一种快速诊断桑椹缩小型菌核病的方法
【专利摘要】一种快速诊断桑椹缩小型菌核病的方法，通过发现的病原核地杖菌特异性保守DNA序列，获得了特异性SCAR-PCR引物，建立了桑椹缩小型菌核病SCAR-PCR诊断检测方法。该方法的灵敏度高(检测灵敏度为1 pg/μL)，特异性强，使用方便快捷，检测结果准确可靠，可用于桑椹缩小型菌核病的田间诊断和桑果带菌情况检测检验；同时还可用于病害潜伏期(已侵染桑果但未显症的时期)诊断，从而对病害做出早期预报，以及时实施必要的控制措施，安全有效地防治病害的发生和危害，减轻或避免经济损失。根据此方法可研制开发桑椹缩小型菌核病“检测试剂盒”产品，广泛应用于桑葚相关产业的科学研究和生产实践。
【专利说明】-种快速诊断桑植缩小型菌核病的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物病害防治【技术领域】，特别是涉及一种用分子生物技术快速诊断桑 植缩小型菌核病的方法。
【背景技术】
[0002] 桑植缩小型菌核病的经济重要性.桑植缩小型菌核病 (S虹unken-fruitsclerotiniose of mu化erry)是H种桑植菌核病之一，其病原菌为核地 |sf {Scleromi trula shiraiana) {Schuamacher T, Holst-Je打se打 /L A sy打opsis of the genus Scleromitrula. 2997,说^分.?仿-化0,是世界上发生最普遍和危 害最严重的桑植菌核病。该病在我国发生非常普遍，江苏、浙江、上海、四川、重庆、陕西和台 湾等主要果桑种植区均有发生分布，发病率常年均可达到30% - 60%，一般减产20% - 50% ; 近几年来在许多地区桑菌核病爆发流行，造成大面积果桑毁产绝收（崩兒^填，桌濕巧.桑 堪菌核病病原及病害防治技术综述.蚕业科学，2012，38巧）：1099-1104)。啦化，棄藤 菌核病是危害果桑作物的重要病害，是影响桑树生长发育和桑植产量的重要限制因子，研 究该病害的诊断鉴定技术，W准确地预测和有效地防治病害流行，对于桑果生产稳定发展 具有重要意义。
[0003] 桑植缩小型菌核病发生诊断的重要性.桑菌核病菌W掉落在桑园±壤中的菌核 越冬，次年春季气温升高后开始萌发产生子囊盘（磨茹），形成大量子囊抱子散发于空气 中，在桑树开花期侵染花朵，果实成熟时表现症状，将桑植的部分或全部小果粒变为菌核。 缩小型菌核病植显著缩小，灰白色，质地坚硬，表面有暗褐色细斑，病植内形成黑色坚硬菌 核。桑植菌核病从病原菌侵染到桑果大量发病的时间历程很短，病害的快速准确诊断和早 期预报是指导生产中病害防治的关键。
[0004] 桑植缩小型菌核病快捷准确诊断技术的必要性.目前，桑植菌核病的诊断主要采 用传统病害诊断方法，即根据症状和病原菌形态确定病害的种类。但是，传统的病害诊断需 要病害表现出症状之后才能进行，而且需要分离得到病原菌的纯培养和对病原菌进行显微 特征观察。一方面，病原菌的分离纯化过程相当复杂，实验条件和技术要求都较高，诊断的 准确性和可靠性难W保证；且在人工培养条件下病菌生长缓慢，一般需要15 - 20天之后才 能观察鉴定，获得诊断鉴定结果；另一方面，病害一旦开始显症，就会迅速发展，此时做出诊 断为时已晚，根据诊断结果采取防治措施已不能获得有效的病害防治效果。因此急需一种 快速诊断桑植缩小型菌核病的方法。
[0005] 桑植缩小型菌核病分子诊断技术尚未建立.传统的真菌分类和鉴定主要基于形 态学特征、致病性测定等，该种方法耗时长、灵敏度低W及经验性强，从发病的植株中分离 和鉴定病原菌需要很长时间，难W适应现代农业生产中病害预测和综合防控实践的需要。 随着分子生物学的发展，各种分子技术应用到植物病原物的检测，唐建辉等（2006)利用 RAPD技术转化为SCAR标记，设计引物RB/RC对西瓜炭痘病菌仿or如'cu7are 进行特异性检测。Qin et al(2010)应用巢式PCR技术，根据ITS序列，设计出引物XJJ21/ XJJ222对引起油菜菌核病的况'yerWinia s<;?7erWia/Y邸进行特异性检测。化ang et al (2014)建立了水稻黑条欽缩病毒病的实时PCR定量检测技术。总之，目前分子生物技术在 植物病害诊断鉴定领域已经广泛应用，不少重要的植物病害的分子检测技术都已建立。但 迄今为止，国内外还未见有关核地杖菌DNA特异保守序列（或基因）的发现及桑植缩小型 菌核病分子快捷诊断鉴定方法的研究报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种快速诊断桑植缩小型菌核病的方法。 申请人:通过研 究桑植菌核病病原核地杖菌DNA，筛选出适合的基因CS23进行RATO扩增，获得了 590bp的 核地杖菌特异性保守序列（SCAR序列，见序列表及实施例），由此设计和筛选出一对能有效 扩增该保守序列的特异性SCAR引物（SSF/SSR)，再通过几个重要PCR因子的优化，建立了核 地杖菌的SCAR-PCR体系和技术，测试明确技术的灵敏度，并通过桑园采集的田间样品测试 检验技术的实用性和可靠性。
[0007] 本发明所述的一种用分子生物技术快速诊断桑植缩小型菌核病的方法，通过W下 步骤实现： (1) 取待测样品，采用CTAB方法从样品中提取总DNA ; (2) 利用5Wbp的核地杖菌特异性保守序列设计并筛选得到核地杖菌的一对特异 性 SCAR-PCR 引物，引物正向序列 SS-F 为 5' - AGTAAAGAGAACATCAAACTTCG -3'，位于特异 序列的8 bp-30 bp;反向序列SS-R为5'- ACTTCCACCGACCA ATCT -3'，位于特异序列的 580bp-596bp ； (3) 进行 PCR 扩增，扩增体系为；2.5yL lOXPCRBuffer; 2.25yLMg2+(25mmol/ 1);2.5111(1饥？3(2.5111111〇1/1);0.625111引物55斗/55-尺（1011111〇1/1);川1模板（10叫/ y L) ;0. 2U rTaq酶；dd&O补足至25 y L ;反应程序为；94°C预变性5min ;94°C变性30s ; 5(TC退火30s ;72°C延伸45s，循环35次；72°C补充延伸5min ;根据扩增条带诊断桑植缩小 型菌核病。
[0008] 步骤（1)待测样品为桑果、桑叶、桑茎、桑根及±壤样品等。
[0009] 灵敏度测试表明，在25UL体系中，特异性引物SS-F / SS-R能从质量浓度为 1 pg/uL及其W上的核地杖菌DNA模板中扩增出590 bp的特异性条带，由此确定该 SCAR-PCR的检测灵敏度为1 pg/yL。
[0010] 在田间样测试试验中，使用该SCAR-PCR技术检测24个桑园田间样品，只有从缩小 型病桑果提取的总DNA中扩增出了 SCAR-条带序列，从健康桑果、桑叶、桑茎、桑根及±壤样 品（注：其中含有不同的微生物或动植物残体）总DNA中均未扩增到SCAR条带，说明除了 缩小型桑果外，其它样品均不带核地杖菌。
[0011] 本发明的重要意义和价值.桑植缩小型菌核病是危害桑树的重要植物病害，是限 制桑果产业稳定发展的关键限制因子。本发明通过发现的病原核地杖菌特异性保守DNA序 列，获得了特异性SCAR-PCR引物，建立了桑植缩小型菌核病SCAR-PCR诊断检测技术。该技 术的灵敏度高，检测灵敏度为1 异性强，使用方便快捷，检测结果准确可靠，可用 于桑植缩小型菌核病的田间诊断和桑果带菌情况检测检验；同时还可用于病害潜伏期（已 侵染桑果但未显症）诊断，从而对病害做出早期预报，W及时实施必要的控制措施，安全有 效地防治病害的发生和危害，减轻或避免经济损失。同时，可用本发明技术研制开发桑植缩 小型菌核病诊断的商品试剂盒，具有一定的商业应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 本发明包含6幅显示发明结果的图，分别为： 图1.随机引物CS23对不同供试菌株DNA的随机扩增结果指纹图.注：图中M;DL2 000 DM marker;泳道1-5;核地杖菌不同菌株DM片断的随机扩增指纹；泳道6-14分别 是；桑实杯盘菌、肉阜状杯盘菌、拟康宁木霉、盖姆斯木霉、绿木霉、虫毛状木霉、钩状木霉、 油菜菌核病菌、灰霉DNA片断随机扩增指纹；白色线框内为核地杖菌的特异性条带。
[001引 图2.核地杖菌SCAR-PCR检测体系优化电泳图.注;M ;DL2 000 DNA marker; A 为退火温度，泳道 1一7 分别为 60. 0、59. 4、58. 3、56. 3、53. 9、52、50. 7 和 50. 0°C ; B 为 Mg" 浓度，泳道 1-7 分别为 2. 5、2. 25、2、1. 75、1. 5、1. 25 和 1 mmol/L ;C 为 dNTPs 浓度，泳道 1- 7 分别为 025、0. 225、0. 2、0. 175、0. 15、0. 125 和 0. 1 mmol/L ;D 为引物浓度；泳道 1一7 分别 为 0. 35、0. 3、0. 25、0. 2、0. 15、0. 1 和 0. 05 y mol/L ;E 为 rTaq 酶用量，泳道 1-7 分别为 2、 1. 75、1. 5、1. 25、1、0. 75 和 0.抓。
[0014] 图3.用SCA巧I物SS-F/SS-R PCR扩增核地杖菌及相关真菌DNA电泳图.注： M ;DL2 000 DNA marker ;泳道1-5 ;核地杖菌扩增结果；泳道6-14分别是；桑实杯盘菌、 肉阜状杯盘菌、拟康宁木霉、盖姆斯木霉、绿木霉、虫毛状木霉、钩状木霉、油菜菌核病菌、灰 霉；泳道15 ;阴性对照。
[0015] 图4.引物检测核地杖菌DNA灵敏度检测电泳图.注;M ;DL2 000 DNA marker ;泳 道 1-8 ;分别是在 25 Ml 的体系中含有 10ng、lng、100pg、10pg、lpg、100fg、10fg、l^DNA 量的扩增结果。
[001引 图5.桑田样本的SCAR-PCR检测结果电泳图.注;M;DL2 000 DNA marker ;泳道 1 ;阳性对照；泳道2 ;阴性对照；泳道3-4 ;花期桑植；泳道5 ;服大的病果；泳道6 ;缩小的 病果；泳道7 ;服大的病果；泳道8 ;桑树根；泳道9-10 ;桑树茎；泳道11-12 ;桑树叶；泳 道13 - 24 ;随机采集的±样；泳道25- 26:核地杖菌接种2天后未显症的桑果。
[0017] 图6.用SCAR-PCR检测桑田样本核地杖菌的结果电泳图.注；M ;DL2 000 DNA marker ;泳道1 ;阳性对照；泳道2 ;阴性对照；泳道3 -10 ;缩小的病果；泳道11 一 18 ;服大 的病果
【具体实施方式】 供试菌株.用于寻找核地杖菌DNA中SCAR序列的供试菌株共17株，其中核地杖菌5 株，其它桑植菌核病病原菌2株，桑植菌核病菌核寄生菌5株，其它相关植物致病菌2株（表 1)。该些菌株分别从不同类型的菌核病病桑果分离纯化而获得。
[0018] 表1分离桑园系统并用于特异性引物筛选的供试真菌菌株
【权利要求】
1. 一种快速诊断桑椹缩小型菌核病的方法，其特征在于通过以下步骤实现： (1) 取待测样品，采用CTAB方法从样品中提取总DNA; (2) 利用590bp的核地杖菌特异性保守序列设计并筛选得到核地杖菌的一对特异 性SCAR-PCR引物，引物正向序列SS-F为 5' -AGTAAAGAGAACATCAAACTTCG-3'，位于特异 序列的8bp-30bp;反向序列SS-R为5'-ACTTCCACCGACCAATCT-3'，位于特异序列的 580bp-596bp； (3) 进行PCR扩增，扩增体系为：2. 5iiL10XPCRBuffer; 2. 25iiLMg2+，浓度为 25mmol/L; 2. 5iiLdNTPs，浓度为 2. 5mmol/L;0? 625iiL引物SS-F/SS-R，浓度为 10iimol/ L;luL模板，浓度为10ng/iiL;0. 2UrTaq酶；ddH20补足至25iiL;反应程序为：94°C预变 性5min;94°C变性30s; 50°C退火30s;72°C延伸45s，循环35次；72°C补充延伸5min;根 据扩增条带诊断桑椹缩小型菌核病。
【文档编号】C12R1/645GK104513860SQ201510012942
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2015年1月12日 优先权日:2015年1月12日
【发明者】谭万忠, 吴舒劼, 苏正川, 余洋, 毕朝位, 杨宇衡 申请人:西南大学