一种用于检测人冠状病毒感染的通用引物序列及检测方法
【专利摘要】本发明通过对GenBank上登录的六种人冠状病毒全基因组核酸序列的比对分析，在基因组多聚酶基因编码区(1b区)设计了一对简并引物hCoV-For和hCoV-Rev用于对人冠状病毒的通用定性检测。上游引物序列hCoV-For：ATGGGWTGGGAYTAYCCHAARTGTG，下游引物序列hCoV-Rev：TGYTGKGARCARAAYTCRTGWGG，扩增目的片段大小为605bp。分别提取HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1阳性样本的RNA，通过One-step RT-PCR对该通用引物对进行验证。结果表明，分别以上述四种人冠状病毒RNA为模板，以hCoV-For和hCoV-Rev为通用引物进行One-step RT-PCR反应后都能扩增出大小约600bp的单一目的条带。对PCR产物进行测序验证，结果表明扩增序列正确且不存在交叉反应。本发明可用于对人冠状病毒感染的核酸快速定性检测。
【专利说明】一种用于检测人冠状病毒感染的通用引物序列及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学和病毒学领域，更具体涉及一种新的利用一对简并引物， 通过One-step RT-PCR反应即可达到对人冠状病毒感染定性检测的目的。
【背景技术】
[0002] 冠状病毒（Coronavirus)在病毒学分类上属于巢式病毒目（orderNidovirals)、 冠状病毒科（family Coronavirade)、冠状病毒属（genus Coronavirus)的成员，基因组为 单链、正链的RNA，全长在26?32kb之间，是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒。冠状 病毒在自然界的感染普非常广泛，常见的哺乳类动物如犬、猫、鼠、猪、牛以及家禽类等都易 感。近几年来，又从白鲸、骆驼，尤其是蝙蝠体内分离到多种类型的冠状病毒。冠状病毒依 据核酸序列的系统发生分析，国际病毒学分类委员会（ICTV，2012)在第九次报告中将冠状 病毒属又分成了 α、β、γ及δ共四个亚组。人及其他哺乳类冠状病毒主要位于α和β 亚组，禽类及其它鸟类冠状病毒主要位于γ和S亚组。冠状病毒感染后，能够侵害机体的 呼吸道、消化道、肝脏、肾脏以及神经系统等多种器官，造成不同程度的病理性损，从而引起 不同程度的病理性疾病，严重者甚至能造成死亡。
[0003] 人冠状病毒目前已知共有六种，分别是二十世纪60年代最早发现的人冠状病毒 229E(Human coronavirus 229E，HCoV-229E)和HC〇V-〇C43 ;2002?2003年在我国广东地区 出现并迅速爆发的严重急性呼吸道综合征（Severe acute respiratory syndrome, SARS) 冠状病毒SARS-CoV ;2004年在荷兰分离的新型人冠状病毒HCoV-NL63 ;2005年在香港鉴定 的新型人冠状病毒HCoV-HKUI以及2012年在中东地区出现的新型中东呼吸综合征（Middle East respiratory syndrome, MERS)冠状病毒 MERS-CoV。其中，HCoV-229E 和 HCoV-NL63 位于α亚组，HC〇V-〇C43和HCoV-HKUI位于β亚组中的2a亚组，SARS-CoV属于β亚组 中的2b亚组，MERS-CoV属于β亚组中的2c亚组。分子流行病学研宄表明，人冠状病毒主 要感染婴幼儿及免疫功能低下或缺陷者，既能感染上呼吸道引起发热、咳嗽、喉炎等普通感 冒症状，又能感染下呼吸道引起支气管炎、毛细支气管炎及肺炎等急性呼吸道症状。其中， SARS-CoV和MERS-CoV感染后能够引发呼吸系统和肾功能衰竭，严重者甚至造成死亡。除 了 SARS-CoV和MERS-CoV外，冠状病毒在常见人呼吸道病毒感染中的平均检出率为15% (Perlman S, et al. 2009) 〇
[0004] 冠状病毒基因组不连续的复制转录机制、RNA依赖的RNA聚合酶（RNA dependent RNApolymerase, RdRp)复制的低忠实性、广泛的宿主嗜性使其在进化过程中极易发生碱基 的插入、缺失以及基因重组或重配，在此过程中新型别或新的冠状病毒不断出现。因此，深 入开展冠状病毒及新出现的冠状病毒的分子流行病学调查，及时研发新的快速、灵敏的分 子检测技术对于阐释冠状病毒跨种属传播的分子机制以及满足快速诊断的要求等具有重 要意义。目前，人冠状病毒分子检测方法主要有常规RT-PCR、real-time RT-PCR及血清学 诊断法。这些方法通常利用特异性引物针及探针对某一特定种类的人冠状病毒进行单一检 测，属于盲筛检测，不仅费时费力，而且检测试剂昂贵且容易造成污染。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是以GenBank上登陆的目前已知的六种人冠状病毒全基因组序列 为基础，通过对人冠状病毒全基因组核酸序列的比对分析，在基因组多聚酶基因编码区设 计了一对简并引物用于对人冠状病毒的通用定性检测。
[0006] 本发明提供的技术方案是：
[0007] 一种用于检测人冠状病毒感染的通用引物序列，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO :1 所示，即：hCoV-For :ATGGGWTGGGAYTAYCCHAARTGTG ;其下游引物核苷酸序列如 SEQ ID NO :2 所示，gp :hCoV-Rev :TGYTGKGARCARAAYTCRTGWGG〇
[0008] 一种用所述通用引物序列检测人冠状病毒感染的检测方法，包括：
[0009] (1)人冠状病毒检测通用引物设计
[0010] 通过对GenBank上登录的六种人冠状病毒全基因组核酸序列的比对分析，在基因 组多聚酶基因编码区设计了一对简并引物hC 〇V-F〇r和hCoV-Rev用于对人冠状病毒感染的 初步确诊，引物对序列分别为上游引物hCoV-For :ATGGGWTGGGAYTAYCCHAARTGTG，下游引物 hCoV-Rev :TGYTGKGARCARAAYTCRTGWGG，扩增目的片段大小为 605bp ;
[0011] (2)人冠状病毒通用引物One-step RT-PCR检测验证
[0012] 利用 QIAamp Viral RNA Mini kit 分别从四种人冠状病毒：HCoV-NL63、 HCoV-0C43、HCoV-229E和HCoV-HKUI的阳性样本中提取病毒RNA，然后以hCoV-For和 hCoV-Rev为引物对，通过One-step RT-PCR Quick Master Mix对四种人冠状病毒分别进行 检测验证。
[0013] 所述步骤（2)中，对四种人冠状病毒分别进行检测验证的反应体系为25 yL :2x RT-PCR Quick Master Mix 12.5 yL，50mM Mn(0AC)21. 25 yL，10 μΜ hCoV-For 和 hCoV-Rev 各 I μ L，病毒 RNA 5 μ L，去离子水 7. 25 μ L ;反应程序为：90°C 30s，60°C 30min，94°C，Imin ; 94°C 30s，56°C 30s，72°C lmin，35个循环；72°C 7min ;反应产物经I. 2%琼脂糖凝胶电泳后 在紫外灯下观察结果，结果表明，分别以上述四种人冠状病毒RNA为模板，以hCoV-For和 hCoV-Rev为通用引物进行One-st印RT-PCR反应后都能扩增出大小600bp的单一目的条 带，PCR产物经测序验证后序列正确且不存在交叉反应。
[0014] 所述步骤（2)中人冠状病毒通用引物One-st印RT-PCR检测验证包括人冠状病毒 通用引物One-st印RT-PCR检测灵敏性验证和人冠状病毒通用引物One-st印RT-PCR检测 特异性验证。
[0015] 所述人冠状病毒通用引物One-step RT-PCR检测灵敏性验证，利用QIAamp Viral RNA Mini kit提取人冠状病毒RNA，并用分光光度计进行定量，并通过公式计算出每微升的 拷贝数，将病毒RNA进行稀释，然后分别取各个稀释倍数的RNA为模板进行RT-PCR，结果表 明，每反应病毒RNA拷贝数从1. 6x109到1. 6x103是均能扩增出目的条带，而每反应病毒 RNA拷贝数从1. 6x102到1. 6x100均不能扩增出目的条带，上述结果表明，该人冠状病毒通 用引物One-step RT-PCR最低检测下限为1600拷贝/每反应，与常规单一冠状病毒检测所 用 RT-PCR 及 real-time RT-PCR 灵敏性相当；
[0016] 所述人冠状病毒通用引物One-step RT-PCR检测特异性验证，病毒RNA分别以 HC〇V-NL63、HC〇V-〇C43、HC〇V-229E、HC〇V-HKU1 以及 Influenza virus A、Influenza virus B、诺如病毒、呼吸道合胞体病毒、副流感病毒、人鼻病毒为模板，以hCoV-For和hCoV-Rev为 引物对进行PCR扩增，结果表明，分别以上述四种人冠状病毒RNA为模板，以hCoV-For和 hCoV-Rev为通用引物进行One-st印RT-PCR反应后都能扩增出大小为600bp的单一目的条 带，而加入其它病毒RNA模板均不能扩增出条带，表明该人冠状病毒通用检测引物对特异 性较好。
[0017] 本发明改变了以往对人冠状病毒检测的思路，以GenBank上登陆的目前已知的六 种人冠状病毒（HCoV-229E、HC〇V-〇C43、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKUI 和 MERS-CoV)全 基因组序列为基础，通过多序列比对在其基因组Ib区设计了一对简并引物hCoV-For和 hCoV-Rev，通过One-step RT-PCR实现对人冠状病毒感染快速定性检测，通过PCR产物测序 即可准确判定人冠状病毒感染的种类。本发明可用于开发人冠状病毒感染快速确诊的核酸 定性检测试剂盒。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1是人冠状病毒检测通用引物设计图。
[0019] 图2是人冠状病毒通用引物对信息图。
[0020] 图3是人冠状病毒通用引物One-St印RT-PCR检测特异性图。
【具体实施方式】
[0021] 一种用于检测人冠状病毒感染的通用引物序列，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO :1 所示，即：hCoV-For :ATGGGWTGGGAYTAYCCHAARTGTG ;其下游引物核苷酸序列如 SEQ ID NO :2 所示，gp :hCoV-Rev :TGYTGKGARCARAAYTCRTGWGG〇
[0022] 一种用通用引物序列检测人冠状病毒感染的检测方法，包括：
[0023] (1)人冠状病毒检测通用（简并）引物设计
[0024] 通过对GenBank上登录的六种人冠状病毒包括人冠状病毒229E (Human coronavirus 229E, HCoV-229E)> HC〇V-〇C43> SARS-CoV(Severe acute respiratory syndrome coronavirus)、HCoV-NL63、HCoV-HKUl 和 MERS-CoV (Middle East respiratory syndrome coronavirus)全基因组核酸序列的比对分析，在基因组多聚酶基因编码区（lb 区）设计了一对简并引物hCoV-For和hCoV-Rev用于对人冠状病毒感染的初步确诊（如 图1)，引物对序列分别为上游引物hCoV-For :ATGGGWTGGGAYTAYCCHAARTGTG，下游引物 hCoV-Rev :TGYTGKGARCARAAYTCRTGWGG，扩增目的片段大小为 605bp(其中，HCoV-HKUI 为 608bp)(如图 2)。
[0025] (2)人冠状病毒通用引物One-step RT-PCR检测验证
[0026] 利用病毒RNA提取试剂盒QIAamp Viral RNA Mini kit (QIAGEN)分别从四 种人冠状病毒（HCoV-NL63、HC〇V-〇C43、HCoV-229E和HCoV-HKUl)阳性样本中提取病 毒 RNA，然后以 hCoV-For 和 hCoV-Rev 为引物对，通过 One-step RT-PCR Quick Master Mix (T0Y0B0公司）对四种人冠状病毒分别进行检测验证；反应体系为25 μ L :2x RT-PCR Quick Master Mix 12.5 μL，50mM Mn (OAC)21. 25 μL，10 μ M hCoV-For 和 hCoV-Rev 各 14 1，病毒1?隱5以1^，去离子水7.25以匕反应程序为：90°0 3〇8,60°0 3〇1^11，94°0，11^11; 94°C 30s，56°C 30s，72°C lmin，35个循环；72°C 7min。反应产物经I. 2%琼脂糖凝胶电泳后 在紫外灯下观察结果。结果表明，分别以上述四种人冠状病毒RNA为模板，以hCoV-For和 hCoV-Rev为通用引物进行One-st印RT-PCR反应后都能扩增出大小约600bp的单一目的条 带。PCR产物经测序验证后序列正确且不存在交叉反应。
[0027] 人冠状病毒通用引物One-st印RT-PCR检测验证包括灵敏性验证和特异性验证其 中人冠状病毒通用引物One-step RT-PCR检测灵敏性验证如下：
[0028] 以人冠状病毒HC〇V-NL63为例来说明该通用引物One-st印RT-PCR检测的灵敏 性。利用 QIAamp Viral RNA Mini kit (QIAGEN)提取 HCoV-NL63 病毒 RNA 并用分光光度 计（敵腸01?0? 2000(：，11161'1]1〇)进行定量，并通过（拷贝/以1^=(6.0211023)1浓度（叩/) Χ10-9Λ目的片段碱基数x340))公式计算出每微升的拷贝数。将病毒RNA进行10倍倍比 稀释（从3. 2x108倍比稀释到3. 2x100)，然后分别取5 μ L各个稀释倍数的RNA为模板进 行RT-PCR，结果表明，每反应病毒RNA拷贝数从1. 6x109到1. 6x103是均能扩增出目的条 带，而每反应病毒RNA拷贝数从1. 6x102到1. 6x100均不能扩增出目的条带。上述结果表 明，该人冠状病毒通用引物One-step RT-PCR最低检测下限为1600拷贝/每反应，与常规 单一冠状病毒检测所用RT-PCR及real-time RT-PCR灵敏性相当。
[0029] 其中人冠状病毒通用引物One-step RT-PCR检测特异性验证如下：
[0030] 按照⑵中所述25 μ L反应体系配制反应液。其中，病毒RNA分别以HCOV-NL63、 HCoV-0C43、HCoV-229E、HCoV-HKUI 以及 Influenza virus A (Η3Ν2)、Influenza virus Β、 诺如病毒（Norovirus)、呼吸道合胞体病毒（RSV)、副流感病毒（PIV2&PIV3)、人鼻病毒 (Rhinovirus)为模板，以hCoV-For和hCoV-Rev为引物对进行PCR扩增。反应程序为： 90°C 30s，6(TC 30min，94°C，Imin ;94°C 30s, 56°C 30s, 72°C Imin, 35 个循环；72°C 7min。反 应产物经I. 2%琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下观察结果。结果表明，分别以上述四种人冠状 病毒RNA为模板，以hCoV-For和hCoV-Rev为通用引物进行One-st印RT-PCR反应后都能 扩增出大小约600bp的单一目的条带，而加入其它病毒RNA模板均不能扩增出条带（如图 3)，表明该人冠状病毒通用检测引物对特异性较好。
【权利要求】
1. 一种用于检测人冠状病毒感染的通用引物序列，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示。
2. -种用权利要求1所述通用引物序列检测人冠状病毒感染的检测方法，其特征在 于，包括： (1) 人冠状病毒检测通用引物设计 通过对GenBank上登录的六种人冠状病毒全基因组核酸序列的比对分析，在基因组 多聚酶基因编码区设计了 一对简并引物hC〇V-F〇r和hCoV-Rev用于对人冠状病毒感染的 初步确诊，引物对序列分别为上游引物hCoV-For :ATGGGWTGGGAYTAYCCHAARTGTG，下游引物 hCoV-Rev :TGYTGKGARCARAAYTCRTGWGG，扩增目的片段大小为 605bp ; (2) 人冠状病毒通用引物One-step RT-PCR检测验证 利用 QIAamp Viral RNA Mini kit 分别从四种人冠状病毒：HC〇V-NL63、HC〇V_OC43、 HCoV-229E和HCoV-HKUl的阳性样本中提取病毒RNA，然后以hCoV-For和hCoV-Rev为引物 对，通过One-step RT-PCR Quick Master Mix对四种人冠状病毒分别进行检测验证。
3. 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤（2)中，对四种人冠状 病毒分别进行检测验证的反应体系为25 yL:2x RT-PCR Quick Master Mix 12. 5 yL， 50mM Mn(OAC) 21. 25yL，10yM hCoV-For 和 hCoV-Rev 各 lyL，病毒 RNA 5yL，去离子水 7. 25 y L ;反应程序为：90°C 30s，60°C 30min，94°C，lmin ;94°C 30s, 56°C 30s, 72°C lmin, 35 个循环；72°C 7min;反应产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下观察结果，结果表 明，分别以上述四种人冠状病毒RNA为模板，以hCoV-For和hCoV-Rev为通用引物进行 One-st印RT-PCR反应后都能扩增出大小600bp的单一目的条带，PCR产物经测序验证后序 列正确且不存在交叉反应。
4. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述步骤⑵中人冠状病毒通用引物 One-st印RT-PCR检测验证包括人冠状病毒通用引物One-st印RT-PCR检测灵敏性验证和 人冠状病毒通用引物〇ne-st印RT-PCR检测特异性验证。
5. 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述人冠状病毒通用引物One-step RT-PCR检测灵敏性验证，利用QIAamp Viral RNAMini kit提取人冠状病毒RNA，并用分光 光度计进行定量，并通过公式计算出每微升的拷贝数，将病毒RNA进行稀释，然后分别取 各个稀释倍数的RNA为模板进行RT-PCR，结果表明，每反应病毒RNA拷贝数从1. 6x109到 1. 6x103是均能扩增出目的条带，而每反应病毒RNA拷贝数从1. 6x102到1. 6x100均不能 扩增出目的条带，上述结果表明，该人冠状病毒通用引物One-step RT-PCR最低检测下限为 1600拷贝/每反应，与常规单一冠状病毒检测所用RT-PCR及real-time RT-PCR灵敏性相 当。
6. 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述人冠状病毒通用引物One-step RT-PCR 检测特异性验证，病毒 RNA 分别以 HC〇V-NL63、HC〇V-〇C43、HC〇V-229E、HC〇V-HKU1 以 及Influenza virusA、Influenza virus B、诺如病毒、呼吸道合胞体病毒、副流感病毒、人 鼻病毒为模板，以hCoV-For和hCoV-Rev为引物对进行PCR扩增，结果表明，分别以上述四 种人冠状病毒RNA为模板，以hCoV-For和hCoV-Rev为通用引物进行One-st印RT-PCR反 应后都能扩增出大小为600bp的单一目的条带，而加入其它病毒RNA模板均不能扩增出条 带，表明该人冠状病毒通用检测引物对特异性较好。
【文档编号】C12N15/11GK104498636SQ201510012641
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2015年1月9日 优先权日:2015年1月9日
【发明者】耿合员, 汪圣强, 谢晓谦, 肖雨, 张汀, 李宗 , 谭文杰, 苏川 申请人:江苏国际旅行卫生保健中心无锡分中心