％、90％，或者95％或者80％到100％之间的任一百分数)和选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24和SEQ IDNO26的氨基酸序列。在另一实施方案中，所述多种冠状病毒免疫原可以包含至少两种N蛋白免疫原，其中至少两种N蛋白免疫原的每一种包含与SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36、或者SEQ ID NO38相同或者具有至少80％同一性(其包括至少85％、90％，或者95％或者80％到100％之间的任一百分数)和选自SEQ ID NO28、SEQID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36、或者SEQ ID NO38的氨基酸序列。在另一实施方案中，用于治疗和/或预防冠状病毒感染的方法包括多种冠状病毒免疫原，其包含至少一种如本文描述的S蛋白免疫原和至少一种如本文描述的N蛋白免疫原。在其他实施方案中，用于治疗和/或预防冠状病毒感染的方法可以包括多种冠状病毒免疫原，其可以选自S蛋白免疫原、N蛋白免疫原、冠状病毒M蛋白免疫原、冠状病毒E蛋白免疫原，并且包括其任一组合。优选地，多种免疫原的每一种免疫原具有能够引起保护性免疫应答如体液应答(例如，引起中和性抗体)和/或细胞介导的免疫应答的表位，并且与药学上可接受的载体、稀释剂或者赋形剂组合。SARS冠状病毒M蛋白免疫原可以具有如GenBank检索号AAU07933中提供的氨基酸序列，其由GenBank检索号AY702026中给出的核苷酸序列编码。编码M蛋白的核苷酸序列和所编码的蛋白质的氨基酸序列可以在可公开利用的数据库的多个条目中发现，所述数据库提供了完整SARS冠状病毒基因组的核苷酸序列和编码的氨基酸序列。冠状病毒S蛋白和冠状病毒N蛋白的额外的氨基酸序列和编码这些蛋白质的核苷酸序列可以在公开利用的数据库中提供的SARS冠状病毒基因组序列中找到。在一些实施方案中，免疫原组合物可以对组1冠状病毒、组2冠状病毒、组2冠状病毒、SARS组冠状病毒或者它们的组合特异。
适于用冠状病毒免疫原组合物或者制剂治疗的受试者或者宿主可以通过患病的危险性的成熟的指标或者通过现有疾病的成熟的标志来鉴定。例如，感染的指征包括发热、干咳、呼吸困难(呼吸急促)、头痛、低氧血症(低血氧浓度)、淋巴细胞减少(减少的淋巴细胞数)、轻微升高的转氨酶水平(表明肝脏损伤)、微生物阳性培养物、炎症，等等。可以用如本文描述的冠状病毒免疫原疫苗治疗或预防的感染包括冠状病毒导致或引起的感染，其中感染是原发性的、继发性的或者条件性的。冠状病毒的实例包括这些病毒的任一亚型、株、抗原性变体、等等，包括SARS冠状病毒。作为实例，SARS感染的特征是流感样症状，包括高热、肌痛、干燥和非产生性呼吸困难、淋巴细胞减少，和胸部射线照相术上的浸润。2002-2003年的SARS流行期间的死亡率为约10％，但是在老年人中高达50％(Stadler等人，Nat.Rev.1209，2003)。
含有本发明的一种或多种冠状病毒免疫原的药物组合物可以允许将组合物施用于受试者，如人或者非人动物的任意形式。例如，可以将S或者N蛋白免疫原、融合蛋白和/或多价组合物制备并以液态溶液施用或者制备为固体形式(例如，冻干的)，其可以以固体形式施用，或者重悬浮在液体中用于施用。制备或者配制杂种多肽组合物使得当对受试者或患者施用该组合物时，允许其中所含的活性成分是可以生物利用的，或者通过缓释而可以生物利用。将施用于受试者或患者的组合物采取一种或多种剂量单位的形式；例如，片剂可以是单个剂量单位，气溶胶形式的一种或多种本发明化合物的容器可以容纳多个剂量单位。在一些优选的实施方案中，包含冠状病毒免疫原或者本发明的免疫原的混合物的任一种前述药物(治疗)组合物包含在容器中，优选在无菌容器中。
在一个实施方案中，治疗(药物)组合物经鼻施用，其中冠状病毒免疫原或者混合物组合物可以被细胞，如位于鼻相关的淋巴组织的细胞吸收。其他典型的施用途径包括但不限于，经肠、肠胃外、经皮/经粘膜、经鼻和吸入途径。本文所用的术语“经肠”是一种施用途径，其中免疫原性组合物通过胃肠道或者口腔粘膜，包括口、肠和舌下吸收。本文所用的“肠胃外”描述了绕过胃肠道的施用途径，包括动脉内、皮内、肌内、鼻内、眼内、腹膜内、静脉内、皮下、粘膜下、和阴道内注射或者灌注技术。本文所用的术语“经皮/经粘膜”是这样的施用途径，其中免疫原性组合物通过皮肤施用，包括局部施用。术语“经鼻”或“吸入”包括这样的施用技术，其中将免疫原性组合物导入肺树(pulmonary tree)，包括肺内或者经肺。在一个实施方案中，本发明的组合物经鼻施用。
在另一实施方案中，提供了治疗和/或预防冠状病毒感染的方法，该方法包括施用抗体，该抗体特异结合冠状病毒抗原并且促进病毒的中和(即，降低或者消除病毒感染性)，促进失活，防止或抑制病毒装配，和/或预防或抑制病毒核酸复制、转录或者翻译。特异结合冠状病毒抗原的抗体可以通过本文描述和本领域实践的许多方法的任一种来产生和制备。
在一个实施方案中，通过一种方法产生特异结合冠状病毒蛋白质的许多(至少两种或多种)分离的抗体，所述方法是预防冠状病毒感染的方法，该方法包括以足够引起对至少一种冠状病毒蛋白质免疫原特异的抗体的剂量对受试者施用含有至少一种冠状病毒免疫原(如S蛋白免疫原、N蛋白免疫原，和/或M蛋白免疫原)的组合物，其中所述蛋白质免疫原具有引起保护性免疫应答的表位，所述免疫应答优选包括体液应答。生物样品，如血清、淋巴、鼻咽洗出液、血液、腹水、肺洗出液，或者其他液体可以从宿主得到并且根据技术人员通常实践的方法，如亲和纯化方法分离对冠状病毒蛋白质特异的抗体。例如，通过将生物样品与冠状病毒蛋白质或其片段的来源接触，可以从生物样品的其他抗体和组分除去或分离对冠状病毒蛋白质特异的抗体。在另一实施方案中，可以从用至少一种冠状病毒蛋白质免疫原免疫的宿主得到血清并富集特定免疫球蛋白类别，如IgA或IgG。用于制备此类免疫血清的方法是本领域公知的。优选从与施用血清的物种相同的宿主物种分离免疫血清。在一些实施方案中，可以从用组1冠状病毒、或组2冠状病毒、或组3冠状病毒、或SARS组冠状病毒或者它们的组合免疫的受试者得到抗体，从而从宿主分离的抗体或得到的血清包含至少一种对组1冠状病毒、或组2冠状病毒、或组3冠状病毒、或SARS组冠状病毒特异的抗体。生物样品还可以含有特异结合来自一组以上的冠状病毒的抗原的一种或多种抗体。
在另一实施方案中，用于治疗或者预防冠状病毒感染的方法包括对受试者施用包含药学上可接受的载体和如本文描述的多种抗体的组合物。此外，有危险获得或者发生冠状病毒感染的受试者可以施用特异结合第一种冠状病毒蛋白质免疫原的多种抗体，在此之前、同时或者之后施用一种组合物，该组合物包含与所述冠状病毒蛋白质免疫原(第一种冠状病毒S蛋白免疫原或者第一种冠状病毒N蛋白免疫原)不同的至少一种冠状病毒蛋白质免疫原(例如，第二种冠状病毒S蛋白免疫原或者第二种冠状病毒N蛋白免疫原或者第二种冠状病毒S蛋白免疫原和第二种冠状病毒N蛋白免疫原)。
如本文所述，冠状病毒S蛋白免疫原，或者其变体(其可以是第一种或第二种免疫原或者第三种S蛋白免疫原，等等)包含与选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO1 4、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24和SEQ ID NO26的序列相同或者具有至少80％同一性(其包括至少85％、90％或者95％或者80％到100％之间的任一百分数)的氨基酸序列。还如本文描述的，冠状病毒N蛋白免疫原(其可以是第一种或第二种免疫原或者第三种N蛋白免疫原等等)包含与选自SEQ ID NO28、SEQID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36或SEQ ID NO38的氨基酸序列相同或者具有至少80％同一性(其包括至少85％、90％或者95％或者80％到100％之间的任一百分数)的氨基酸序列。
在其他实施方案中，可以施用冠状病毒M蛋白质免疫原或者冠状病毒E蛋白质免疫原，或者其组合以引起免疫应答，其中每种不同的免疫原，包括S蛋白免疫原或者N蛋白免疫原具有至少一个引起保护性免疫应答，如体液应答或者细胞介导的免疫应答的表位。此类组合物可以还包含如本文描述的药学上可接受的载体、稀释剂或者赋形剂。从而如本文所述，可以被动地提供对一种或多种冠状病毒免疫原特异的抗体，而将受试者接种以主动引起对一种或多种不同的冠状病毒免疫原特异的抗体。在另一实施方案中，对一种或多种冠状病毒免疫原特异的抗体可以被动地提供，而受试者用一种或多种相同以及一种或多种不同的冠状病毒免疫原接种以主动地引起特异结合一种或多种冠状病毒抗原的抗体。
在另一实施方案中，提供了特异结合本文描述的冠状病毒蛋白质免疫原和其变体的抗体。冠状病毒蛋白质抗原(免疫原)，如S蛋白免疫原和N蛋白免疫原，或者这些免疫原的变体和片段用于引起对S或N蛋白免疫原和其变体上存在的至少一个表位特异的抗体。在优选实施方案中，抗体结合冠状病毒S或者N蛋白质上存在的特异保护性表位。抗体包括多克隆抗体、单特异性抗体、单克隆抗体、抗独特型抗体、和其抗原结合片段，如F(ab’)2、Fab’、Fd、Fv和Fab片段，和重组或合成产生的抗体或抗原结合片段。此类抗体掺入允许单克隆抗体特异结合的可变区，这意味着抗体能够选择性结合来自组1、组2、组3或者SARS组冠状病毒的冠状病毒S或者N肽或多肽。“对…特异”、“免疫特异的”或者“特异结合”是指蛋白质(例如，抗体)能够特异(选择性)结合核酸分子编码的多肽或肽，该核酸分子编码来自组1、2、3或者SARS冠状病毒的冠状病毒S或N蛋白，或者特异结合来自组1、2、3或者SARS冠状病毒的合成的冠状病毒S或者N蛋白。在再一个实施方案中，特异结合冠状病毒蛋白质的啮齿动物单克隆抗体(根据本文描述的和本领域已知的方法制备)可以根据本文描述和本领域已知的方法人源化或者使得完全为人的。
抗体与特异抗原的“结合”通常包括静电相互作用、氢键、范德瓦尔斯相互作用，和疏水相互作用。这些相互作用的任一种或者它们的任一组合可以在抗体和其抗原之间的结合中起作用。此类抗体通常以至少104、至少105、至少106、至少107、或至少108的亲和常数(Ka)结合抗原。使用公知的技术(见Scatchard，Ann.N.Y.Acad.Sci.51660-672，1949)和通过表面等离子体共振(SPR；BIAcoreTM，Biosensor，Piscataway，N.J；见，例如Wolff等人，Cancer Res.532560-2565(1993))可以确定亲和常数。此外，一般可以确定抗体对冠状病毒蛋白免疫原的结合性质并使用免疫检测方法评估，所述方法包括例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀、免疫印迹、对流免疫电泳、放射免疫测定法、点印迹测定法、抑制或者竞争测定法，等等，其可以由本领域技术人员容易地进行(见，例如，美国专利号4,376,110和4,486,530；Harlow等人，AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))。
本文所用的术语“抗体”包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括，例如，单链抗体、嵌合的、双功能的和人源化的抗体，以及其抗原结合片段。此类非天然发生的抗体可以使用固相肽合成构建，可以重组产生，或者可以例如，通过筛选由可变重链和可变轻链组成的组合文库得到(Huse等人，Science 2461275-1281(1989))。制备例如嵌合的、人源化的、CDR移植的、单链和双功能抗体的这些和其他方法是本领域已知的(见，例如，Winter和Harris，Immunol.Today 14243，1993；Ward等人，Nature 341544，1989；Harlow和Lane，Ant ibodiesA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1992；Borrabeck，Antibody Engineering，第二版，Oxford Univ.Press，1995；Hilyard等人，Protein EngineeringA practical approach，IRL Press，1992)。
本领域技术人员可以容易地从多种温血动物产生多克隆抗体，所述温血动物包括马、奶牛、山羊、绵羊、狗、鸡、火鸡、兔、小鼠、仓鼠，或者大鼠。简言之，将所希望的S蛋白免疫原或者其变体或者N蛋白免疫原或者其变体，或者冠状病毒免疫原或者其变体的混合物通过肠胃外、腹膜内、肌内、眼内，或者皮下注射或者经鼻施用以免疫动物。通过使用佐剂，如蛋白体、Protollin、明矾、Ribi佐剂、和弗氏完全或不完全佐剂，可以增加目的多肽的免疫原性。在几周内几次加强免疫后，收集少量血清样品并测试对所希望的免疫原的反应性。一旦动物血清中特异性抗体的效价关于对S或者N蛋白免疫原或者其变体的反应性达到了平台，那么就可以通过周期性的，如每周取血，或者对动物放血，可以容易地得到更大量的多克隆免疫血清。然后可以从此类抗血清，例如，通过亲和纯化，使用固定在合适的固相支持体上的蛋白A或者蛋白G，可以从此类抗血清纯化多克隆抗体(见，例如，Coligan，上文，p.2.7.1-2.7.12；2.9.1-2.9.3；Baines等人，Purification of Immunoglobulin G(IgG)，in Methods inMolecular Biology，109-104(The Humana Press，Inc.(1992))。备选地，可以进行亲和层析，其中抗血清特异结合的冠状病毒蛋白抗原(免疫原)，或者对特定免疫的动物物种的Ig恒定区特异的抗体固定在合适的固相支持体上。
还可以制备特异结合冠状病毒蛋白抗原的单克隆抗体和杂交瘤，所述杂交瘤是永生的真核细胞系的实例，其产生具有希望的结合特异性的单克隆抗体，例如，使用Kohler和Milstein(Nature，256495-497；1976，Eur.J.Immunol.6511-519(1975))的技术和其改进技术(见，例如，Coligan等人(eds.)，Current Protocols in Immunology，12.5.1-2.6.7(John Wiley & Sons 1991)；美国专利号4,902,614、4,543,439和4,411,993；Monoclonal Antibodies，HybridomasA NewDimension in Biological Analyses，Plenum Press，Kennett等人(eds.)(1980)；和AntibodiesA Laboratory Manual，Harlow and Lane(eds.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988)；还参见例如Brand等人，Planta Med.70986-92(2004))可以制备所述杂交瘤。将动物——例如，大鼠、仓鼠、或者优选小鼠-用如上制备的免疫原免疫。可以在最初注射(注射可以通过如本文描述的和本领域已知的任一种途径施用用于产生多克隆抗体)后和/或加强注射后通过得到血清样品并使用本领域已知的和本文描述的几种免疫检测方法的任一种监视特异抗体产生的存在。从产生结合免疫原的抗体的动物除去淋巴样细胞，通常除去来自脾脏或者淋巴结的细胞，以得到B淋巴细胞(形成抗体的细胞的淋巴样细胞)，然后可以通过与药物敏化的骨髓瘤(例如，浆细胞瘤)细胞融合配偶体(例如，不能表达内源Ig基因产物，例如，P3X63-Ag 8.653(ATCC No.CRL 1580)；NSO，SP20)融合而永生化。所得杂交瘤细胞可以按照单克隆抗体领域中已知的方法培养、分离和分析。将杂交瘤克隆(例如，通过有限稀释克隆或者通过软琼脂空斑分离)克隆并选择和培养产生对抗原特异的抗体的阳性克隆。产生对冠状病毒免疫原具有高亲和性和特异性的单克隆抗体的杂交瘤是优选的。
可以从杂交瘤培养物的上清液分离单克隆抗体。用于产生鼠单克隆抗体的备选方法是将杂交瘤细胞注射到同基因小鼠的腹膜腔，例如，已经经处理的小鼠(例如，降植烷引发的)的腹膜腔以促进含有单克隆抗体的腹水的形成。通过常规技术，如层析(例如，大小排阻、离子交换)、凝胶过滤、沉淀、萃取等等(见，例如，Coligan，上文，p.2.7.1-2.7.12；2.9.1-2.9.3；Baines等人，Purification of Immunoglobulin G(IgG)，in Methods inMolecular Biology，109-104(The Humana Press，Inc.(1992))可以除去污染物。例如，使用基于单克隆抗体的特定性质(轻链或重链同种型、结合特异性，等等)选择合适的配体，通过亲和层析可以纯化抗体。固定在固相支持体上的合适的配体的实例包括蛋白A、蛋白G、和抗恒定区(轻链或者重链)抗体、抗独特型抗体、特异冠状病毒免疫原，或者其衍生物。
抗冠状病毒蛋白质抗体可以是人单克隆抗体。通过本领域技术人员熟悉的任一种技术可以产生人单克隆抗体。此类方法包括，但不限于人外周血细胞(例如，含有B淋巴细胞)的EB病毒(EBV)转化、人B细胞的体外免疫、来自携带所插入的人免疫球蛋白基因的免疫的转基因小鼠的脾细胞的融合、从人免疫球蛋白V区噬菌体文库分离，或者本领域已知的和基于本文公开的其他方法。用于从转基因小鼠得到人抗体的方法由例如，Green等人，Nature Genet.713(1994)；Lonberg等人，Nature 368856(1994)；Taylor等人，Int.Immun.6579(1 994)；美国专利号5,877,397；Bruggemann等人，Curr.Opin.Biotechnol.8455-58(1997)；Jakobovits等人，Ann.N Y.Acad.Sd.764525-35(1995)描述。可以免疫转基因小鼠得到人单克隆抗体，所述转基因然后可以产生对所述抗原特异的人抗体。经免疫的转基因小鼠的淋巴样细胞可以用于产生对所述抗原特异的人抗体。根据本文描述的方法，经免疫的转基因小鼠的淋巴样细胞可以用于产生分泌人抗体的杂交瘤。含有人抗体的多克隆血清还可以从经免疫的动物的血液得到。
用于产生人冠状病毒蛋白质特异的单克隆抗体的另一种方法包括通过EBV转化永生化人外周血细胞。见，例如，美国专利号4,464,456。产生抗冠状病毒蛋白质抗体的类淋巴母细胞细胞系的稳定性可以通过根据本领域已知的方法将转化的细胞系与鼠骨髓瘤融合以产生小鼠-人杂种细胞系来提高(见，例如，Glasky等人，Hybridoma 8377-89(1989))。在一些实施方案中，选择产生抗冠状病毒蛋白质抗体的B细胞，并且根据本领域已知的分子生物学技术从B细胞克隆轻链和重链可变区(WO92/02551；美国专利号5,627,052；Babcook等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 937843-48(1996))。
还可以制备对冠状病毒蛋白质特异的嵌合抗体，包括人源化抗体。嵌合抗体具有来自第一种哺乳动物物种的至少一个恒定区结构域和来自第二种、不同的哺乳动物物种的至少一个可变区结构域。见，例如，Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-55(1984)。在一个实施方案中，通过将编码来自非人单克隆抗体的至少一个可变区结构域，如来自小鼠、大鼠或者仓鼠单克隆抗体的可变区的多核苷酸序列克隆到含有编码至少一种人恒定区的核酸序列的载体中，可以构建嵌合抗体(见，例如，Shin等人，Methods Enzymol.178459-76(1989)；Walls等人，NucleicAcids Res.212921-29(1993))。
非人/人嵌合抗体可以进一步遗传工程化以产生“人源化”的抗体。此类人源化抗体可以包含来自非人哺乳动物物种的免疫球蛋白的许多CDR，至少一个人可变构架区，和至少一个人免疫球蛋白恒定区。人源化可以在一些实施方案中提供这样的抗体，其当与例如冠状病毒蛋白质结合性可变区从其得到的非人单克隆抗体，或者如上述的具有此类V区和至少一个人C区的嵌合抗体比较时，对所述特定冠状病毒蛋白质具有降低的结合亲和性。因此，用于设计人源化抗体的有用的策略包括例如，作为阐明并且不作为限制，鉴定与嵌合抗体的非人构架区最同源的人可变构架区。不希望被理论束缚，此类策略可以增加人源化抗体将保持对冠状病毒的特异结合亲和性的可能性，其在一些优选的实施方案中可以是对所述冠状病毒蛋白质基本上相同的亲和性，在一些其他实施方案中可以对该冠状病毒蛋白质具有更大的亲和性(见，例如，Jones等人，Nature 321522-25(1986)；Riechmann等人，Nature 332323-27(1988))。
设计此类人源化抗体因此可以包括例如，通过计算机建模确定CDR环构型和非人源化可变区的结构决定簇，然后将该CDR环和决定簇与已知的人CDR环结构和决定簇比较(见，例如，Padlan等人，FASEB 9133-39(1995)；Chothia等人，Nature，342377-383(1989))。计算机建模还可以用于比较通过与非人可变区的序列同源性选择的人结构模板(见，例如，Bajorath等人，Ther.Immunol.295-103(1995)；EP-0578515-A3)。如果非人CDR的人源化导致结合亲和力降低，那么计算机建模可以帮助鉴定特定氨基酸残基，所述氨基酸残基可以通过定点诱变或其他诱变技术改变以部分地、完全地或者超优化地(即，增加到比非人源化抗体更高的水平)恢复亲和力。本领域技术人员熟悉这些技术并且将容易理解此类设计策略的许多变通方案和修改。
用于制备人源化抗体的另一种方法称作镶嵌(veneering)。镶嵌构架(FR)残基指将来自例如啮齿动物重链或轻链V区的FR残基用人FR残基选择性替换以便提供包含抗原结合部位的异基因分子，所述抗原结合部位保持基本上整个天然FR多肽折叠结构。镶嵌技术是基于如下理解抗原结合部位的配体结合特征主要由抗原结合表面内重链和轻链CDR组的结构和相对排列决定(见，例如，Davies等人，Ann.Rev.Biochem.59439-73，(1990))。从而，当小心地保持CDR结构、它们的相互作用，和它们与剩余的V区结构域的相互作用时，可以保存人源化抗体的抗原结合特异性。通过使用镶嵌技术，容易被免疫系统遇到的外部(即，溶剂易接近的)FR残基用人残基选择性替换以提供杂种分子，该杂种分子包含弱免疫原性、或者基本上非免疫原性的镶嵌表面。镶嵌的方法利用了Kabat等人，在Sequences of Proteins of Immunological Interest，第四版，(U.S.Dept.of Health and Human Services，U.S.Government Printing Office，1987)编著的、更新到Kabat数据库和其他可利用的美国和外国数据库(核酸和蛋白质)的关于人抗体可变结构域的可利用的数据序列。
对于具体应用，可以希望利用特异结合冠状病毒蛋白质的抗体的抗原结合片段。例如，通过抗体的蛋白水解，如根据常规方法通过完整抗体的胃蛋白酶或者木瓜蛋白酶消化，可以得到抗体片段F(ab’)2、Fab、Fab’、Fv和Fd。作为阐明，通过用胃蛋白酶酶促切割抗体以提供称作F(ab’)2的片段，可以产生抗体片段。该片段还用硫醇还原剂进一步切割以产生Fab’单价片段。任选地，用切割二硫键产生的巯基的保护基，可以进行切割反应。备选地，用木瓜蛋白酶酶促切割抗体产生两种单价Fab片段和Fc片段(见，例如，美国专利号4,331,647；Nisonoff等人，Arch.Biochem.Biophys.89230，1960；Porter，Biochem.J.73119，1959；Edelman等人，Methods in Enzymology 1422(Academic Press 1967)；Weir，Handbook of Experimental Immunology，Blackwell Scientific，Boston(1986))。
抗体片段还可以是任意合成的或者基因工程化的蛋白质，其像抗体一样作用，因为它结合特定抗原而形成复合体。例如，抗原片段包括由轻链可变区组成的分离的片段、由重链和轻链的可变区组成的Fv片段、重组单链多肽分子，其中轻链和重链可变区由肽接头连接(scFv蛋白质)，和由模拟高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元。本文描述的抗体优选包含至少一个可变区结构域。
最小识别单元是包含单个互补性决定区(CDR)的抗体片段。通过构建编码目的抗体的CDR的多核苷酸可以得到此类CDR肽。例如，根据本领域技术人员实践的方法，使用产生抗体的细胞的mRNA作为模板，用聚合酶链式反应合成可变区可以制备所述多核苷酸(见，例如，Larrick等人，MethodsA Companion to Methods in Enzymology 2106，(1991)；Courtenay-Luck，″Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies，″in Monoclonal AntibodiesProduction，Engineering and ClinicalApplication，Ritter等人(eds.)，page 166(Cambridge UniversityPress 1995)；和Ward等人，″Genetic Manipulation and Expression ofAntibodies，″in Monoclonal AntibodiesPrinciples and Applications，Birch等人，(eds.)，page 137(Wiley-Liss，Inc.1995))。备选地，使用自动化肽合成仪，可以合成此类CDR肽和其他抗体片段。
根据一些实施方案，本文描述的任一免疫球蛋白分子的非人、人或者人源化重链和轻链可变区可以构建为scFv多肽片段(单链抗体)。见，例如，Bird等人，Science 242423-426(1988)；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sd.USA 855879-5883(1988))。通过将编码scFv多肽的多核苷酸序列与编码多种已知的效应蛋白质的任一种的至少一种核苷酸序列连接在框内，可以产生多功能scFv融合蛋白。这些方法是本领域已知的，并且公开在例如EP-B1-0318554、美国专利号5,132,405、美国专利号5,091,513和美国专利号5,476,786中。作为实例，效应蛋白质可以包括免疫球蛋白恒定区序列。见，例如，Hollenbaugh等人，1995 J.Immunol.Methods 1881-7。效应蛋白质的其他实例是酶。作为非限制性实例，此类酶可以提供用于治疗目的的生物活性(见，例如，Siemers等人，Bioconjug.Chem.8510-19(1997))，或者可以提供可检测的活性用于诊断用途，如许多公知的底物被辣根过氧化物酶催化转化成可检测的产物。
还可以从人免疫球蛋白噬菌体文库、从兔免疫球蛋白噬菌体文库，和/或从鸡免疫球蛋白噬菌体文库鉴定和分离抗体(见，例如，Winter等人，1994 Annu.Rev.Immunol.12433-55；Burton等人，Adv.Immunol.57191-280(1994)；美国专利号5,223,409；Huse等人，Science2461275-81(1989)；Schlebusch等人，Hybridoma 1647-52(1997)和其中引用的参考文献；Rader等人，J.Biol.Chem.27513668-76(2000)；Popkov等人，J.MoI.Biol 325325-35(2003)；Andris-Widhopf等人，J.Immunol.Methods 242159-31(2000))。从非人物种或者非人免疫球蛋白文库分离的抗体可以根据本文描述的和本领域已知的方法基因工程化以“人源化”抗体或者其片段。免疫球蛋白可变区基因组合文库可以用噬菌体载体产生，该载体可以经筛选以选择特异结合冠状病毒蛋白质的Ig片段(Fab、Fv、scFv或者其多聚体)(见，例如，美国专利号5,223,409；Huse等人，Science 2461275-81(1989)；Sastry等人，Proc.Natl.Acad.ScL USA 865728-32(1989)；Alting-Mees等人，Strategies inMolecular Biology 31-9(1990)；Kang等人，Proc.Natl.Acad.ScLUSA 884363-66(1991)；Hoogenboom等人，J Molec.Biol.227381-388(1992)；Schlebusch等人，Hybridoma 1647-52(1997)和其中引用的参考文献；美国专利号6,703,015)。
根据一些实施方案，免疫球蛋白Fab片段可以展示在噬菌体颗粒上(见，例如，美国专利号5,698,426)。重链和轻链免疫球蛋白cDNA表达文库还可以用λ噬菌体，例如，使用λImmunoZapTM(H)和λImmunoZapTM(L)载体制备(Stratagene，La Jolla，California)，(见Huse等人，上文；还参见Sastry等人，上文)。噬菌体展示技术还可以用于选择结合冠状病毒蛋白质的Ig片段或者单链抗体。具有编码此类抗体片段或者相关多肽的候选核酸分子(例如，DNA)可以插入的多克隆位点的合适的载体的实例见例如，McLafferty等人，Gene 12829-36，(1993)；Scott等人，Science249386-390(1990)；Smith等人，Meth.Enzymol 217228-257(1993)；Fisch等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 937761-66(1996))。
在一些其他实施方案中，冠状病毒蛋白质特异性抗体是多聚体抗体片段。有用的方法一般描述于例如，Hayden等人，Curr Opin.Immunol.9201-12(1997)；Coloma等人，Nat.Biotechnol.15159-63(1997)。例如，通过噬菌体技术可以产生多价抗体片段以形成微型抗体(美国专利号5,910 573)或双抗体(Holliger等人，Cancer Immunol.Immunother.45128-130(1997))。可以产生多聚体片段，它们是冠状病毒蛋白质特异性Fv的多聚体，或者是双特异性抗体，该双特异性抗体包含与具有不同抗原特异性的另一Fv非共价结合的冠状病毒蛋白质特异性Fv(见，例如，Koelemij等人，J.Immunother.22514-24(1999))。
向结合冠状病毒蛋白质的免疫球蛋白分子导入氨基酸突变可以用于增加冠状病毒蛋白质的特异性或者亲和性，或者改变效应子功能。对冠状病毒蛋白质具有更高亲和性的免疫球蛋白可以通过特定蛋白质的定点诱变产生。计算机辅助的三维分子建模可以用于鉴定将改变的氨基酸残基，以便提高对冠状病毒蛋白质的亲和性(见，例如，Mountain等人，Biotechnol.Genet.Eng.Rev.101-142(1992)。备选地，可以用M13噬菌体产生CDR的组合文库以筛选具有提高的亲和力的免疫球蛋白片段(见，例如，Glaser等人，J.Immunol.1493903-3913(1992)；Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 913809-13(1994)；美国专利号5,792,456)。
在一些实施方案中，可以将抗体基因工程化而具有改变的效应子功能。例如，可以改变抗体介导依赖补体的细胞毒性(CDC)或者依赖抗体的细胞毒性(ADCC)的能力。效应子功能可以通过定点诱变改变(见，例如，Duncan等人，Nature 332563-64(1988)；Morgan等人，Immunology86319-24(1995)；Eghtedarzedeh-Kondri等人，Biotechniques23830-34(1997))。例如，免疫球蛋白的Fc部分上糖基化位点的突变可以改变免疫球蛋白固定补体的能力(见，例如，Wright等人，TrendsBiotechnol.1526-32(1997))。恒定区结构域中的其他突变可以改变免疫球蛋白固定补体，或者实现ADCC的能力(见，例如，Duncan et al.，Mol.Immunol.341019-29(1997))。备选地，可以重组构建单链多肽，其包含A2E结合片段、免疫球蛋白铰链区多肽、免疫球蛋白CH2区多肽，和免疫球蛋白CH3区多肽(见，例如，US专利公布号2003/01 18592；2003/0133939)。
可以根据多种公知的关于核酸切除、连接、转化和转染的方法，可以将编码特异结合如本文描述的冠状病毒蛋白质的抗体或者其片段的核酸分子进行扩增和表达。从而，在一些实施方案中，优选在原核宿主细胞，如大肠杆菌中进行抗体片段的表达(见，例如，Pluckthun等人，MethodsEnzymol.178497-515(1989))。在一些其他实施方案中，优选在真核宿主细胞，包括在酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris))；动物细胞(包括哺乳动物细胞)；或者植物细胞中进行抗体或者其抗原结合片段的表达。合适的动物细胞的实例包括，但不限于，骨髓瘤、COS、CHO，或者杂交瘤细胞。
在一些实施方案中，提供了抗独特型抗体和使用这些抗独特型抗体的方法，抗独特型抗体识别特异结合冠状病毒蛋白质的抗体(或者其抗原结合片段)。抗独特型抗体可以通过本文描述的方法，使用抗冠状病毒蛋白质抗体(或者其抗原结合片段)作为免疫原来作为单克隆抗体或者多克隆抗体产生。还可以通过上述重组基因工程化方法的任一种或通过噬菌体展示选择来产生抗独特型抗体或者其片段。抗独特型抗体可以与抗冠状病毒蛋白质抗体的抗原结合部位反应，从而抗体与冠状病毒蛋白质的结合被竞争性抑制。备选地，如本文提供的抗独特型抗体可以不竞争性抑制抗冠状病毒蛋白质抗体与冠状病毒蛋白质的结合。抗独特型抗体用于在免疫测定中确定生物样品中抗冠状病毒蛋白质抗体的存在。例如，本领域技术人员实践的免疫测定法，如ELISA，可以用于确定免疫应答的存在，所述免疫应答通过对宿主施用(即免疫)如本文描述的冠状病毒蛋白质而诱导。
本申请中提及的，和/或申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公布、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公布出版物都完整引入本文作为参考。
提供下面的实例作为阐明，并且不作为限定。
实施例实施例1蛋白体的制备本发明的免疫原可以通过非共价相互作用与蛋白体组合、混合或配制以形成能够在经免疫的人或动物受试者中引起保护性免疫应答的疫苗组合物。本申请的蛋白体是粘膜佐剂递送载体，其包含从例如B组2型脑膜炎奈瑟氏菌纯化的外膜蛋白质。蛋白体用于疫苗组合物(或者制剂)已经由Lowell，G.H.，在″New Generation Vaccines第二版，Marcel Dekker，Inc.，New York，Basil，Hong Kong(1997)pages 193-206中综述。用1M氯化钙中的6％EmpigenBB(EBB)(Albright and Wilson，Whithaven，UK)溶液萃取苯酚杀死的细菌糊，然后用乙醇沉淀，在1％EBB-Tris/EDTA-盐水溶解，然后用硫酸铵沉淀，可以制备本发明的蛋白体。将沉淀物在1％EBB缓冲液中再次溶解，透析，并保存在0.1％EBB中-70℃下。备选方法可以用于制备蛋白体，例如，通过省略硫酸铵沉淀步骤以缩短该方法可以制备蛋白体。蛋白体的制备公开在美国专利申请号2001/0053368和美国专利号6,476,201 B1中。
实施例2制备蛋白体脂糖免疫原性组合物通过将蛋白体与LPS混合以允许可能的非共价结合可以生产蛋白体佐剂组合物。LPS可以来自任何许多革兰氏阴性细菌，如志贺氏菌、毗邻单胞菌、埃希氏菌或者沙门氏菌物种，其与如实施例1中制备的蛋白体混合。简言之，将蛋白体与LPS在4℃过夜解冻并用TEEN缓冲液调节到1％EmpigenBB。两种组分在室温下混合15分钟，它们的用量导致最终重量/重量比为蛋白体LPS为约10∶1到约1∶3。将蛋白体LPS在合适大小(例如，9号)的10,000 MWCO空心纤维柱体上渗滤到TNS缓冲液(0.05M Tris，150mM NaCl pH8.0)中。当渗滤液中的Empigen含量＜50ppm(通过EmpigenTurbidity Assay或Bradford Reagent Assay)时，停止渗滤。将体积佐剂(本文称作OMP-LPS)浓缩并调节到5mg/mL蛋白质(通过Lowry测定法)。最后，用无菌过滤的0.22μm Millipak 20过滤单元无菌过滤佐剂。将体积佐剂等分到无菌贮存容器中并冷冻。
将OMP-LPS佐剂(1)通过反相HPLC测试Empigen(400ppm)；(2)通过Lowry测定法测试蛋白质含量；和(3)通过2-酮-3-脱氧辛酸(KDO)测定法测量LPS含量。对OMP-LPS组合物进一步表征颗粒大小分布，如使用粒子分选器(Brookhaven Instruments model 90 plus或类似的机器)通过定量数目重量分析测定(10-100nm)。然而，通过改变(例如，更高)蛋白体与LPS的比例可以增加或者调节复合体的颗粒大小。这些所得蛋白体LPS复合体已经称作Protollin。当前的稳定性数据表明该制剂稳定2年以上。
如需要，还可以产生其他形式的Protollin，其含有不同的LPS来源。尽管使用用弗氏志贺氏菌2a LPS制备的Protollin评估Protollin的鼻佐剂性质，但是已经用大肠杆菌LPS制备了Protollin并且发现其具有相似的活性。使用用大肠杆菌LPS制备的Protollin的优点包括可能更高的LPS产率以及细菌的发酵，其不需要包含与病原生物如弗氏志贺氏菌有关的预防措施。来自不同来源的LPS的使用也可以影响保护性免疫的诱导(适应性或者先天性)。因此，用来自两种不同大肠杆菌的LPS装配的Protollin以便比较其活性水平与基于弗氏志贺氏菌的Protollin的活性水平。这些数据表明大肠杆菌LPS可以成功地代替Protollin中的弗氏志贺氏菌LPS，而保留佐剂活性。该大肠杆菌Protollin可以与来自大肠杆菌的其他良好表征的菌株的LPS比较，所述其他良好表征的菌株包括LPS的O-多肽具有足够长度使得在Protollin的制备期间溶解蛋白体OMP颗粒的菌株。
如需要，还可以产生含有修饰的Proteosome∶LPS比例的其他形式的Protollin。用含有1∶1重量比的蛋白体OMP与LPS的Protollin进行初步研究。然而，用冠状病毒抗原在动物中进行功效临床研究或者在人体中进行临床研究之前，重要的是阐明有活性的OMP∶LPS比例范围，和研究具有最佳的佐剂活性并且还保持构成Protollin的OMP∶LPS复合体的溶解性的比例。因此，以前使用的相同的渗滤技术用于产生具有一些OMP∶LPS比例的Protollin，所述比例包括4∶1、2∶1和1∶1。使用由来自脑膜炎奈瑟氏菌的OMP和LPS组成的Protollin，包括约4∶1到约5∶1的比例(注意脑膜炎奈瑟氏菌通常称作表示脂寡糖的LOS以强调脑膜炎奈瑟氏菌脂糖的O侧链短于其他革兰氏阴性细菌如大肠杆菌和志贺氏菌的O-侧链)。用脑膜炎奈瑟氏菌LPS(protollin-Nm)生产Protollin与所有其他形式的Protollin都不同。在蛋白体OMP生产期间，可以通过硫酸铵沉淀除去脑膜炎奈瑟氏菌LPS，从而蛋白体颗粒具有小于2.5％脑膜炎奈瑟氏菌LPS。如果在该步骤不除去LPS，所得蛋白体颗粒与存在的蛋白体OMP的量相比将具有20-25％LPS，这将是约5∶1到约4∶1的OMP∶LPS比例。从而，可以在一步中产生Protollin-Nm，从而消除了进一步纯化蛋白体颗粒以及从另一种生物单独纯化LPS然后将LPS与蛋白体OMP复合的必要。保留每种Protollin的等分试样用于例如，spin-down测定法以验证蛋白体OMP与LPS的复合。这些形式的Protollin的每一种都在与S蛋白免疫原组合(混合、掺合或配制)以得到不同形式的Protollin S蛋白质免疫原性组合物后在小鼠中测试佐剂活性(见，例如实施例4)。
实施例3制备和表征重组S蛋白质在该实施例中，描述了制备天然(野生型)刺突(Spike)蛋白或者其片段的一种方法。还预期其他方法，包括用于非糖基化的S或者N蛋白片段的合成的和细菌表达系统。使用S.fruiperda Sf9昆虫细胞的杆状病毒表达系统(ExpressSF+TM)。从Genbank检索号AY274119(其代表完整SARS基因组序列，核苷酸21493-25259编码S蛋白，见图4)得到编码S蛋白的核苷酸序列的序列。根据CDC提供的TRIZOL使用说明，从自CDC得到的SARC裂解物分离RNA。该RNA制备物用于使用TITAN试剂盒(Roche)按照生产商的说明制备cDNA。使用引物2166和2167(前端40-750)将编码S蛋白的核苷酸序列的前末端直接克隆到杆状病毒转移载体PSC12。将编码S蛋白的核酸序列的中部((nt 750-2490)和后部(nt 2486-3768)直接克隆到大肠杆菌pUC 18载体。鉴定了具有正确插入的多种细菌克隆并用于将编码全长S蛋白的核酸序列克隆到杆状病毒转移载体PSC12。
定点诱变用于在PSC12中产生STM全长构建体和S蛋白的变体STM-del形式(缺少跨膜结构域的S蛋白，见图1)。将截短的STM-del分泌到培养基中，然后在氨甲酰甲胆碱凝集素(LL)和离子交换柱上纯化，得到约75％同质性纯度的蛋白质。还预期其他纯化方案，如镍柱纯化组蛋白表位标记的S或者N蛋白片段或者其融合蛋白。例如，将全长STM蛋白质与His标记融合在框内以产生His标记融合蛋白。通过将细胞沉淀溶解在1％Tergitol中，然后应用到镍和LL柱并从柱子洗脱，进行His标记的蛋白质的纯化。所得STM蛋白质为95％纯。通过来自SARS患者的恢复期血清，在蛋白质印迹测定中两种S蛋白质被结合，表明重组制备的S蛋白质和其变体具有被S蛋白抗体特异结合的天然抗原表位。
实施例4 Protollin-SARS Cov S-蛋白制剂制备Protollin与SARS-CoV S蛋白或者S蛋白变体(缺少跨膜结构域，即，STM-del)。将小鼠(每组10只)在第0和14天用16μg、4μg或者1μg纯化的重组STM-del与或者不与Protollin(1μg)经鼻内免疫。还肌内注射吸附到Alhydrogel(0.5％w/w)的STM-del蛋白质(16μg)并用作阳性对照和用于产生建立ELISA条件的血清。在第21天，将小鼠用CO2窒息进行安乐死并进行心脏穿刺，并收获血清和肺灌洗液，通过ELISA分别测定STM-del特异的IgG和IgA水平。结果表达为抗体的几何平均值浓度。
图2显示用Protollin作为佐剂的STM-del鼻内免疫小鼠与通过相同途径仅施用STM-del相比，诱导高到48倍更高水平的抗原特异的血清IgG。肌内施用的、明矾作为佐剂的STM-del阳性对照制备物与鼻内Protollin STM-del组合物相比诱导高4倍的血清IgG效价(图3A)。然而，仅仅经鼻ProtollinSTM-del疫苗诱导血清IgG和肺IgA(图3B)。
数据表明ProtollinS蛋白变体组合物能够诱导具有功能活性的抗原特异性血清抗体(见实施例5)和粘膜IgA应答。尽管引起了强烈的血清IgG和病毒中和应答，但是用明矾作为佐剂的STM-del蛋白质不能诱导粘膜IgA。
实施例5 SARS-CoV中和测定法该实施例描述通过来自用STM-del蛋白质免疫的小鼠的血清中和SARS-CoV的感染性。在这些实验中，将预先滴定的SARS-CoV的等分试样与如实施例4描述免疫的个体小鼠血清的连续稀释的样品混合。以1∶10的稀释度开始化到最终1∶640的稀释度制备小鼠血清的两倍连续稀释液；将血清用补充抗生素、两性霉素B、氨基酸、维生素、HEPES缓冲液，和3％胎牛血清的最小必需培养基(MEM)稀释。为了得到每种血清稀释液，将SARS-CoV原种(stock)病毒(噬菌斑形成单位(pfu)/50μl)稀释到1∶2到1∶256的最终稀释度。将血清+病毒混合物轻轻混合并在37℃温育2小时。向组织培养板(96孔微量滴定板(Corning-Costar))转移100微升每种混合物，在该组织培养板中Vero-E6刚好培养到汇合。细胞与血清+病毒混合物在37℃温育3小时。通过显微术确定每孔中细胞致病作用(CPE)的存在。血清的中和效价表示为刚好低于其中观察到CPE的稀释度的血清稀释度。
ProtollinSTM-del混合物的诱导的血清抗体具有功能活性，因为它们的中和效价为20，其比仅接受STM-del或者PBS的小鼠高4倍。类似地，通过明矾作为佐剂的S蛋白阳性对照诱导的血清抗体能够抑制病毒的体外复制，导致160的效价。
实施例6 SARS S-蛋白和STM-del的免疫原性在这些实验中，研究了在麻醉的或者非麻醉的小鼠中，不同剂量的ProtollinTM对恒定剂量的全长或STM-del(ΔTM(跨膜缺失的))SARS S-蛋白制剂的影响。在每组中包括10只Balb/C小鼠。
在第0和14天，麻醉或非麻醉的小鼠组用10μL含有10μg剂量的全长SARS S-蛋白或者STM-del蛋白与10μg、3μg或者1μg剂量的ProtollinTM混合的混合物经鼻内免疫。额外组的小鼠接受吸附到Alhydrogel(明矾)的25μL(25μg SARS全长S蛋白或者25μg SARS STM-del-蛋白)，其通过肌内注射施用。对照小鼠仅鼻内接受PBS。在第21天，通过CO2窒息对小鼠进行安乐死并进行心脏穿刺。并收获血清、肺灌洗液和鼻洗出液。数据在图6(血清IgG效价(μg/ml))和图7(肺IgA效价(ng/ml))中给出。
使用用合适的SARS S蛋白制剂包被的平板，通过ELISA测定个体小鼠血清和粘膜液体中SARS特异性IgG和IgA抗体的水平。特异IgG和IgA效价表达为几何平均值浓度(ng/ml)，通过ANOVA分析(Tukey-Kramer逐对比较)评估其显著性。
与麻醉的小鼠相比，在非麻醉的小鼠中，特异性血清IgG效价为约2.5到5倍。类似地，与麻醉的小鼠相比，非麻醉的小鼠中粘膜应答较低。在非麻醉的动物中仅可以检测到特异IgA，每个非麻醉组中多数小鼠都是非应答者。
在相同剂量的ProtollinTM下，用ProtollinTM配制的全长S蛋白免疫的小鼠引起的血清IgG效价比通过STM-del缺失的SARS S蛋白引起的高约1.5-2.5倍。差异通常不是统计学显著的，但是用1μg ProtollinTM配制的STM-del缺失的SARS S蛋白质是例外的，其引起显著低于其他测试的疫苗的效价(P≤0.001-0.01)，与3μg ProtollinTM混合的STM-del缺失的SARS S蛋白也是例外，其引起显著低于用与10μg ProtollinTM混合的全长S蛋白引起的血清IgG效价(P≤0.05)。在任何剂量的全长+ProtollinTM混合物(制剂)(或者10μgΔTM缺失的蛋白质与10μg ProtollinTM的混合物)和吸附到Alhydrogel并肌内注射的任一种蛋白质之间都没有观察到显著差异。
还测定了肺灌洗液和鼻洗出液中特异IgA效价。在给予鼻内疫苗的所有组的小鼠中观察到显著高于背景的的效价，但是在用吸附到Alhydrogel的蛋白质注射的小鼠中没有观察到显著高于背景的的效价。在给予鼻内疫苗的组中观察到剂量反应，但是所引起的效价之间的差异都不是统计学显著的。
还如实施例5描述的用来自该研究的小鼠的血清进行中和测定。中和效价与测量的IgG效价有高度显著的相关性(P＜0.0001)。
还确定了该研究中小鼠的细胞免疫应答的表型。用小鼠脾细胞进行用于测定用全长S蛋白再刺激后的应答的表型，即细胞因子谱的测定法。将来自用全长S蛋白(10μg/ml)和Protollin(10μg/ml)免疫的小鼠的脾脏合并并且将来自用全长S蛋白和明矾免疫的小鼠的脾脏合并，然后将两个合并库根据标准方法处理成单细胞悬浮液。然后将脾细胞悬浮液与全长S蛋白(1.7μg/ml或者5μg/ml，取决于测量哪种细胞因子)温育。使用OptEIA试剂盒(BD Biosciences，San Jose，CA)，通过定量ELISA测定释放到培养物上清液的细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5和IL-6)。如图8所示，使用Protollin作为佐剂歪斜了针对1型表型的免疫应答(包括细胞应答)而不是歪斜了在用明矾免疫的动物中观察到的2型表型。
根据上面的描述，将理解，尽管为了阐明在本文中描述了本发明的具体实施方案，但是可以进行多种修改而不背离本发明的精神和范围。
序列表<110>魁北克益得生物医学公司D.S.布尔特；M.A.雷迪什胡朝红G.H.罗尼尔D.H.琼斯<120>用于治疗冠状病毒感染的疫苗组合物和方法<130>484112.404PC<140>PCT<141>2005-06-30<150>US 60/584,704<151>2004-06-30<160>55<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>3768<212>DNA<213>SARS冠状病毒株Tor2<400>1atgtttattt tcttattatt tcttactctc actagtggta gtgaccttga ccggtgcacc 60acttttgatg atgttcaagc tcctaattac actcaacata cttcatctat gaggggggtt 120tactatcctg atgaaatttt tagatcagac actctttatt taactcagga tttatttctt 180ccattttatt ctaatgttac agggtttcat actattaatc atacgtttgg caaccctgtc 240atacctttta aggatggtat ttattttgct gccacagaga aatcaaatgt tgtccgtggt 300tgggtttttg gttctaccat gaacaacaag tcacagtcgg tgattattat taacaattct 360actaatgttg ttatacgagc atgtaacttt gaattgtgtg acaacccttt ctttgctgtt 420tctaaaccca tgggtacaca gacacatact atgatattcg ataatgcatt taattgcact 480ttcgagtaca tatctgatgc cttttcgctt gatgtttcag aaaagtcagg taattttaaa 540cacttacgag agtttgtgtt taaaaataaa gatgggtttc tctatgttta taagggctat 600caacctatag atgtagttcg tgatctacct tctggtttta acactttgaa acctattttt 660aagttgcctc ttggtattaa cattacaaat tttagagcca ttcttacagc cttttcacct 720gctcaagaca tttggggcac gtcagctgca gcctattttg ttggctattt aaagccaact 780acatttatgc tcaagtatga tgaaaatggt acaatcacag atgctgttga ttgttctcaa 840aatccacttg ctgaactcaa atgctctgtt aagagctttg agattgacaa aggaatttac 900cagacctcta atttcagggt tgttccctca ggagatgttg tgagattccc taatattaca 960aacttgtgtc cttttggaga ggtttttaat gctactaaat tcccttctgt ctatgcatgg 1020gagagaaaaa aaatttctaa ttgtgttgct gattactctg tgctctacaa ctcaacattt 1080ttttcaacct ttaagtgcta tggcgtttct gccactaagt tgaatgatct ttgcttctcc 1140aatgtctatg cagattcttt tgtagtcaag ggagatgatg taagacaaat agcgccagga 1200caaactggtg ttattgctga ttataattat aaattgccag atgatttcat gggttgtgtc 1260cttgcttgga atactaggaa cattgatgct acttcaactg gtaattataa ttataaatat 1320aggtatctta gacatggcaa gcttaggccc tttgagagag acatatctaa tgtgcctttc 1380tcccctgatg gcaaaccttg caccccacct gctcttaatt gttattggcc attaaatgat 1440tatggttttt acaccactac tggcattggc taccaacctt acagagttgt agtactttct 1500tttgaacttt taaatgcacc ggccacggtt tgtggaccaa aattatccac tgaccttatt 1560aagaaccagt gtgtcaattt taattttaat ggactcactg gtactggtgt gttaactcct 1620tcttcaaaga gatttcaacc atttcaacaa tttggccgtg atgtttctga tttcactgat 1680
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<223>S核苷酸片段<400>3atgtttattt tcttattatt tcttactctc actagtggta gtgaccttga ccggtgcacc 60acttttgatg atgttcaagc tcctaattac actcaacata cttcatctat gaggggggtt 120tactatcctg atgaaatttt tagatcagac actctttatt taactcagga tttatttctt 180ccattttatt ctaatgttac agggtttcat actattaatc atacgtttgg caaccctgtc 240atacctttta aggatggtat ttattttgct gccacagaga aatcaaatgt tgtccgtggt 300tgggtttttg gttctaccat gaacaacaag tcacagtcgg tgattattat taacaattct 360actaatgttg ttatacgagc atgtaacttt gaattgtgtg acaacccttt ctttgctgtt 420tctaaaccca tgggtacaca gacacatact atgatattcg ataatgcatt taattgcact 480ttcgagtaca tatctgatgc cttttcgctt gatgtttcag aaaagtcagg taattttaaa 540cacttacgag agtttgtgtt taaaaataaa gatgggtttc tctatgttta taagggctat 600caacctatag atgtagttcg tgatctacct tctggtttta acactttgaa acctattttt 660aagttgcctc ttggtattaa cattacaaat tttagagcca ttcttacagc cttttcacct 720gctcaagaca tttggggcac gtcagctgca gcctattttg ttggctattt aaagccaact 780acatttatgc tcaagtatga tgaaaatggt acaatcacag atgctgttga ttgttctcaa 840aatccacttg ctgaactcaa atgctctgtt aagagctttg agattgacaa aggaatttac 900cagacctcta atttcagggt tgttccctca ggagatgttg tgagattccc taatattaca 960aacttgtgtc cttttggaga ggtttttaat gctactaaat tcccttctgt ctatgcatgg 1020gagagaaaaa aaatttctaa ttgtgttgct gattactctg tgctctacaa ctcaacattt 1080ttttcaacct ttaagtgcta tggcgtttct gccactaagt tgaatgatct ttgcttctcc 1140aatgtctatg cagattcttt tgtagtcaag ggagatgatg taagacaaat agcgccagga 1200caaactggtg ttattgctga ttataattat aaattgccag atgatttcat gggttgtgtc 1260
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<223>S肽片段<400>4Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu1 5 10 15Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln20 25 30His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg35 40 45Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser50 55 60
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Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg530 535 540Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp545 550 555 560Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys565 570 575Ala Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser580 585 590Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr595 600 605Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr610 615 620Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu625 630 635 640His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile645 650 655Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys660 665 670Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala675 680 685Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile690 695 700Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys705 710 715 720Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu725 730 735Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile740 745 750Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys755 760 765Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe770 775 780Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile785 790 795 800Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met805 810 815Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile820 825 830Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr835 840 845Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala850 855 860Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe865 870 875 880Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Ash Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn885 890 895Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala900 905 910Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly915 920 925Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu930 935 940Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn945 950 955 960Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp965 970 975Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln980 985 990
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<223>S核苷酸片段<400>5agtggtagtg accttgaccg gtgcaccact tttgatgatg ttcaagctcc taattacact 60caacatactt catctatgag gggggtttac tatcctgatg aaatttttag atcagacact 120ctttatttaa ctcaggattt atttcttcca ttttattcta atgttacagg gtttcatact 180attaatcata cgtttggcaa ccctgtcata ccttttaagg atggtattta ttttgctgcc 240acagagaaat caaatgttgt ccgtggttgg gtttttggtt ctaccatgaa caacaagtca 300cagtcggtga ttattattaa caattctact aatgttgtta tacgagcatg taactttgaa 360ttgtgtgaca accctttctt tgctgtttct aaacccatgg gtacacagac acatactatg 420atattcgata atgcatttaa ttgcactttc gagtacatat ctgatgcctt ttcgcttgat 480gtttcagaaa agtcaggtaa ttttaaacac ttacgagagt ttgtgtttaa aaataaagat 540gggtttctct atgtttataa gggctatcaa cctatagatg tagttcgtga tctaccttct 600ggttttaaca ctttgaaacc tatttttaag ttgcctcttg gtattaacat tacaaatttt 660agagccattc ttacagcctt ttcacctgct caagacattt ggggcacgtc agctgcagcc 720tattttgtt 729<2l0>6<211>243<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>S肽片段
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<223>S核苷酸片段<400>7ggctatttaa agccaactac atttatgctc aagtatgatg aaaatggtac aatcacagat 60gctgttgatt gttctcaaaa tccacttgct gaactcaaat gctctgttaa gagctttgag 120attgacaaag gaatttacca gacctctaat ttcagggttg ttccctcagg agatgttgtg 180agattcccta atattacaaa cttgtgtcct tttggagagg tttttaatgc tactaaattc 240ccttctgtct atgcatggga gagaaaaaaa atttctaatt gtgttgctga ttactctgtg 300ctctacaact caacattttt ttcaaccttt aagtgctatg gcgtttctgc cactaagttg 360aatgatcttt gcttctccaa tgtctatgca gattcttttg tagtcaaggg agatgatgta 420agacaaatag cgccaggaca aactggtgtt attgctgatt ataattataa attgccagat 480gatttcatgg gttgtgtcct tgcttggaat actaggaaca ttgatgctac ttcaactggt 540aattataatt ataaatatag gtatcttaga catggcaagc ttaggccctt tgagagagac 600atatctaatg tgcctttctc ccctgatggc aaaccttgca ccccacctgc tcttaattgt 660tattggccat taaatgatta tggtttttac accactactg gcattggcta ccaaccttac 720agagttgtag tactttcttt tgaactttta aatgcaccgg ccacggtttg tggaccaaaa 780
ttatccactg accttattaa gaaccagtgt gtcaatttta attttaatgg actcactggt 840actggtgtgt taactccttc ttcaaagaga tttcaaccat ttcaacaatt tggccgtgat 900gtttctgatt tcactgattc cgttcgagat cctaaaacat ctgaaatatt agacatttca 960ccttgcgctt ttgggggtgt aagtgtaatt acacctggaa caaatgcttc atctgaagtt 1020gctgttctat atcaagatgt taactgcact gatgtttcta cagcaattca tgcagatcaa 1080ctcacaccag cttggcgcat atattctact ggaaacaatg tattccagac tcaagcaggc 1140tgtcttatag gagctgagca tgtcgacact tcttatgagt gcgacattcc tattggagct 1200ggcatttgtg ctagttacca tacagtttct ttattacgta gtactagcca aaaatctatt 1260gtggcttata ctatgtcttt aggtgctgat agttcaattg cttactctaa taacaccatt 1320gctataccta ctaacttttc aattagcatt actacagaag taatgcctgt ttctatggct 1380aaaacctccg tagattgtaa tatgtacatc tgcggagatt ctactgaatg tgctaatttg 1440cttctccaat atggtagctt ttgcacacaa ctaaatcgtg cactctcagg tattgctgct 1500gaacaggatc gcaacacacg tgaagtgttc gctcaagtca aacaaatgta caaaacccca 1560actttgaaat attttggtgg ttttaatttt tcacaaatat tacctgaccc tctaaagcca 1620actaagaggt cttttattga ggacttgctc tttaataagg tgacactcgc tgatgctggc 1680ttcatgaagc aatatggcga atgcctaggt gatattaatg ctagagatct catttgtgcg 1740<210>8<211>580<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>S肽片段<400>8Gly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly1 5 10 15Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu20 25 30Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr35 40 45Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn50 55 60Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe65 70 75 80Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala85 90 95Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys100 105 110Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val115 120 125Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala130 135 140Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp145 150 155 160Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala165 170 175Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly180 185 190Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro195 200 205Asp Gly Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu210 215 220Asn Asp Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr225 230 235 240Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val
245 250 255Cys Gly Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn260 265 270Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser275 280 285Lys Arg Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe290 295 300Thr Asp Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser305 310 315 320Pro Cys Ala Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala325 330 335Ser Ser Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val340 345 350Ser Thr Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr355 360 365Ser Thr Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly370 375 380Ala Glu His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala385 390 395 400Gly Ile Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser405 410 415Gln Lys Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser420 425 430Ile Ala Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile435 440 445Ser Ile Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val450 455 460Asp Cys Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu465 470 475 480Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser485 490 495Gly Ile Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln500 505 510Val Lys Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe515 520 525Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser530 535 540Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly545 550 555 560Phe Met Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp565 570 575Leu Ile Cys Ala580<210>9<211>1266<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>S核苷酸片段<400>9cagaagttca atggacttac agtgttgcca cctctgctca ctgatgatat gattgctgcc 60tacactgctg ctctagttag tggtactgcc actgctggat ggacatttgg tgctggcgct 120gctcttcaaa taccttttgc tatgcaaatg gcatataggt tcaatggcat tggagttacc 180caaaatgttc tctatgagaa ccaaaaacaa atcgccaacc aatttaacaa ggcgattagt 240
caaattcaag aatcacttac aacaacatca actgcattgg gcaagctgca agacgttgtt 300aaccagaatg ctcaagcatt aaacacactt gttaaacaac ttagctctaa ttttggtgca 360atttcaagtg tgctaaatga tatcctttcg cgacttgata aagtcgaggc ggaggtacaa 420attgacaggt taattacagg cagacttcaa agccttcaaa cctatgtaac acaacaacta 480atcagggctg ctgaaatcag ggcttctgct aatcttgctg ctactaaaat gtctgagtgt 540gttcttggac aatcaaaaag agttgacttt tgtggaaagg gctaccacct tatgtccttc 600ccacaagcag ccccgcatgg tgttgtcttc ctacatgtca cgtatgtgcc atcccaggag 660aggaacttca ccacagcgcc agcaatttgt catgaaggca aagcatactt ccctcgtgaa 720ggtgtttttg tgtttaatgg cacttcttgg tttattacac agaggaactt cttttctcca 780caaataatta ctacagacaa tacatttgtc tcaggaaatt gtgatgtcgt tattggcatc 840attaacaaca cagtttatga tcctctgcaa cctgagcttg actcattcaa agaagagctg 900gacaagtact tcaaaaatca tacatcacca gatgttgatc ttggcgacat ttcaggcatt 960aacgcttctg tcgtcaacat tcaaaaagaa attgaccgcc tcaatgaggt cgctaaaaat 1020ttaaatgaat cactcattga ccttcaagaa ttgggaaaat atgagcaata tattaaatgg 1080ccttggtatg tttggctcgg cttcattgct ggactaattg ccatcgtcat ggttacaatc 1140ttgctttgtt gcatgactag ttgttgcagt tgcctcaagg gtgcatgctc ttgtggttct 1200tgctgcaagt ttgatgagga tgactctgag ccagttctca agggtgtcaa attacattac 1260acataa1266<210>10<211>421<212>PRT<213>人工序列<220>
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Gly Val Phe Val Phe Asn Gly Thr Ser Trp Phe Ile Thr Gln Arg Asn245 250 255Phe Phe Ser Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly260 265 270Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro275 280 285Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe290 295 300Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile305 310 315 320Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu325 330 335Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly340 345 350Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu Gly Phe355 360 365Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Leu Leu Cys Cys370 375 380Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Ala Cys Ser Cys Gly Ser385 390 395 400Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys Gly Val405 410 415Lys Leu His Tyr Thr420<210>11<211>753<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>S核苷酸片段<400>11taccagacct ctaatttcag ggttgttccc tcaggagatg ttgtgagatt ccctaatatt 60acaaacttgt gtccttttgg agaggttttt aatgctacta aattcccttc tgtctatgca 120tgggagagaa aaaaaatttc taattgtgtt gctgattact ctgtgctcta caactcaaca 180tttttttcaa cctttaagtg ctatggcgtt tctgccacta agttgaatga tctttgcttc 240tccaatgtct atgcagattc ttttgtagtc aagggagatg atgtaagaca aatagcgcca 300ggacaaactg gtgttattgc tgattataat tataaattgc cagatgattt catgggttgt 360gtccttgctt ggaatactag gaacattgat gctacttcaa ctggtaatta taattataaa 420tataggtatc ttagacatgg caagcttagg ccctttgaga gagacatatc taatgtgcct 480ttctcccctg atggcaaacc ttgcacccca cctgctctta attgttattg gccattaaat 540gattatggtt tttacaccac tactggcatt ggctaccaac cttacagagt tgtagtactt 600tcttttgaac ttttaaatgc accggccacg gtttgtggac caaaattatc cactgacctt 660attaagaacc agtgtgtcaa ttttaatttt aatggactca ctggtactgg tgtgttaact 720ccttcttcaa agagatttca accatttcaa caa 753<210>12<211>251<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>S肽片段<400>12
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<223>S肽片段<400>13tccaatgtct atgcagattc ttttgtagtc aagggagatg atgtaagaca aatagcgcca 60ggacaaactg gtgttattgc tgattataat tataaattgc cagatgattt catgggttgt 120gtccttgctt ggaatactag gaacattgat gctacttcaa ctggtaatta taattataaa 180tataggtatc ttagacatgg caagcttagg ccctttgaga gagacatatc taatgtgcct 240ttctcccctg atggcaaacc ttgcacccca cctgctctta attgttattg gccattaaat 300gattatggtt tttacaccac tactggcatt ggctaccaac cttacagagt tgtagtactt 360tcttttgaac ttttaaatgc accggccacg gtttgtggac caaaattatc cactgacctt 420attaagaacc agtgtgtcaa ttttaatttt aatggactca ctggtactgg tgtgttaact 480ccttcttcaa agagatttca accatttcaa caatttggcc gtgatgtttc tgatttcact 540gattccgttc gagatcctaa aacatctgaa atattagaca tttcaccttg cgcttttggg 600ggt 603<210>14<211>201<212>PRT
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<223>S核苷酸片段<400>15tccaatgtct atgcagattc ttttgtagtc aagggagatg atgtaagaca aatagcgcca 60ggacaaactg gtgttattgc tgattataat tataaattgc cagatgattt catgggttgt 120gtccttgctt ggaatactag gaacattgat gctacttcaa ctggtaatta taattataaa 180tataggtatc ttagacatgg caagcttagg ccctttgaga gagacatatc taatgtgcct 240ttctcccctg atggcaaacc ttgcacccca cctgctctta attgttattg gccattaaat 300gat 303<210>16<211>101<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>S肽片段
<400> 16Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg1 5 10 15Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys20 25 30Leu Pro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn35 40 45Ile Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu50 55 60Arg His Gly Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro65 70 75 80Phe Ser Pro Asp Gly Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr85 90 95Trp Pro Leu Asn Asp100<210>17<2ll>300<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>S核苷酸片段<400>17tatggttttt acaccactac tggcattggc taccaacctt acagagttgt agtactttct 60tttgaacttt taaatgcacc ggccacggtt tgtggaccaa aattatccac tgaccttatt 120aagaaccagt gtgtcaattt taattttaat ggactcactg gtactggtgt gttaactcct 180tcttcaaaga gatttcaacc atttcaacaa tttggccgtg atgtttctga tttcactgat 240tccgttcgag atcctaaaac atctgaaata ttagacattt caccttgcgc ttttgggggt 300<210>18<211>100<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>S肽片段<400>18Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val1 5 10 15Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly20 25 30Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn35 40 45Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg50 55 60Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp65 70 75 80Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys85 90 95Ala Phe Gly Gly100
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<223>S肽片段<400>20Ser Gly Ser Asp Leu Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala1 5 10 15Pro Asn Tyr Thr Gln His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro20 25 30Asp Glu Ile Phe Arg Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe
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aaatggcct 1569<210>22<211>523<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>S肽片段<400>22Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala1 5 10 15Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile20 25 30Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys35 40 45Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu50 55 60Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile65 70 75 80Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys85 90 95Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe100 105 110Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile115 120 125Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met130 135 140Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile145 150 155 160Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr165 170 175Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala180 185 190Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe195 200 205Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn210 215 220Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala225 230 235 240Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly245 250 255Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu260 265 270Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn275 280 285Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp290 295 300Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln305 310 315 320Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala325 330 335Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe340 345 350Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ala Ala Pro His355 360 365Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn
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<223>S核苷酸片段<400>23tctattgtgg cttatactat gtctttaggt gctgatagtt caattgctta ctctaataac 60accattgcta tacctactaa cttttcaatt agcattacta cagaagtaat gcctgtttct 120atggctaaaa cctccgtaga ttgtaatatg tacatctgcg gagattctac tgaatgtgct 180aatttgcttc tccaatatgg tagcttttgc acacaactaa atcgtgcact ctcaggtatt 240gctgctgaac aggatcgcaa cacacgtgaa gtgttcgctc aagtcaaaca aatgtacaaa 300accccaactt tgaaatattt tggtggtttt aatttttcac aaatattacc tgaccctcta 360aagccaacta agaggtcttt tattgaggac ttgctcttta ataaggtgac actcgctgat 420gctggcttca tgaagcaata tggcgaatgc ctaggtgata ttaatgctag agatctcatt 480tgtgcgcaga agttcaatgg acttacagtg ttgccacctc tgctcactga tgatatgatt 540gctgcctaca ctgctgctct agttagtggt actgccactg ctggatggac atttggtgct 600ggcgctgctc ttcaaatacc ttttgctatg caaatggcat ataggttcaa tggcattgga 660gttacccaaa atgttctcta tgagaaccaa aaacaaatcg ccaaccaatt taacaaggcg 720attagtcaaa ttcaagaatc acttacaaca acatcaactg cattgggcaa gctgcaagac 780gttgttaacc agaatgctca agcattaaac acacttgtta aacaacttag ctctaatttt 840ggtgcaattt caagtgtgct aaat864<210>24<211>288<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>S核苷酸片段<400>25gatatccttt cgcgacttga taaagtcgag gcggaggtac aaattgacag gttaattaca 60ggcagacttc aaagccttca aacctatgta acacaacaac taatcagggc tgctgaaatc 120agggcttctg ctaatcttgc tgctactaaa atgtctgagt gtgttcttgg acaatcaaaa 180agagttgact tttgtggaaa gggctaccac cttatgtcct tcccacaagc agccccgcat 240ggtgttgtct tcctacatgt cacgtatgtg ccatcccagg agaggaactt caccacagcg 300ccagcaattt gtcatgaagg caaagcatac ttccctcgtg aaggtgtttt tgtgtttaat 360ggcacttctt ggtttattac acagaggaac ttcttttctc cacaaataat tactacagac 420aatacatttg tctcaggaaa ttgtgatgtc gttattggca tcattaacaa cacagtttat 480gatcctctgc aacctgagct tgactcattc aaagaagagc tggacaagta cttcaaaaat 540catacatcac cagatgttga tcttggcgac atttcaggca ttaacgcttc tgtcgtcaac 600attcaaaaag aaattgaccg cctcaatgag gtcgctaaaa atttaaatga atcactcatt 660gaccttcaag aattgggaaa atatgagcaa tatattaaat ggccttggta tgtttggctc 720
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<223>S肽片段<400>26Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp1 5 10 15Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln20 25 30Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala35 40 45Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe50 55 60Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ala Ala Pro His65 70 75 80Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn85 90 95Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Glu Gly Lys Ala Tyr Phe Pro100 105 110Arg Glu Gly Val Phe Val Phe Asn Gly Thr Ser Trp Phe Ile Thr Gln115 120 125Arg Asn Phe Phe Ser Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val130 135 140Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr145 150 155 160Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys165 170 175Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser180 185 190Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu195 200 205Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu210 215 220Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu225 230 235 240<210>27<211>1269<212>DNA<213>SARS冠状病毒株Urbani<400>27atgtctgata atggacccca atcaaaccaa cgtagtgccc cccgcattac atttggtgga 60cccacagatt caactgacaa taaccagaat ggaggacgca atggggcaag gccaaaacag 120cgccgacccc aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcacagctct cactcagcat 180ggcaaggagg aacttagatt ccctcgaggc cagggcgttc caatcaacac caatagtggt 240ccagatgacc aaattggcta ctaccgaaga gctacccgac gagttcgtgg tggtgacggc 300aaaatgaaag agctcagccc cagatggtac ttctattacc taggaactgg cccagaagct 360tcacttccct acggcgctaa caaagaaggc atcgtatggg ttgcaactga gggagccttg 420aatacaccca aagaccacat tggcacccgc aatcctaata acaatgctgc caccgtgcta 480caacttcctc aaggaacaac attgccaaaa ggcttctacg cagagggaag cagaggcggc 540agtcaagcct cttctcgctc ctcatcacgt agtcgcggta attcaagaaa ttcaactcct 600ggcagcagta ggggaaattc tcctgctcga atggctagcg gaggtggtga aactgccctc 660
gcgctattgc tgctagacag attgaaccag cttgagagca aagtttctgg taaaggccaa 720caacaacaag gccaaactgt cactaagaaa tctgctgctg aggcatctaa aaagcctcgc 780caaaaacgta ctgccacaaa acagtacaac gtcactcaag catttgggag acgtggtcca 840gaacaaaccc aaggaaattt cggggaccaa gacctaatca gacaaggaac tgattacaaa 900cattggccgc aaattgcaca atttgctcca agtgcctctg cattctttgg aatgtcacgc 960attggcatgg aagtcacacc ttcgggaaca tggctgactt atcatggagc cattaaattg 1020gatgacaaag atccacaatt caaagacaac gtcatactgc tgaacaagca cattgacgca 1080tacaaaacat tcccaccaac agagcctaaa aaggacaaaa agaaaaagac tgatgaagct 1140cagcctttgc cgcagagaca aaagaagcag cccactgtga ctcttcttcc tgcggctgac 1200atggatgatt tctccagaca acttcaaaat tccatgagtg gagcttctgc tgattcaact 1260caggcataa 1269<210>28<211>422<212>PRT<213>SARS冠状病毒株Urbani<400>28Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile1 5 10 15Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly20 25 30Arg Asn Gly Ala Arg Pro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn35 40 45Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Glu50 55 60Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Gly65 70 75 80Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Val Arg85 90 95Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr100 105 110Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys115 120 125Glu Gly Ile Val Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys130 135 140Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu145 150 155 160Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly165 170 175Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg180 185 190Gly Asn Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser Pro195 200 205Ala Arg Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu210 215 220Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly Gln225 230 235 240Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser245 250 255Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Gln Tyr Asn Val Thr260 265 270Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly275 280 285Asp Gln Asp Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln290 295 300Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg305 310 315 320
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<223>表位标记<400>40Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys1 5<210>41<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>表位标记<400>41Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys1 5<210>42<211>3768<212>DNA<213>SARS冠状病毒Tor2<400>42atgtttattt tcttattatt tcttactctc actagtggta gtgaccttga ccggtgcacc 60acttttgatg atgttcaagc tcctaattac actcaacata cttcatctat gaggggggtt 120tactatcctg atgaaatttt tagatcagac actctttatt taactcagga tttatttctt 180ccattttatt ctaatgttac agggtttcat actattaatc atacgtttgg caaccctgtc 240atacctttta aggatggtat ttattttgct gccacagaga aatcaaatgt tgtccgtggt 300tgggtttttg gttctaccat gaacaacaag tcacagtcgg tgattattat taacaattct 360actaatgttg ttatacgagc atgtaacttt gaattgtgtg acaacccttt ctttgctgtt 420tctaaaccca tgggtacaca gacacatact atgatattcg ataatgcatt taattgcact 480ttcgagtaca tatctgatgc cttttcgctt gatgtttcag aaaagtcagg taattttaaa 540cacttacgag agtttgtgtt taaaaataaa gatgggtttc tctatgttta taagggctat 600caacctatag atgtagttcg tgatctacct tctggtttta acactttgaa acctattttt 660aagttgcctc ttggtattaa cattacaaat tttagagcca ttcttacagc cttttcacct 720gctcaagaca tttggggcac gtcagctgca gcctattttg ttggctattt aaagccaact 780acatttatgc tcaagtatga tgaaaatggt acaatcacag atgctgttga ttgttctcaa 840aatccacttg ctgaactcaa atgctctgtt aagagctttg agattgacaa aggaatttac 900cagacctcta atttcagggt tgttccctca ggagatgttg tgagattccc taatattaca 960aacttgtgtc cttttggaga ggtttttaat gctactaaat tcccttctgt ctatgcatgg 1020gagagaaaaa aaatttctaa ttgtgttgct gattactctg tgctctacaa ctcaacattt 1080ttttcaacct ttaagtgcta tggcgtttct gccactaagt tgaatgatct ttgcttctcc 1140aatgtctatg cagattcttt tgtagtcaag ggagatgatg taagacaaat agcgccagga 1200
caaactggtg ttattgctga ttataattat aaattgccag atgatttcat gggttgtgtc 1260cttgcttgga atactaggaa cattgatgct acttcaactg gtaattataa ttataaatat 1320aggtatctta gacatggcaa gcttaggccc tttgagagag acatatctaa tgtgcctttc 1380tcccctgatg gcaaaccttg caccccacct gctcttaatt gttattggcc attaaatgat 1440tatggttttt acaccactac tggcattggc taccaacctt acagagttgt agtactttct 1500tttgaacttt taaatgcacc ggccacggtt tgtggaccaa aattatccac tgaccttatt 1560aagaaccagt gtgtcaattt taattttaat ggactcactg gtactggtgt gttaactcct 1620tcttcaaaga gatttcaacc atttcaacaa tttggccgtg atgtttctga tttcactgat 1680tccgttcgag atcctaaaac atctgaaata ttagacattt caccttgcgc ttttgggggt 1740gtaagtgtaa ttacacctgg aacaaatgct tcatctgaag ttgctgttct atatcaagat 1800gttaactgca ctgatgtttc tacagcaatt catgcagatc aactcacacc agcttggcgc 1860atatattcta ctggaaacaa tgtattccag actcaagcag gctgtcttat aggagctgag 1920catgtcgaca cttcttatga gtgcgacatt cctattggag ctggcatttg tgctagttac 1980catacagttt ctttattacg tagtactagc caaaaatcta ttgtggctta tactatgtct 2040ttaggtgctg atagttcaat tgcttactct aataacacca ttgctatacc tactaacttt 2100tcaattagca ttactacaga agtaatgcct gtttctatgg ctaaaacctc cgtagattgt 2160aatatgtaca tctgcggaga ttctactgaa tgtgctaatt tgcttctcca atatggtagc 2220ttttgcacac aactaaatcg tgcactctca ggtattgctg ctgaacagga tcgcaacaca 2280cgtgaagtgt tcgctcaagt caaacaaatg tacaaaaccc caactttgaa atattttggt 2340ggttttaatt tttcacaaat attacctgac cctctaaagc caactaagag gtcttttatt 2400gaggacttgc tctttaataa ggtgacactc gctgatgctg gcttcatgaa gcaatatggc 2460gaatgcctag gtgatattaa tgctagagat ctcatttgtg cgcagaagtt caatggactt 2520acagtgttgc cacctctgct cactgatgat atgattgctg cctacactgc tgctctagtt 2580agtggtactg ccactgctgg atggacattt ggtgctggcg ctgctcttca aatacctttt 2640gctatgcaaa tggcatatag gttcaatggc attggagtta cccaaaatgt tctctatgag 2700aaccaaaaac aaatcgccaa ccaatttaac aaggcgatta gtcaaattca agaatcactt 2760acaacaacat caactgcatt gggcaagctg caagacgttg ttaaccagaa tgctcaagca 2820ttaaacacac ttgttaaaca acttagctct aattttggtg caatttcaag tgtgctaaat 2880gatatccttt cgcgacttga taaagtcgag gcggaggtac aaattgacag gttaattaca 2940ggcagacttc aaagccttca aacctatgta acacaacaac taatcagggc tgctgaaatc 3000agggcttctg ctaatcttgc tgctactaaa atgtctgagt gtgttcttgg acaatcaaaa 3060agagttgact tttgtggaaa gggctaccac cttatgtcct tcccacaagc agccccgcat 3120ggtgttgtct tcctacatgt cacgtatgtg ccatcccagg agaggaactt caccacagcg 3180ccagcaattt gtcatgaagg caaagcatac ttccctcgtg aaggtgtttt tgtgtttaat 3240ggcacttctt ggtttattac acagaggaac ttcttttctc cacaaataat tactacagac 3300aatacatttg tctcaggaaa ttgtgatgtc gttattggca tcattaacaa cacagtttat 3360gatcctctgc aacctgagct tgactcattc aaagaagagc tggacaagta cttcaaaaat 3420catacatcac cagatgttga tcttggcgac atttcaggca ttaacgcttc tgtcgtcaac 3480attcaaaaag aaattgaccg cctcaatgag gtcgctaaaa atttaaatga atcactcatt 3540gaccttcaag aattgggaaa atatgagcaa tatattaaat ggccttggta tgtttggctc 3600ggcttcattg ctggactaat tgccatcgtc atggttacaa tcttgctttg ttgcatgact 3660agttgttgca gttgcctcaa gggtgcatgc tcttgtggtt cttgctgcaa gtttgatgag 3720gatgactctg agccagttct caagggtgtc aaattacatt acacataa 3768<210>43<211>1255<212>PRT<213>SARS冠状病毒Tor2<400>43Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu1 5 10 15Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln20 25 30His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg35 40 45Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser50 55 60
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aacttgtgtc cttttggaga ggtttttaat gctactaaat tcccttctgt ctatgcatgg 1020gagagaaaaa aaatttctaa ttgtgttgct gattactctg tgctctacaa ctcaacattt 1080ttttcaacct ttaagtgcta tggcgtttct gccactaagt tgaatgatct ttgcttctcc 1140aatgtctatg cagattcttt tgtagtcaag ggagatgatg taagacaaat agcgccagga 1200caaactggtg ttattgctga ttataattat aaattgccag atgatttcat gggttgtgtc 1260cttgcttgga atactaggaa cattgatgct acttcaactg gtaattataa ttataaatat 1320aggtatctta gacatggcaa gcttaggccc tttgagagag acatatctaa tgtgcctttc 1380tcccctgatg gcaaaccttg caccccacct gctcttaatt gttattggcc attaaatgat 1440tatggttttt acaccactac tggcattggc taccaacctt acagagttgt agtactttct 1500tttgaacttt taaatgcacc ggccacggtt tgtggaccaa aattatccac tgaccttatt 1560aagaaccagt gtgtcaattt taattttaat ggactcactg gtactggtgt gttaactcct 1620tcttcaaaga gatttcaacc atttcaacaa tttggccgtg atgtttctga tttcactgat 1680tccgttcgag atcctaaaac atctgaaata ttagacattt caccttgctc ttttgggggt 1740gtaagtgtaa ttacacctgg aacaaatgct tcatctgaag ttgctgttct atatcaagat 1800gttaactgca ctgatgtttc tacagcaatt catgcagatc aactcacacc agcttggcgc 1860atatattcta ctggaaacaa tgtattccag actcaagcag gctgtcttat aggagctgag 1920catgtcgaca cttcttatga gtgcgacatt cctattggag ctggcatttg tgctagttac 1980catacagttt ctttattacg tagtactagc caaaaatcta ttgtggctta tactatgtct 2040ttaggtgctg atagttcaat tgcttactct aataacacca ttgctatacc tactaacttt 2100tcaattagca ttactacaga agtaatgcct gtttctatgg ctaaaacctc cgtagattgt 2160aatatgtaca tctgcggaga ttctactgaa tgtgctaatt tgcttctcca atatggtagc 2220ttttgcacac aactaaatcg tgcactctca ggtattgctg ctgaacagga tcgcaacaca 2280cgtgaagtgt tcgctcaagt caaacaaatg tacaaaaccc caactttgaa atattttggt 2340ggttttaatt tttcacaaat attacctgac cctctaaagc caactaagag gtcttttatt 2400gaggacttgc tctttaataa ggtgacactc gctgatgctg gcttcatgaa gcaatatggc 2460gaatgcctag gtgatattaa tgctagagat ctcatttgtg cgcagaagtt caatggactt 2520acagtgttgc cacctctgct cactgatgat atgattgctg cctacactgc tgctctagtt 2580agtggtactg ccactgctgg atggacattt ggtgctggcg ctgctcttca aatacctttt 2640gctatgcaaa tggcatatag gttcaatggc attggagtta cccaaaatgt tctctatgag 2700aaccaaaaac aaatcgccaa ccaatttaac aaggcgatta gtcaaattca agaatcactt 2760acaacaacat caactgcatt gggcaagctg caagacgttg ttaaccagaa tgctcaagca 2820ttaaacacac ttgttaaaca acttagctct aattttggtg caatttcaag tgtgctaaat 2880gatatccttt cgcgacttga taaagtcgag gcggaggtac aaattgacag gttaattaca 2940ggcagacttc aaagccttca aacctatgta acacaacaac taatcagggc tgctgaaatc 3000agggcttctg ctaatcttgc tgctactaaa atgtctgagt gtgttcttgg acaatcaaaa 3060agagttgact tttgtggaaa gggctaccac cttatgtcct tcccacaagc agccccgcat 3120ggtgttgtct tcctacatgt cacgtatgtg ccatcccagg agaggaactt caccacagcg 3180ccagcaattt gtcatgaagg caaagcatac ttccctcgtg aaggtgtttt tgtgtttaat 3240ggcacttctt ggtttattac acagaggaac ttcttttctc cacaaataat tactacagac 3300aatacatttg tctcaggaaa ttgtgatgtc gttattggca tcattaacaa cacagtttat 3360gatcctctgc aacctgagct tgactcattc aaagaagagc tggacaagta cttcaaaaat 3420catacatcac cagatgttga ttttggcgac atttcaggca ttaacgcttc tgtcgtcaac 3480attcaaaaag aaattgaccg cctcaatgag gtcgctaaaa atttaaatga atcactcatt 3540gaccttcaag aattgggaaa atatgagcaa tatattaaat ggccttggta tgtttggctc 3600ggcttcattg ctggactaat tgccatcgtc atggttacaa tcttgctttg ttgcatgact 3660agttgttgca gttgcctcaa gggtgcatgc tcttgtggtt cttgctgcaa gtttgatgag 3720gatgactctg agccagttct caagggtgtc aaattacatt acacataa 3768<210>45<211>1255<212>PRT<213>SARS冠状病毒Frankfurtl<400>45Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu1 5 10 15Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln20 25 30
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权利要求
1.用于治疗或预防冠状病毒感染的方法，其包括对需要其的受试者施用包含(a)佐剂；(b)药学上可接受的赋形剂；和(c)至少一种冠状病毒S蛋白免疫原，该免疫原包含SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、或SEQ ID NO18中给出的氨基酸序列，其中所述至少一种S蛋白免疫原能够引起针对冠状病毒的保护性免疫应答。
2.根据权利要求1的方法，其中所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原与SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、或SEQ ID NO18中给出的氨基酸序列具有至少90％同一性。
3.根据权利要求1的方法，其中所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原与SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、或SEQ ID NO18中给出的氨基酸序列具有至少80％同一性。
4.根据权利要求1的方法，其中所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原还包含疏水部分。
5.根据权利要求4的方法，其中所述疏水部分是疏水多肽或者脂类。
6.根据权利要求1的方法，其中赋形剂是脂质体。
7.根据权利要求1的方法，其中佐剂是蛋白体或Protollin。
8.根据权利要求1的方法，其中佐剂是明矾、弗氏佐剂、蛋白体，或者Protollin。
9.根据权利要求1的方法，其中佐剂是Protollin。
10.根据权利要求1的方法，其中施用至少两种S蛋白免疫原。
11.根据权利要求1的方法，其中所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原被连接到第二种氨基酸序列。
12.根据权利要求11的方法，其中所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原融合到第二种氨基酸序列形成融合蛋白。
13.根据权利要求12的方法，其中第二种氨基酸序列是标记或者酶。
14.根据权利要求13的方法，其中标记是组氨酸标记。
15.根据权利要求1的方法，其中冠状病毒感染由组1冠状病毒、组2冠状病毒、组3冠状病毒和SARS组冠状病毒引起。
16.根据权利要求1的方法，其中冠状病毒感染由组1冠状病毒、组2冠状病毒、组3冠状病毒和SARS组冠状病毒的至少两种引起。
17.根据权利要求1的方法，其中冠状病毒感染由人类冠状病毒引起，并且其中人类冠状病毒是SARS-CoV。
18.根据权利要求1的方法，其中通过选自经肠、肠胃外、经皮、经粘膜、经鼻和吸入的途径施用所述组合物。
19.根据权利要求1的方法，其中经鼻施用所述组合物。
20.根据权利要求1的方法，其中免疫应答包括引起至少一种特异结合至少一种冠状病毒S蛋白免疫原的抗体。
21.一种组合物，其包含(a)至少一种冠状病毒S蛋白免疫原，其包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ IDNO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ IDNO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24或SEQ ID NO26中给出的氨基酸序列；和(b)蛋白体或者Protollin，其中所述S蛋白免疫原能够引起保护性免疫应答。
22.根据权利要求21的组合物，其中所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原包含与SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ IDNO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24或SEQ ID NO26中给出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
23.根据权利要求21的组合物，其中所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原包含与SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ IDNO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24或SEQ ID NO26中给出的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
24.根据权利要求21的组合物，其中所述S蛋白免疫原还包含疏水部分。
25.根据权利要求24的组合物，其中所述疏水部分是疏水多肽或者脂类。
26.根据权利要求21的组合物，其中所述至少一种S蛋白免疫原被连接到第二种氨基酸序列。
27.根据权利要求26的组合物，其中所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原融合到第二种氨基酸序列形成融合蛋白。
28.根据权利要求26的组合物，其中第二种氨基酸序列是标记或者酶。
29.根据权利要求28的组合物，其中第二种氨基酸序列是组氨酸标记。
30.根据权利要求21的组合物，其中所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原包含SEQ ID NO2中给出的氨基酸序列。
31.根据权利要求21的组合物，其中所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原包含SEQ ID NO4中给出的氨基酸序列。
32.根据权利要求21的组合物，其还包含药学上可接受的赋形剂。
33.根据权利要求21的组合物，其中所述至少一种S蛋白免疫原融合到至少一种第二种S蛋白免疫原的框内形成融合蛋白，该第二种S蛋白免疫原包含选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24和SEQ ID NO26中给出的氨基酸序列的氨基酸序列。
34.一种组合物，其包含(a)蛋白体或者Protollin；和(b)多价融合冠状病毒免疫原多肽。
35.用于治疗或者预防冠状病毒感染的方法，其包括对需要其的受试者施用根据权利要求34的组合物。
36.用于治疗或者预防冠状病毒感染的方法，其包括对需要其的受试者施用组合物，该组合物包含(a)蛋白体或者Protollin；(b)至少一种冠状病毒S蛋白免疫原，其包含SEQ ID NO2、SEQ IDNO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24或SEQ ID NO26中给出的氨基酸序列。
37.根据权利要求36的方法，其中所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原与SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24或SEQ ID NO26中给出的氨基酸序列具有至少90％同一性。
38.根据权利要求36的方法，其中所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原与SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24或SEQ ID NO26中给出的氨基酸序列具有至少80％同一性。
39.根据权利要求36的方法，其中所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原还包含疏水部分。
40.根据权利要求39的方法，其中所述疏水部分是疏水多肽或者脂类。
41.根据权利要求36的方法，其中所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原被连接到第二种氨基酸序列。
42.根据权利要求41的方法，其中所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原融合到第二种氨基酸序列形成融合蛋白。
43.根据权利要求41的方法，其中第二种氨基酸序列是标记或者酶。
44.根据权利要求43的方法，其中标记是组氨酸标记。
45.根据权利要求36的方法，其中冠状病毒感染由组1冠状病毒、组2冠状病毒、组3冠状病毒和SARS组冠状病毒的至少一种引起。
46.根据权利要求36的方法，其中冠状病毒感染由组1冠状病毒、组2冠状病毒、组3冠状病毒和SARS组冠状病毒的至少两种引起。
47.根据权利要求36的方法，其中冠状病毒感染由人类冠状病毒引起，其中人类冠状病毒是SARS-CoV。
48.根据权利要求36的方法，其中通过选自经肠、肠胃外、经皮、经粘膜、经鼻和吸入的途径施用所述组合物。
49.根据权利要求36的方法，其中经鼻施用所述组合物。
50.根据权利要求36的方法，其中所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原包含SEQ ID NO2中给出的氨基酸序列。
51.根据权利要求36的方法，其中所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原包含SEQ ID NO4中给出的氨基酸序列。
52.根据权利要求36的方法，其中所述组合物包含Protollin和至少一种冠状病毒S蛋白免疫原，其中所述至少一种冠状病毒S蛋白免疫原包含SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中给出的氨基酸序列。
全文摘要
本公开涉及用于治疗或预防冠状病毒感染的组合物和方法。例如，提供了组合物，其包含能够引起保护性体液和/或细胞介导的免疫应答的冠状病毒S蛋白或者N蛋白、其片段或变体，所述组合物可用于治疗或预防冠状病毒，如SARS的病原体引起的感染。而且提供了冠状病毒S蛋白和N蛋白免疫原组合物，其包括佐剂，如蛋白体或者Protollin，其可以用于治疗或预防冠状病毒，如SARS冠状病毒引起的感染。
文档编号C07K14/165GK101022827SQ200580022360
公开日2007年8月22日 申请日期2005年6月30日 优先权日2004年6月30日
发明者D·S·布尔特, M·A·雷迪什, 玛丽·朝红·胡, G·H·罗尼尔, D·H·琼斯 申请人:魁北克益得生物医学公司