一种桑园土壤氨氧化细菌的高效分离与鉴定方法
【专利摘要】本发明公开了一种桑园土壤氨氧化细菌的高效分离与鉴定方法，包括以下步骤：氨氧化细菌的富集；分离纯化氨氧细菌；分离微生物的鉴定。本发明利用氨氧化细菌较喜欢偏碱性生长环境的特性，将富集培养液的pH值调到8.5，同时将分离培养液的pH值调到8.0，此方法能从桑园土壤中富集培养到10类氨氧化细菌，极大的提高了富集效率，并采用Biolog微生物鉴定系统对其进行快速鉴定，为桑园土壤氨氧化细菌的利用奠定了基础。
【专利说明】
一种桑园土壤氨氧化细菌的高效分离与鉴定方法
技术领域
[0001 ]本发明属于微生物生态学技术领域，具体地说，涉及一种桑园土壤氨氧化细菌的高效分离与鉴定方法。
【背景技术】
[0002]氧氨氧化细菌(AOB)是可以将NH3转化为NO2—，并且仅以该反应中产生的能量为独一的能量来源来进行氨氧化反应的微生物，在细菌总数中所占比例极小，但广泛存在于土壤、海洋以及湖泊等环境中。氧氨氧化细菌为革兰氏阴性菌，并且仅以化学反应生成的能量进行自养生长，偏好稍碱性的生长条件，以NH3作为唯一能量来源，以CO2作为唯一碳源，因此其能量利用率偏低，生长极其缓慢，难以分离培养。研究表明在PH为7.0-8.5，温度24°C-28°C的条件下最有利于该菌的生长，当pH低于6.5时，一般不利于该菌的生长，实验证明在增多氨氧化细菌的情况，该氨氧化细菌能够促进土壤环境中的氨氧化进程，在土壤中加入氨氧化细菌，土壤的氨氧化活性得到显著提高，土壤硝化作用增强。
[0003]前人基于对氨氧化微生物分离的研究表明了氨氧化细菌群落的多样性和功能的重要性，然而氨氧化细菌难培养且生长速度很慢，前人采用PH值为7.8-8.0的富集分离培养基分别从污泥和和水产养殖废水中分离到一株和两株氨氧化微生物，通过16S rDNA测序，在GenBank上比对与亚硝化单胞菌(Nitrosomonas)及假单胞菌(Pseudomonas)的相似性达99%，此方法分离到的氨氧化细菌较少，16S rDNA测序不能准确的鉴定到种，存在一定的局限性，且分离到的氨氧化细菌的覆盖范围不高，阻碍了对其多样性及功能的分析和利用，因此迫切一种土壤氨氧化细菌的高效分离与鉴定方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种桑园土壤氨氧化细菌的高效分离与鉴定方法，该方法利用氨氧化细菌较喜欢偏碱性生长环境的特性，将富集培养液的pH值调到8.5，同时将分离培养液的pH值调到8.0，此方法能从桑园土壤中富集培养到10类氨氧化细菌，极大的提高了富集效率，并采用B1log微生物鉴定系统对其进行快速鉴定，为桑园土壤氨氧化细菌的利用奠定了基础。
[0005]其具体技术方案为:
[0006]—种桑园土壤氨氧化细菌的高效分离与鉴定方法，包括以下步骤:
[0007]步骤1、氨氧化细菌的富集:取1.0g新鲜桑园土壤样品，加入装有富集培养液的试管中，在28 °C恒温培养箱中培养14天，吸取培养液5滴于白瓷板穴中，依次加入格利斯试剂A液、B液I或2滴，如有亚硝酸:NO2-存在，则呈红色，表示有亚硝化细菌存在;如果检测到红色，向该管中添加ImL的营养补充液，继续培养。每隔3?4天用格利斯试剂检测一次，当检测的培养液为深红色时，吸取ImL的培养液至新鲜富集培养液中再培养，至检测液为深红色，此为高度富集的氨氧化细菌培养液；
[0008]步骤2、分离纯化氨氧细菌:取10mL步骤I所述二次富集至检测为深红色的培养液，将其涂布到分离培养基平板上，28°C培养1-2周以上，同时不断观察菌落生长情况，然后挑取圆形无色透明，略显黄色的单菌落划线至BUG鉴定培养基上培养；
[0009]步骤3、分离微生物的鉴定:用接种环挑取在鉴定培养基上划线分离的单菌落，至鉴定培养液IF-A管壁上，用接种环将菌打散，然后将其与鉴定液混合，至比浊计上，使其混度在90?95%之间，然后将接种液用排枪接到鉴定培养板上，根据每个菌的生长速度，在28°C培养箱中培养I?7天，然后采用B1logy Microstst1n(MicroStat1n?,USA)微生物鉴定系统进行快速鉴定，鉴定分离到的氨氧化细菌包括Pseudomonas，Arthrobacter，Ochrobactrum,Roseomonas,Enterobacter,Gordonia,Delftia,Pseudoxanthomonas，Mycobacterium，Stenotrophomonas。
[00? O]进一步，所述Pseudomonas是培养氨氧化细菌的主要类群。
[0011]进一步，步骤I中所述富集培养液的配制方法具体为:称取(NH4)2SO42.50g，K2HPO40.35g,MgSO4.7H20 0.25g,CaCl2 0.18g，用5%的Na2CO3调pH到8.5，定容至500mL，分装 1mL/试管，121 °C 灭菌 30min。
[0012]进一步，步骤I中所述营养补充液的配制方法具体为:称取(NH4)2S045.50g，定容至lOOmL，121 °C 灭菌 30min。
[0013]进一步，步骤I中所述格利斯试剂的配制方法具体为:A液，0.5g对氨基苯磺酸加到150mL 200g/L的乙酸溶液中；13液:Iga-萘胺加到20mL蒸馈水和150mL 200g/L的乙酸溶液中。
[0014]进一步，步骤2中所述分离培养基的配制方法具体为:称取(NH4)2SO42.0Og,KH2PO40.75g,NaH2PO4 0.25g,MgS04.7H20 0.03g,MnSO4.4H20,CaCO3 5.0Og，用5%的Na2CO3调pH到8.0，定容至lOOOmL，再加16g琼脂条，所述琼脂条要提前三天用纯水浸泡，每隔一天换一次水，直至琼脂条浸泡至透明，121°C灭菌30min后倒平板备用。
[0015]进一步，步骤2中所述BUG鉴定培养基的配制方法具体为:用B1log鉴定系统配备的B1log BUGTM Agar按照每10mL蒸馏水6g的比例制备鉴定培养基，121°C灭菌30min后倒平板备用。
[0016]与现有技术相比，本发明的有益效果为:
[0017]本发明针对桑园土壤及氨氧化细菌自身的特性，将富集桑园土壤氨氧化细菌的培养液的pH值调到8.5，同时将分离培养液的pH值调到8.0，该方法从桑园土壤中富集培养到1类氨氧化细菌，包括Pseudomonas，Arthrobac ter，Ochrobactrum，Roseomonas，Enterobacter，Gordonia，Delftia，Pseudoxanthomonas,Mycobacterium，Stenotrophomonas，极大的提高了富集效率。而前人对不同试验材料采用pH值为7.8-8.0的富集与分离培养液仅分离到2个属的氨氧化细菌，且经16S rDNA测序与GenBank比对并未准确的鉴定到种，本发明中分离的氨氧化细菌采用B1log微生物鉴定系统对其进行快速鉴定，简便易行，且结果准确可靠，可为其他植物土壤中氨氧化细菌的分离提供参考，并为桑园土壤氨氧化细菌的利用奠定了基础。
【具体实施方式】
[0018]为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实例进一步阐述本发明。
[0019]一种桑园土壤氨氧化细菌的高效分离与鉴定方法，包括以下步骤:
[0020]步骤1、氨氧化细菌的富集:取1.0g新鲜桑园土壤样品，加入装有富集培养液的试管中，在28 °C恒温培养箱中培养14天，吸取培养液5滴于白瓷板穴中，依次加入格利斯试剂A液、B液I或2滴，如有亚硝酸:NO2-存在，则呈红色，表示有亚硝化细菌存在;如果检测到红色，向该管中添加ImL的营养补充液，继续培养。每隔3?4天用格利斯试剂检测一次，当检测的培养液为深红色时，吸取ImL的培养液至新鲜富集培养液中再培养，至检测液为深红色，此为高度富集的氨氧化细菌培养液；
[0021]步骤2、分离纯化氨氧细菌:取10mL步骤I所述二次富集至检测为深红色的培养液，将其涂布到分离培养基平板上，28°C培养1-2周以上，同时不断观察菌落生长情况，然后挑取圆形无色透明，略显黄色的单菌落划线至BUG鉴定培养基上培养；
[0022]步骤3、分离微生物的鉴定:用接种环挑取在鉴定培养基上划线分离的单菌落，至鉴定培养液IF-A管壁上，用接种环将菌打散，然后将其与鉴定液混合，至比浊计上，使其混度在90?95%之间，然后将接种液用排枪接到鉴定培养板上，根据每个菌的生长速度，在28°C培养箱中培养I?7天，然后采用B1logy Microstst1n(MicroStat1n?,USA)微生物鉴定系统进行快速鉴定，鉴定分离到的氨氧化细菌包括Pseudomonas，Arthrobacter，Ochrobactrum,Roseomonas,Enterobacter,Gordonia,Delftia,Pseudoxanthomonas，Mycobacterium，Stenotrophomonas。
[0023]所述Pseudomonas是培养氨氧化细菌的主要类群。
[0024]步骤I中所述富集培养液的配制方法具体为:称取(NH4)2SO4 2.50g,K2HPO4 0.35g，MgSO4.7H20 0.25g,CaCl2 0.18g，用5%的Na2CO3调pH到8.5，定容至500mL，分装1mL/试管，121 °C 灭菌 30min。
[0025]步骤I中所述营养补充液的配制方法具体为:称取(NH4)2S045.50g，定容至lOOmL，121 °C 灭菌 30min。
[0026]步骤I中所述格利斯试剂的配制方法具体为:A液，0.5g对氨基苯磺酸加到150mL200g/L的乙酸溶液中；B液:Iga-萘胺加到20mL蒸馏水和150mL 200g/L的乙酸溶液中。格利斯试剂能与亚硝酸反应生成一种紫红色的化合物(C1QH6NH2-N:N-C6H4-S03H)，培养液是否变红及其颜色深浅可指示NO2-的生成及其浓度。
[0027]步骤2中所述分离培养基的配制方法具体为:称取(NH4)2SO4 2.0Og,KH2PO4 0.75g，NaH2PO4 0.25g，MgS04.7H20 0.03g,MnSO4.4H20,CaCO3 5.0Og，用5%的Na2CO3调pH到8.0，定容至lOOOmL，再加16g琼脂条，所述琼脂条要提前三天用纯水浸泡，每隔一天换一次水，直至琼脂条浸泡至透明，121°C灭菌30min后倒平板备用。
[0028]步骤2中所述BUG鉴定培养基的配制方法具体为:用B1log鉴定系统配备的B1logBUGTM Agar按照每10mL蒸馏水6g的比例制备鉴定培养基，121°C灭菌30min后倒平板备用。
[0029]以上所述，仅为本发明最佳实施方式，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
【主权项】
1.一种桑园土壤氨氧化细菌的高效分离与鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤1、氨氧化细菌的富集:取1.0g新鲜桑园土壤样品，加入装有富集培养液的试管中，在28°C恒温培养箱中培养14天，吸取培养液5滴于白瓷板穴中，依次加入格利斯试剂A液、B液I或2滴，如有亚硝酸:NO2-存在，则呈红色，表示有亚硝化细菌存在;如果检测到红色，向该管中添加ImL的营养补充液，继续培养，每隔3?4天用格利斯试剂检测一次，当检测的培养液为深红色时，吸取ImL的培养液至新鲜富集培养液中再培养，至检测液为深红色，此为高度富集的氨氧化细菌培养液； 步骤2、分离纯化氨氧细菌:取10mL步骤I所述二次富集至检测为深红色的培养液，将其涂布到分离培养基平板上，28°C培养1-2周以上，同时不断观察菌落生长情况，然后挑取圆形无色透明，略显黄色的单菌落划线至BUG鉴定培养基上培养； 步骤3、分离微生物的鉴定:用接种环挑取在鉴定培养基上划线分离的单菌落，至鉴定培养液IF-A管壁上，用接种环将菌打散，然后将其与鉴定液混合，至比浊计上，使其混度在90?95%之间，然后将接种液用排枪接到鉴定培养板上，根据每个菌的生长速度，在28°C培养箱中培养I?7天，然后采用B1logy Microstst1n微生物鉴定系统进行快速鉴定，鉴定分离到的氨氧化细菌包括Pseudomonas ,Arthrobacter，Ochrobactrum, Roseomonas，Enterobacter,Gordonia,Delftia,Pseudoxanthomonas,Mycobacterium,Stenotrophomonas。2.根据权利要求1所述的桑园土壤氨氧化细菌的高效分离与鉴定方法，其特征在于，所述Pseudomonas是培养氨氧化细菌的主要类群。3.根据权利要求1所述的桑园土壤氨氧化细菌的高效分离与鉴定方法，其特征在于，步骤I中所述富集培养液的配制方法具体为:称取(NH4)2SO4 2.50g, K2HPO4 0.35g,MgS04.7H20 0.25g，CaCl20.18g，用5% 的Na2CO3调pH到8.5，定容至500mL，分装1mL/试管，121°C灭菌30min。4.根据权利要求1所述的桑园土壤氨氧化细菌的高效分离与鉴定方法，其特征在于，步骤I中所述营养补充液的配制方法具体为:称取(順4) 2S04 5.50g，定容至I OOmL，121°C灭菌30mino5.根据权利要求1所述的桑园土壤氨氧化细菌的高效分离与鉴定方法，其特征在于，步骤I中所述格利斯试剂的配制方法具体为:A液，0.5g对氨基苯磺酸加到150mL 200g/L的乙酸溶液中；8液:1ga-萘胺加到20mL蒸馏水和150mL 200g/L的乙酸溶液中。6.根据权利要求1所述的桑园土壤氨氧化细菌的高效分离与鉴定方法，其特征在于，步骤2中所述分离培养基的配制方法具体为:称取(NH4)2SO4 2.0Og,KH2PO40.75g,NaH2PO40.25g,MgSO4.7H20 0.03g,MnSO4.4H20，CaC035.00g，用5%的Na2CO3调pH到8.0，定容至lOOOmL，再加16g琼脂条，所述琼脂条要提前三天用纯水浸泡，每隔一天换一次水，直至琼脂条浸泡至透明，121°C灭菌30min后倒平板备用。7.根据权利要求1所述的桑园土壤氨氧化细菌的高效分离与鉴定方法，其特征在于，步骤2中所述BUG鉴定培养基的配制方法具体为:用B1log鉴定系统配备的B1log BUGTMAgar按照每10mL蒸馏水6g的比例制备鉴定培养基，121°C灭菌30min后倒平板备用。
【文档编号】C12Q1/04GK105907839SQ201610366826
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】胡兴明, 于翠, 邓文, 李勇, 熊超, 莫荣利
【申请人】湖北省农业科学院经济作物研究所