一种桑椹表面致腐菌的筛选方法
【专利摘要】本发明公开了一种桑椹表面致腐菌的筛选方法，(1)取腐烂的成熟桑椹培养致腐菌液；(2)以果胶或羧甲基纤维素钠为唯一碳源，制备初筛培养基；(3)用无菌生理盐水稀释致腐菌液成不同浓度，取1ml稀释液涂布于初筛培养基上，并在27-28℃条件下培养72-78h，获得菌落群；(4)挑取初筛培养基上长出的菌落至含10％桑椹汁的PDA培养基中进行纯培养，连续分离3-5次，获得的单一菌落即为桑椹致腐菌落。该工艺操作简便，选择性强，分离效果优。
【专利说明】一种桑椹表面致腐菌的筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物领域，具体是涉及桑椹表面致腐菌-链格饱属菌的筛选方法。【背景技术】
[0002]桑椹含有丰富的还原糖、有机酸、维生素和各种矿物质以及花青素和白藜芦醇等功能成分，经常食用有利于提高人体免疫力、延缓衰老、美容养颜等，已被国家卫生部列为药食同源的食品。最新研究显示，桑椹还具有促进造血细胞生长、抗诱变、降血糖、降血脂、护肝等药理作用。桑椹属于浆果类，表皮极薄，果实柔软多汁、呼吸旺盛、果表面有柱状突起，成熟期短，成熟果实采摘或运输过程中极易受到损伤；加之桑椹成熟期正值高温天气，易受病原微生物感染，导致大量腐烂。但桑椹自身的防疫机制对大多数病原微生物都有一定的抵御能力，因此真正能够侵入桑椹内部致病的病原菌也只是极少数。筛选并鉴定出导致桑椹腐败的主要病原物，对建立有效的桑椹保鲜技术具有重要意义，已有的研究表明，致使桑椹腐烂的主要病原微生物为真菌，其次为细菌。
【发明内容】
[0003]本发明目的是提供桑椹表面致腐菌的筛选方法 ，操作简便，选择性强，分离效果优。
[0004]为了达到上述目的，本发明所采用的技术步骤如下:
[0005](I)致腐菌液的制备:取腐烂桑椹，切碎后置于无菌生理盐水中，浓度为20-25质量％，振荡培养，所得培养液即为致腐菌液；
[0006](2)初筛培养基的制备:分别以果胶和羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为唯一碳源，制备初筛培养基，具体是:称取果胶或 CMC-Na0.5%, K2HPO30.1%, (NH4)2S042%, NaCl0.05%,琼脂1.8%，121°C灭菌20-25min即可，其中涉及的百分比为质量百分比；
[0007](3)致腐菌落群培养:将步骤(1)中的致腐菌液用无菌生理盐水稀释成浓度为1-4, 1-5, 10_6，分别取ImL稀释液涂布于步骤(2)获得的初筛培养基上，并在27_28°C条件下培养72-78h，获得菌落群；
[0008](4)单菌落培养:挑取步骤(3)获取的初筛培养基上长出的菌落，接种至含10wt%桑葚汁的PDA培养基中进行纯培养，反复分离3-5次，获得的单一菌落即为致腐菌落。
[0009](5)验证试验:
[0010]A.培养基验证试验:在无菌条件下，将筛选所得的致腐菌落分别接种至含10%桑椹汁和不含桑椹汁的PDA培养基中，27-28 °C培养箱中培养5_7天，观察接种圈生长情况，如果含10%桑椹汁PDA培养基中接种圈明显比不含桑椹汁PDA培养基中接种圈大，则初步说明所筛病原菌为桑椹致腐菌。
[0011]B.桑椹验证试验:在无菌条件下，将筛选所得的致腐菌落涂布于已处理的无菌桑椹表面，然后放至已灭菌的培养箱中，27-28°C培养5-7天，观察其腐败状态是否与初筛以前腐败状态一致，如果是，则初步验证所筛病原菌为桑椹致腐菌。[0012](6)致腐菌株种属特性的分子鉴定:
[0013]采用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取致腐菌菌株总DNA ;依据真核微生物18SrRNA保守性设计真菌通用引物J5PCR扩增，PCR扩增产物与pMD18_T载体的连接；细胞转化；基因克隆与测序，与GenBank数据库比对等分子生物学过程，验证该致腐菌的种属特性，证实该致病菌为链格饱属菌。
[0014]本发明的优点和有益效果:
[0015]1.由于桑椹表皮细胞壁含大量果胶和纤维素，因此发明人以果胶和纤维素为唯一碳源，进行培养基定向筛选，针对性强。
[0016]2.利用含桑椹汁的PDA培养基和不含桑椹汁的PDA培养基进行验证试验，以及无菌桑椹的体表验证，可初步判断所筛选微生物的来源。
[0017]3.分子生物学手段为鉴定所筛选的病原菌属性提供实质性证据。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图 1是在PDA培养基的接种圏示意图，其中，图1a是含桑椹汁的PDA培养基；图1b是不含桑椹汁的PDA培养基；从图中可见含10%桑椹汁PDA培养基中接种圈(82_)明显比不含桑椹汁PDA培养基中接种圈(18_)大，初步说明所筛病原菌为桑椹致腐菌；
[0019]图2是所分离致腐菌菌丝的孢子图。图中可见，菌丝有横隔，孢子椭圆形，说明该致腐菌属真菌类。
[0020]图3是系统发育树分析图。
【具体实施方式】
[0021]实施例1
[0022]一种桑椹表面致腐菌的筛选方法，步骤如下:
[0023](I)致腐菌液的制备:取腐烂的成熟桑椹，切碎后置于的无菌生理盐水中，浓度为20-25质量％，在28°C，2500rpm振荡条件下培养25_30min，所得培养液即为致腐菌液；
[0024](2)初筛培养基的制备:以果胶为唯一碳源，制备初筛培养基，具体是:称取果胶
0.5%, K2HPO30.1%, (NH4)2S042%, NaCl0.05%，琼脂 1.8%，121。。灭菌 20_25min，即可；
[0025](3)致腐菌液培养:将步骤(1)中的致腐菌液用无菌生理盐水稀释成浓度为1-4, 1-5, 10_6(此处不同浓度对后面的结果无影响，主要是便于致腐菌的分离)，分别取Iml稀释液涂布于步骤(2)得到的初筛培养基上，并在27-28°C条件下培养72-78h，获得菌落群;
[0026](4)单菌落培养:挑取初筛培养基上长出的菌落，接种至含10%桑葚汁的PDA培养基中进行纯培养，反复分离3-5次，获得的单一菌落即为桑椹致腐菌落。
[0027]所述的PDA培养基含20%马铃薯滤液(马铃薯去皮，切块，煮沸，煮到熟而不烂，四层纱布过滤)，2%琼脂，2%葡萄糖，自然pH下，121°C灭菌20-25min即可。
[0028](5)验证试验:
[0029]培养基验证试验:在无菌条件下，将筛选所得的桑椹致腐菌落分别接种至含10%桑椹汁和不含桑椹汁的PDA培养基中，27-28°C培养箱中培养5_7天，观察接种圈生长情况(图1)，含10%桑椹汁PDA培养基中接种圈明显比不含桑椹汁PDA培养基中接种圈大，初步说明所筛病原菌为桑椹致腐菌。
[0030]桑椹验证试验:在无菌条件下，将筛选所得的致腐菌落涂布于已处理的无菌桑椹表面，然后放至已灭菌的培养箱中，27-28°C培养5-7天，观察其腐败状态是否与初筛以前腐败状态一致，如果是，则初步验证所筛病原菌为桑椹致腐菌。
[0031](6)致腐菌株种属特性的分子鉴定:
[0032]采用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取致腐菌菌株总DNA ;依据真核微生物18S rRNA保守性，设计真菌通用引物:P1:5’ -GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’ ；P2:5’ -TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3’;经PCR扩增，产物回收，PCR扩增产物与pMD18_T载体的连接；连接产物的感受态细胞转化；转化克隆的筛选与鉴定；基因测序并与GenBank数据库比对，系统发育树分析(图2)等分子生物学过程。证实该致腐菌为链格孢属(基因登录号为KJ489375)，该菌是引起大部分蔬菜和水果病害的重要真菌类群之一。
[0033]实施例2
[0034]与实施例1不同之处在于:初筛培养基以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为唯一碳源，将果胶替换为 CMC-Na。
【权利要求】
1.一种桑椹表面致腐菌的筛选方法，其特征在于包括以下步骤: (1)致腐菌液的制备:取腐烂桑椹，切碎后置无菌生理盐水中，混合物溶液的浓度为20-25%，在加热、振荡条件下培养，所得培养液即为致腐菌液； (2)初筛培养基的制备:按照以下组份和含量制备初筛培养基:果胶或CMC-Na0.5%,K2HPO30.1 %、(NH4) 2S042 %、NaCl0.05 %，琼脂1.8%，混合均匀后，灭菌，即可，其中涉及的百分比为质量百分比； (3)致腐菌落群培养:将步骤(1)中的致腐菌液用无菌生理盐水稀释成稀释液，取Iml稀释液涂布于步骤(2)得到的初筛培养基上，培养，获得菌落群； (4)单菌落培养:挑取初筛培养基上长出的菌落，接种至含桑椹汁的PDA培养基中进行纯培养，反复分离3-5次，获得的单一菌落即为致腐菌落； (5)培养基验证和桑椹验证试验，初步验证所筛的病原菌为桑椹致腐菌； (6)对所筛选的病原菌进行DNA鉴定，确定该病原菌的种属是链格饱属。
2.根据权利要求1所述的桑椹表面致腐菌的筛选方法，其特征在于步骤(1)的培养条件是28°C，2500rpm振荡条件下培养25_30min。
3.根据权利要求1所述的桑椹表面致腐菌的筛选方法，其特征在于步骤(2)的灭菌条件是:121°C 灭菌 20-25min。
4.根据权利要求 1所述的桑椹表面致腐菌的筛选方法，其特征在于步骤(3)的培养条件是:27-28 °C条件下培养72-78h。
5.根据权利要求1所述的桑椹表面致腐菌的筛选方法，其特征在于步骤(3)的稀释液浓度为 10_4，10_5，10_6。
6.根据权利要求1所述的桑椹表面致腐菌的筛选方法，其特征在于步骤(4)PDA培养基中桑椹汁的质量浓度是10%。
【文档编号】C12N1/02GK104031839SQ201410224683
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年5月26日 优先权日:2014年5月26日
【发明者】桂仲争, 方银, 贾俊强 申请人:江苏科技大学