动物肝脏细菌毒素污染的sscp检测方法
【专利摘要】动物肝脏细菌毒素污染的SSCP检测方法，涉及生物【技术领域】，尤其是一种动物肝脏细菌毒素污染的检测方法。本发明通过利用SSCP技术检测被细菌毒素污染的动物肝脏线粒体基因突变，从而将该技术应用到动物性食品安全的评价及鉴定。主要步骤包括提取宿主肝脏线粒体DNA，设计线粒体基因tRNACys-Tyr的特异性引物，运用PCR-SSCP技术对肝脏线粒体tRNACys-Tyr基因片段进行扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测泳动异常条带，对该条带进行纯化后测序，如有tRNACys-Tyr基因片段在第5238与5239碱基处插入了一个碱基T的插入突变，则表明该动物性食品正受到细菌毒素的污染。本发明解决了传统的检测方法的不足，快速，准确，特异，灵敏，重复性好，检测成本低，易于推广应用。
【专利说明】动物肝脏细菌毒素污染的SSCP检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其是一种动物肝脏细菌毒素污染的检测方法。
【背景技术】
[0002]规模化饲养食用动物过程中细菌感染和滥用抗生素经常导致动物发生细菌性感染和细菌毒素污染，肝脏是动物最主要的解毒器官，容易受到细菌毒素的污染，而中国人有食用动物内脏的习惯，因此检测动物肝脏是否受到细菌毒素的污染用于食品安全评价就显得尤为必要。传统的检测方法是分离制备毒素，给小白鼠灌胃，通过临床症状进行判断，或者是采集血液，用昂贵的鲎试验法和高效液相色谱法进行毒素的检测。以上两种方法费时费力，检测成本高，检测结果对于不同种类动物不准确，因此亟待改进检测方法，以便应用到动物性食品安全检测中，从而提高食品安全的监控管理。
【发明内容】
[0003]本发明的目的 在于提供一种准确，快速，简便，灵敏，检测成本低，易于推广应用的利用动物肝脏线粒体基因突变检测动物肝脏细菌毒素污染的方法，该方法可以用于动物性食品安全的评价。
[0004]本发明动物肝脏细菌毒素污染的SSCP检测方法，其特征在于该方法包括以下的步骤:
(1)肝脏线粒体DNA提取；
(2)对肝脏线粒体DNA中，细胞色素tRNAGys_Tyl:基因的5109-5299位置上的基因片段进行扩增；
(3)利用SSCP分析该基因片段的上点突变，来评价动物肝脏是否受到细菌毒素的污染。
[0005]所述的肝脏线粒体DNA提取，具体的提取步骤如下:
(1)取肝脏样本，在预冷的SE溶液中清洗破碎，匀浆后离心，弃沉淀物，取上清液A;
(2)上清液A加入预冷的SE溶液，混匀离心后弃上清液，加入溶液I，混匀室温下静置，再加入溶液II，混匀在0°C下冰浴后，加入4°C预冷的溶液III，混匀于0°C下冰浴，离心弃沉淀，取上清液B ;
(3)上清液B中加入水饱和酚混匀，轻摇后再加入氯仿-异戊醇，上下颠倒轻摇匀后离心，取水相;
(4)水相中加入2倍体积于水相的无水乙醇混匀，在0°C下冰浴，离心后弃上清液，用(TC预冷的70%乙醇洗涤沉淀，洗涤后离心彻底去上清液，所得沉淀即为纯化的线粒体DNA ；
(5)纯化的线粒体DNA自然干燥，然后再加TE溶液，于室温下充分溶解，转入4°C冰箱中过夜，于第二天水浴灭活DNase和RNase ；
其中，试剂配方如下:
(I)SE 溶液，ρΗ7.8，由 0.25Μ 蔗糖、2.5mM CaC12、30mM Tris-HCl 和 IOmM EDTANa2 混合而成；
(2)溶液I (TEN)，ρΗ8.0,由 0.15Μ NaCl、IOmM EDTANa2 和 IOmM Tris-HCl 混合而成；
(3)溶液II，1%SDS，其中含 0.2N NaOH ；
(4)溶液III，3MKac，其中含3M KAc、5M冰乙酸混匀，高压灭菌，室温保存；
(5)TE 溶液，pH: 8.0,由 IOmM Tris-HCU0.1mM EDTANa2 和 20ug/ml DNase-free RNase混合而成。
[0006]所述的线粒体DNA tRNACys-Tyr基因片段的扩增采用的特异性引物序列如表1。
【权利要求】
1.动物肝脏细菌毒素污染的SSCP检测方法，其特征在于该方法包括以下的步骤: (1)肝脏线粒体DNA提取； (2)对肝脏线粒体DNA中，细胞色素tRNAGys_Tyl:基因的5109-5299位置上的基因片段进行扩增； (3)利用SSCP分析该基因片段的上点突变，来评价动物肝脏是否受到细菌毒素的污染。
2.如权利要求1所述的动物肝脏细菌毒素污染的SSCP检测方法，其特征在于所述的肝脏线粒体DNA提取，具体的提取步骤如下: (1)取肝脏样本，在预冷的SE溶液中清洗破碎，匀浆后离心，弃沉淀物，取上清液A; (2)上清液A加入预冷的SE溶液，混匀离心后弃上清液，加入溶液I，混匀室温下静置，再加入溶液II，混匀在0°C下冰浴后，加入4°C预冷的溶液III，混匀于0°C下冰浴，离心弃沉淀，取上清液B ; (3)上清液B中加入水饱和酚混匀，轻摇后再加入氯仿-异戊醇，上下颠倒轻摇匀后离心，取水相; (4)水相中加入2倍体积于水相的无水乙醇混匀，在0°C下冰浴，离心后弃上清液，用(TC预冷的70%乙醇洗涤 沉淀，洗涤后离心彻底去上清液，所得沉淀即为纯化的线粒体DNA ； (5)纯化的线粒体DNA自然干燥，然后再加TE溶液，于室温下充分溶解，转入4°C冰箱中过夜，于第二天水浴灭活DNase和RNase ； 其中，试剂配方如下:
(1)SE 溶液，ρΗ7.8，由 0.25Μ 蔗糖、2.5mM CaC12、30mM Tris-HCl 和 IOmM EDTANa2 混合而成；
(2)溶液I (TEN)，ρΗ8.0,由 0.15Μ NaCl、IOmM EDTANa2 和 IOmM Tris-HCl 混合而成；
(3)溶液II，1%SDS，其中含 0.2N NaOH ； (4)溶液III，3MKac，其中含3M KAc、5M冰乙酸混匀，高压灭菌，室温保存；
(5)TE溶液(pH: 8.0)，由 IOmM Tris-HCl、0.1mM EDTANa2 和 20ug/ml DNase-free RNase混合而成。
3.如权利要求1所述的动物肝脏细菌毒素污染的SSCP检测方法，其特征在于所述的线粒体DNA tRNACys-Tyr基因片段的扩增采用的特异性引物序列如表1:.表1?碁爾freifflPCR切物序負？.序到.12±位垚.扩增托?- 靈M2!.墓, Ρ3: gciaaatecccfactljic- 5109'?猶—191 bp
Ψ4 !Cataggfaaaatigetgag1 PCR反应体系组成如表2:
4.如权利要求1所述的动物肝脏细菌毒素污染的SSCP检测方法，其特征在于所述PCR产物的SSCP分析步骤如下: (1)制备聚丙烯酰胺凝胶电泳装置，对PCR样品进行变性处理，变性完成并将样品置于-20°C冰箱中冷却3-5min ； (2)将经过变性处理的PCR样品依次加入凝胶加样孔中跑胶； (3)将凝胶块剥离，用银染法显色成像； (4)将出现泳动异常的PCR样品，及正常对照的PCR样品进行DNA序列测定，肝脏样本tRNAGys_TiT基因片段在第5238与5239碱基处插入了一个碱基T，即发生了一个插入突变，则表面该样本已受细菌毒素污染。
【文档编号】C12Q1/68GK103993086SQ201410224669
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月27日 优先权日:2014年5月27日
【发明者】严玉霖, 高洪, 赵汝, 陈利平, 陈玲 申请人:云南农业大学