一种现场检测细菌总数的检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型涉及一种现场检测细菌总数的检测试剂盒，该试剂盒包括盒内支架，所述试剂盒还包括盛放荧光素酶的试剂瓶、盛放三磷酸腺苷双磷酸酶的试剂瓶、盛放三磷酸腺苷双磷酸酶的试剂瓶、盛放用于稀释所述三磷酸腺苷双磷酸酶的三磷酸腺苷双磷酸酶缓冲液试剂瓶、盛放表面活性剂的试剂瓶、盛放ATP标准品的试剂瓶及针头式反应过滤器；所述盒内支架设置用于放置针头式反应过滤器的放置槽，以及用于放置试剂瓶的放置槽。该试剂盒具有携带及储藏方便安全、操作简单，结果显示迅速等优点。
【专利说明】
一种现场检测细菌总数的检测试剂盒
技术领域
[0001 ]本实用新型是关于一种现场检测细菌总数的检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]ATP荧光检测技术是通过生物体内ATP(三磷酸腺苷)与荧光素酶、荧光素在离子的作用下反应发光，通过光的强度反应生物污染程度。
[0003]目前，微生物检测主要使用培养法，现场采集样品后带回实验室培养48小时得到细菌总数。这种方法存在很多问题:如48小时出结果缺乏实效性，尤其是在重大活动保障和突发灾害时，无法快速得到结果。另外，样品带到实验室后进行培养，会使一些抗力较低的细菌死亡，不能真正反应现场的微生物污染程度。
[0004]ATP荧光检测技术可以在一分钟内判断生物污染程度，较微生物培养法更具实效性，但目前的ATP荧光检测只能显示相对发光值(RLU)，相对发光值在实际应用中很多不足之处，这主要表现在:(I)不同灵敏度的仪器和试剂检测同一浓度样品的相对发光值(RLU)不同，无法得到统一的结果；(2)在检测细菌总数时无法排除非细菌ATP的干扰，因此无法在现场检测自然环境中的菌落数；(3)由于ATP生物荧光检测时有离子参与反应，自然界中的离子会激发或淬灭反应的荧光，使相对发光值偏差。
[0005]此外，ATP荧光检测技术需要多种试剂，需采用多个容器分装，携带和使用十分不方便，并且考虑到现场检测细菌总数环境的多变性，操作人员实际操作时，极容易将试剂的使用顺序弄混，造成无法快速得到结果。
[0006]有鉴于此，本实用新型人凭借多年从事相关行业的经验与实践，提出一种现场检测细菌总数的检测试剂盒，以克服现有技术的缺陷。
【实用新型内容】
[0007]本实用新型的目的在于提供一种现场检测细菌总数的检测试剂盒，该试剂盒具有携带及储藏方便安全、操作简单，结果显示迅速等优点。
[0008]为实现上述目的，本实用新型提供一种现场检测细菌总数的检测试剂盒，该试剂盒包括盒内支架，其中:所述试剂盒还包括盛放荧光素酶的试剂瓶、盛放用于稀释荧光素酶的缓冲液的试剂瓶、盛放三磷酸腺苷双磷酸酶的试剂瓶、盛放用于稀释三磷酸腺苷双磷酸酶的缓冲液的试剂瓶、盛放表面活性剂的试剂瓶、盛放ATP标准品的试剂瓶及针头式反应过滤器；
[0009]所述盒内支架设置用于放置针头式反应过滤器的放置槽，以及用于放置试剂瓶的放置槽；
[0010]所述针头式反应过滤器包括反应杯及针头式过滤器，该反应杯顶部设置加样孔，底部设置排液孔且排液孔上设置密闭嘴塞，反应杯内设置孔径0.45 ± 0.2μπι的滤膜，滤膜将反应杯内部分隔为滤膜上部的微生物截留空间以及滤膜下部的空间；
[0011]所述针头式过滤器安装固定于反应杯的加样孔上方，针头式过滤器的滤液出口与反应杯滤膜上部的微生物截留空间连通。
[0012]本实用新型现场检测细菌总数的检测试剂盒具有携带、储藏方便安全、操作简单，结果显示迅速等优点。
[0013]根据本实用新型的具体实施方案，在所述的现场检测细菌总数的检测试剂盒中，以放置盛放三磷酸腺苷双磷酸酶的试剂瓶的槽为参考点，盛放用于稀释三磷酸腺苷双磷酸酶的缓冲液的试剂瓶放置于所述参考点上方的槽内，盛放表面活性剂的试剂瓶放置于所述参考点下方的槽内；
[0014]盛放荧光素酶的试剂瓶放置于所述参考点左侧上方的槽内，所述盛放用于稀释荧光素酶缓冲液的试剂瓶放置于所述参考点左侧下方的槽内；
[0015]盛放ATP标准品的试剂瓶放置于所述参考点右侧上方的槽内，所述针头式反应过滤器放置于该参考点右侧下方的槽内。
[0016]优选地，以放置盛放三磷酸腺苷双磷酸酶的试剂瓶的槽为参考点，盛放用于稀释三磷酸腺苷双磷酸酶的缓冲液的试剂瓶放置于所述参考点正上方的槽内，盛放表面活性剂的试剂瓶放置于所述参考点正下方的槽内；
[0017]盛放荧光素酶的试剂瓶放置于所述参考点左侧上方的槽内，盛放用于稀释荧光素酶缓冲液的试剂瓶放置于所述参考点左侧下方的槽内；且所述左侧下方的槽位于所述左侧上方的槽的正下方；
[0018]盛放ATP标准品的试剂瓶放置于所述参考点右侧上方的槽内，所述针头式反应过滤器放置于所述参考点右侧下方的槽内，且所述右侧下方的槽位于所述右侧上方的槽的正下方。
[0019]按如上位置关系放置本试剂盒内各部件，使检测者能根据所提供的检测方法逐步使用试剂盒内的部件，不容易造成使用时的混乱。
[0020]根据本实用新型的具体实施方案，在所述的现场检测细菌总数的检测试剂盒中，所述荧光素酶为冻干的荧光素酶，所述三磷酸腺苷双磷酸酶为冻干的三磷酸腺苷双磷酸酶;所述的表面活性剂为季铵盐阳离子表面活性剂;所述的用于稀释荧光素酶的缓冲液为PBS溶液;所述的用于稀释三磷酸腺苷双磷酸酶的缓冲液为PBS溶液。以上试剂均可商够获得，其中，三磷酸腺苷双磷酸酶包含一磷酸酶和二磷酸酶，两种酶共同作用可将三磷酸腺苷降解为一磷酸腺苷，可有效排除非细菌ATP对细菌检测的干扰，其降解效率可达到90%以上。
[0021]根据本实用新型的具体实施方案，在所述的现场检测细菌总数的检测试剂盒中，所述针头式过滤器的滤液出口与反应杯的加样孔之间通过嵌合或螺纹方式密封连接。
[0022]根据本实用新型的具体实施方案，在所述的现场检测细菌总数的检测试剂盒中，所述针头式过滤器为孔径5±0.2μπι的针头式过滤器。采用这种规格的针头式过滤膜可便于滤除待测样品液体中的大颗粒与杂质。
[0023]根据本实用新型的具体实施方案，在所述的现场检测细菌总数的检测试剂盒中，所述反应杯容积为ImL?I OOmL。
[0024]根据本实用新型的具体实施方案，在所述的现场检测细菌总数的检测试剂盒中，所述反应杯为适用于荧光检测仪进行检测的透明反应杯。采用透明的反应杯可直接将反应后的待测液置于荧光检测仪内，减少了待测液被污染的可能。
[0025]根据本实用新型的具体实施方案，在所述的现场检测细菌总数的检测试剂盒中，所述加样孔设置在反应杯顶部中间位置，所述排液孔设置在反应杯底部中间位置。采用这种设置更有利于ATP生物荧光法检测过程中试剂的加入等操作。
[0026]根据本实用新型的具体实施方案，在所述的现场检测细菌总数的检测试剂盒中，所述反应杯内的滤膜固定设置在反应杯内靠近底部的位置。
[0027]本实用新型试剂瓶内盛放的表面活性剂为季铵盐表面活性剂，其可抑三磷酸腺苷双磷酸酶的抑制剂，从而抑制三磷酸腺苷的降解作用，并可快速使细菌细胞壁的多糖结构崩解，有效提取细菌细胞中的三磷酸腺苷。
[0028]本实用新型试剂瓶内盛放的冻干的荧光素酶可为冻干的重组型荧光素酶，具有较好的热稳定性，其可商够获得，使用时与所述用于稀释荧光素酶缓冲液配兑后与从细菌细胞中提取的三磷酸腺苷反应发光得到相对发光值。
[0029]本实用新型试剂瓶内盛放的ATP标准品为已知量的液态ATP纯品，其可商购获得，通过已知量的ATP标准品计算出细菌内ATP的含量，并计算细菌个数。使用盛放ATP标准品试剂瓶可以排除外界环境对实验的干扰(如离子浓度、反应温度等)。
[0030]本实用新型的试剂盒在用于ATP生物荧光法检测微生物时，可采用如下操作进行:
[0031](I)打开所述反应杯底部排液孔上的密闭嘴塞，使用无菌注射器取一定体积待检样品液体(如自来水或食品浸取液)，加入针头式过滤器的加样口，待测样品液体通过针头式过滤器，过滤除去大的颗粒和杂质，进入反应杯内，流经反应杯内的滤膜，待测样品液体中的细菌被滤膜截留；
[0032](2)将使用所述三磷酸腺苷双磷酸酶缓冲液稀释后的三磷酸腺苷双磷酸酶加入针头式反应过滤器内，静置10分钟；
[0033](3)排空针头式反应过滤器的液体；
[0034](4)在针头式反应过滤器的液体中，加入高效表面活性剂，提取细菌内的三磷酸腺苷；
[0035](5)在针头式反应过滤器的液体中，加入使用缓冲液稀释后的荧光素酶；
[0036](6)检测相对发光值RLUl;
[0037](7)加入ATP标准品并再次检测相对发光值RLU2，通过已知量的ATP标准品按RLUl/RLU2 = X/A( X为样品中ATP含量，A为使用的ATP标准品的量)，计算出细菌内ATP的含量，并计算细菌个数。
[0038]综上所述，本实用新型提供一种现场检测细菌总数的检测试剂盒，该试剂盒具有携带、储藏方便安全、操作简单，结果显示迅速等优点。
【附图说明】
[0039]以下附图仅旨在于对本实用新型做示意性说明和解释，并不限定本实用新型的范围，其中:
[0040]图1为本实用新型现场检测细菌总数的检测试剂盒的结构示意图；图中标号具有如下意义:
[0041 ] 100:试剂盒；101:盒内支架；102?107:槽;108:放置针头式反应过滤器的槽；
[0042]图2为本实用新型针头式反应过滤器的结果示意图，图中标号具有如下意义:
[0043]201:进样端；202:针头式过滤器；203:加样孔；204:反应杯；205:滤膜；206:排液孔;207:密闭嘴塞。
【具体实施方式】
[0044]为了对本实用新型的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照【附图说明】本实用新型的【具体实施方式】。
[0045]如图1所示，本实用新型提供一种现场检测细菌总数的检测试剂盒100，该试剂盒100包括盒内支架101，其中，所述试剂盒100还包括盛放冻干的荧光素酶的试剂瓶、盛放用于稀释荧光素酶的缓冲液的试剂瓶、盛放冻干的三磷酸腺苷双磷酸酶的试剂瓶、盛放用于稀释三磷酸腺苷双磷酸酶的缓冲液的试剂瓶、盛放表面活性剂的试剂瓶、盛放ATP标准品的试剂瓶及针头式反应过滤器；
[0046]所述盒内支架101设置用于放置所述针头式反应过滤器的槽108，以及用于放置试剂瓶的槽；
[0047]所述针头式反应过滤器如图2所示，其包括反应杯204及针头式过滤器202，该针头式过滤器滤膜孔径为5 ± 0.2μπι，该反应杯204顶部设置加样孔203，底部设置排液孔206且排液孔上设置密闭嘴塞207，反应杯204内设置孔径为0.45±0.2μπι的滤膜205，滤膜205将反应杯204内部分隔为滤膜上部的微生物截留空间以及滤膜下部的空间；
[0048]所述针头式过滤器202安装固定于反应杯204的加样孔203上方，针头式过滤器的滤液出口与反应杯滤膜上部的微生物截留空间连通。
[0049]以放置盛放三磷酸腺苷双磷酸酶的试剂瓶的槽104为参考点，盛放用于稀释三磷酸腺苷双磷酸酶的缓冲液的试剂瓶放置于所述参考点正上方的槽105内，盛放表面活性剂的试剂瓶放置于所述参考点正下方的槽106内；
[0050]盛放荧光素酶的试剂瓶放置于所述参考点左侧上方的槽102内，盛放用于稀释荧光素酶缓冲液的试剂瓶放置于所述参考点左侧下方的槽103内；且所述左侧下方的槽103位于所述左侧上方的槽102的正下方；
[0051 ]盛放ATP标准品的试剂瓶放置于所述参考点右侧上方的槽107内，所述针头式反应过滤器放置于所述参考点右侧下方的槽108内，且所述右侧下方的槽108位于所述右侧上方的槽107的正下方。
[0052]使用时，用1mL注射器吸取1mL前处理后的液态样品将针头式反应过滤器的进样端201连接到注射器上，加压后样液通过反应杯的腔体并从排水口 206排出，样品中细菌被截流在0.45μπι滤膜205。
[0053]将放置于槽105内的试剂瓶中的缓冲液与放置于槽104内试剂瓶中的冻干的三磷酸腺苷双磷酸酶配兑后，用移液器取50μ1，从针头式反应过滤器的加样孔203加入，静置10分钟，使其与滤膜205上的截流物充分反应后排空，用移液器取50μ1放置于槽106内试剂瓶中的高效表面活性剂，从针头式反应过滤器的加样孔203加入并振荡，将放置于槽102内的试剂瓶中的冻干的荧光素酶于放置于槽103内的试剂瓶中的用于稀释荧光素酶缓冲液配兑后，用移液器取400μ1，从针头式反应过滤器的加样孔203加入，放入ATP荧光检测仪检测得到相对发光值RLUl，再移取10μ1放置于槽107内的试剂瓶中的ATP标准品，从针头式反应过滤器的加样孔203加入，再次检测得到相对发光值RLU2，通过已知量的ATP标准品按RLUl/RLU2 = X/A( X为样品中ATP含量，A为使用的ATP标准品的量)，计算出细菌内ATP的含量，并计算细菌个数。
[0054]综上所述，本实用新型所提供现场检测细菌总数的检测试剂盒具有携带、储藏方便安全、操作简单，结果显示迅速等优点，并且应用该试剂盒的应用简单便捷，能够在短时间内完成样品中细菌总量的检测，大大缩短了细菌检测的时间，可广泛用于食品安全、医疗卫生机构、疫源地消毒效果、实验室、制药、食品加工环节的现场微生物快速检。
[0055]以上所述仅为实用新型示意性的【具体实施方式】，并非用以限定本实用新型的范围。任何本领域的技术人员，在不脱离本实用新型的构思和原则的前提下所作出的等同变化与修改，均应属于本实用新型保护的范围。
【主权项】
1.一种现场检测细菌总数的检测试剂盒，该试剂盒包括盒内支架，其特征在于:所述试剂盒还包括盛放荧光素酶的试剂瓶、盛放用于稀释荧光素酶的缓冲液的试剂瓶、盛放三磷酸腺苷双磷酸酶的试剂瓶、盛放用于稀释三磷酸腺苷双磷酸酶的缓冲液的试剂瓶、盛放表面活性剂的试剂瓶、盛放ATP标准品的试剂瓶及针头式反应过滤器； 所述盒内支架设置用于放置针头式反应过滤器的放置槽，以及用于放置试剂瓶的放置槽； 所述针头式反应过滤器包括反应杯及针头式过滤器，该反应杯顶部设置加样孔，底部设置排液孔且排液孔上设置密闭嘴塞，反应杯内设置孔径0.45 ± 0.2μπι的滤膜，滤膜将反应杯内部分隔为滤膜上部的微生物截留空间以及滤膜下部的空间； 所述针头式过滤器安装固定于反应杯的加样孔上方，针头式过滤器的滤液出口与反应杯滤膜上部的微生物截留空间连通。2.根据权利要求1所述的现场检测细菌总数的检测试剂盒，其特征在于:以放置盛放三磷酸腺苷双磷酸酶的试剂瓶的槽为参考点，盛放用于稀释三磷酸腺苷双磷酸酶的缓冲液的试剂瓶放置于所述参考点上方的槽内，盛放表面活性剂的试剂瓶放置于所述参考点下方的槽内； 盛放荧光素酶的试剂瓶放置于所述参考点左侧上方的槽内，所述盛放用于稀释荧光素酶缓冲液的试剂瓶放置于所述参考点左侧下方的槽内； 盛放ATP标准品的试剂瓶放置于所述参考点右侧上方的槽内，所述针头式反应过滤器放置于该参考点右侧下方的槽内。3.根据权利要求2所述的现场检测细菌总数的检测试剂盒，其特征在于:以放置盛放三磷酸腺苷双磷酸酶的试剂瓶的槽为参考点，盛放用于稀释三磷酸腺苷双磷酸酶的缓冲液的试剂瓶放置于所述参考点正上方的槽内，盛放表面活性剂的试剂瓶放置于所述参考点正下方的槽内； 盛放荧光素酶的试剂瓶放置于所述参考点左侧上方的槽内，盛放用于稀释荧光素酶缓冲液的试剂瓶放置于所述参考点左侧下方的槽内；且所述左侧下方的槽位于所述左侧上方的槽的正下方； 盛放ATP标准品的试剂瓶放置于所述参考点右侧上方的槽内，所述针头式反应过滤器放置于所述参考点右侧下方的槽内，且所述右侧下方的槽位于所述右侧上方的槽的正下方。4.根据权利要求1?3中任一项所述的现场检测细菌总数的检测试剂盒，其特征在于:所述荧光素酶为冻干的荧光素酶，所述三磷酸腺苷双磷酸酶为冻干的三磷酸腺苷双磷酸酶;所述的表面活性剂为季铵盐阳离子表面活性剂;所述的用于稀释荧光素酶的缓冲液为PBS溶液;所述的用于稀释三磷酸腺苷双磷酸酶的缓冲液为PBS溶液。5.根据权利要求1?3中任一项所述的现场检测细菌总数的检测试剂盒，其特征在于:所述针头式过滤器的滤液出口与反应杯的加样孔之间通过嵌合或螺纹方式密封连接。6.根据权利要求1?3中任一项所述的现场检测细菌总数的检测试剂盒，其特征在于:所述针头式过滤器为孔径5 ± 0.2μπι的针头式过滤器。7.根据权利要求1?3中任一项所述的现场检测细菌总数的检测试剂盒，其特征在于:所述反应杯容积为ImL?I OOmL。8.根据权利要求1?3中任一项所述的现场检测细菌总数的检测试剂盒，其特征在于，所述反应杯为适用于荧光检测仪进行检测的透明反应杯。9.根据权利要求1?3中任一项所述的现场检测细菌总数的检测试剂盒，其特征在于:所述加样孔设置在反应杯顶部中间位置，所述排液孔设置在反应杯底部中间位置。10.根据权利要求1?3中任一项所述的现场检测细菌总数的检测试剂盒，其特征在于:所述反应杯内的滤膜固定设置在反应杯内靠近底部的位置。
【文档编号】C12M1/34GK205420407SQ201521049595
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年12月16日
【发明人】王志, 喻晓峰, 胡国庆, 陆烨
【申请人】北京智峰博泰生物科技有限公司