对抗害虫的方法
【专利说明】对抗害虫的方法
[0001] Bt代表苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis) (Bt)，一种所谓的常见土壤细 菌，因为它首次在德国的图林根（Thuringia)地区被分离。
[0002] Bt产生使一些有害昆虫的幼虫麻痹的蛋白质，所述有害昆虫包括棉铃虫和亚洲玉 米螟和欧洲玉米螟，所有这些都是常见的植物害虫，其感染对重要作物产生毁灭性的影响。
[0003] Bt可容易地通过发酵进行培养。因此，在过去的40年间，Bt已经在世界范围内被 农民用作杀虫剂。有机农业特别地受益于Bt杀虫剂，因为Bt杀虫剂是非常少的被有机标 准允许的杀虫剂之一。该杀虫剂可作为喷雾剂而施用，或作为地面施用而施用。该杀虫剂 具有颗粒型和液化型。
[0004] 科学家已从细菌中找到负责产生杀虫蛋白的Bt基因并将其引入至植物的基因组 中。因此，这些植物具有内在的对抗目标害虫的保护机制。由植物产生的蛋白质不会被冲 洗掉，也不会被日光破坏。因此，不论在什么情况下，所述植物都可连续免受例如棉铃虫或 玉米螟的侵害。
[0005] 1999年，报道了Bt玉米的花粉对黑脉金斑蝶幼虫具有不利影响。该报道引起了人 们对Bt作物对非目标生物的风险的关注和疑问。然而，最近的研究表明Bt玉米对田间的 黑脉金斑蝶造成"可忽略的"威胁。美国和加拿大的科学家的协作研究成果已经得到信息 以形成Bt玉米对黑脉金斑蝶种群的影响的正式风险评估。他们的结论是：在多数市售的杂 交体中，花粉中的Bt表达较低，并且实验室和田间研究显示，在田间会遇到的任意花粉密 度下都没有急性毒性作用。
[0006] 2011年末，约23. 9百万公顷的土地种植了含Bt基因的作物。
[0007] 兰诺定（Ryanodine)受体调控剂，例如二酰胺（例如氯虫酰胺 (Chlorantraniliprole) (1-1)、溴氰虫酰胺（Cyantraniliprole) (1-2)和氟虫酰胺 (Flubendiamide)(I-3)(已知于 EP-A 1 006 107))和二酰胺化合物（1-4)(已知于 TO 2007/144100)的杀虫活性是已知的。兰诺定受体调控剂为例如：
[0008] 氯虫酰胺（1-1)(氯虫酰胺（Rynaxypyr))
[0009]
[0010] 溴氰虫酰胺（1-2)(溴氰虫酰胺（Cyacypyr))
[0011]
[0012] 氟虫酰胺（1-3)
[0013]
[0014] 二酰胺化合物（1-4)，其可为（I-4-a)或（I-4-a)和（I-4-b)的区域异构体混合物
[0015]
[0016] 现在令人惊奇地发现，使用兰诺定受体调控剂处理Bt-大豆植物、特别是含有 CrylAc和/或CrylF的Bt-大豆植物是防治/对抗/处理昆虫害虫和线虫害虫的好方法， 如，使用二酰胺、特别是氟虫酰胺处理Bt-大豆，特别是处理Monsanto(包含株系M0N87701) 的IntactaRR2PR0?大豆提供了防治/对抗/处理昆虫和/或线虫害虫的好方法。
[0017] 因此，本发明的第一方面涉及一种防治害虫的方法，其特征在于，使用有效量的至 少一种选自如下的兰诺定受体调控剂化合物处理Bt-大豆植物：
[0018] 氯虫酰胺（1-1) (Rynaxypyr)
[0019]
[0020] 溴氰虫酰胺（1-2) (Cyacypyr)
[0021]
[0022] 氟虫酰胺（1-3)
[0023]
[0024] 二酰胺化合物（1-4)，其可为（I-4-a)或（I-4-a)和（I-4-b)的区域异构体混合物
[0025]
[0026] 优选地，（II-2-a)与（II-2-b)的混合比为至少70:30。更优选地，（II-2-a) 与（II-2-b)的混合比至少为 80:20 ;81:19 ;82:18 ;83:17 ;84:16 ;85:15 ;86:14 ;87:13 ; 88:12 ;89:11 ;90:10,91:9 ;92:8 ;93:7 ;96:6 ;95:5 或更高。
[0027] 在一个实施方案中，所述兰诺定受体调控剂化合物为化合物（1-3)。
[0028] 在一个实施方案中，所述兰诺定受体调控剂化合物为化合物（1-4)。
[0029] 在一个实施方案中，所述兰诺定受体调控剂化合物为化合物（1-1)或（1-2)。
[0030] 在一个优选的实施方案中，所述方法的特征在于，所述Bt-大豆植物包含至少一 种编码Bt毒素的cry-基因或cry-基因片段。
[0031] 在一个优选的实施方案中，所述方法的特征在于，所述Bt-大豆植物包含至少一 种编码crylA Bt毒素的crylA-基因或crylA-基因片段，优选选自亚家族crylAa、crylAb、 crylAc或其杂交体（如，crylAc和crylAb的杂交体）的crylA-基因或crylA-基因片段。
[0032] 在一个优选的实施方案中，所述方法的特征在于，所述Bt-大豆植物还包含编码 Bt毒素的cryF基因或cryF-基因片段。
[0033] 在一个优选的实施方案中，所述方法的特征在于，所述Bt-大豆植物包含株系 M0N87701和任选地株系M0N89788 (草甘膦除草剂耐受性）。
[0034] 在另一个优选实施方案中，所述方法的特征在于，所述大豆植物包含含有第一 序列和第二序列的DNA，所述第一序列选自SEQ ID N0:1的bp 1385-1415;SEQ ID N0:1 的 bp 1350-1450 ;SEQ ID NO:1 的 bp 1300-1500 ;SEQ ID NO:1 的 bp 1200-1600 ;SEQ ID N0:2 的 bp 137-168;SEQ ID N0:2 的 bp 103-203 和 SEQ ID N0:2 的 bp 3-303,所述第二 序列选自 SEQ ID N0:3 的 bp 2680-2780 ;SEQ ID N0:15 的 bp 2630-2830 ;SEQ ID N0:15 的 bp 2530-2930 ;SEQ ID NO:15 的 bp 9071-9171 ;SEQ ID NO:15 的 bp 9021-9221 和 SEQ ID NO: 15的bp 8921-9321，并且所述第一和第二序列用于诊断大豆株系pDAB9582. 814. 19. 1: :pDAB4468. 04. 16. 1 的存在。pDAB9582. 814. 19. 1: :pDAB4468. 04. 16. 1 公开于 TO 2013/016516。
[0035] 在一个优选的实施方案中，所述方法的特征在于，所述大豆植物包含SEQID N0:4、SEQIDN0:5的核苷酸序列，或其互补序列。
[0036] 在一个优选的实施方案中，所述方法的特征在于，所述大豆植物包含SEQID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:9的核苷酸序列，或其互补序列。
[0037] 在一个优选的实施方案中，所述方法的特征在于，所述大豆植物包含SEQ ID NO:6 的第1至5757位的核苷酸序列、SEQ ID NO:8的第1至6426位的核苷酸序列，和SEQ ID N0:7的第379至2611位的核苷酸序列，或其互补序列。
[0038] 在一个优选实施方案中，所述方法的特征在于，所述大豆植物包含基本上为SEQ ID N0:9的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列。
[0039] 在另一优选的实施方案中，所述方法的特征在于，所述害虫选自大豆尺夜蛾 (Pseudoplusia includens)(大豆夜蛾（soybean looper))、黎豆夜蛾（Anticarsia gemmatalis)(天鶴绒豆毛虫（velvet bean caterpillar))和草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda)(秋粘虫（fall armyworm))，和铃夜蛾属（Helicoverpa spp.)(棉铃虫（corn earworm))〇
[0040] 在另一优选的实施方案中，所述方法的特征在于，所述兰诺定受体调控剂的使用 形式以与至少一种混配物（mixing partner)的混合物存在。
[0041] 第二方面涉及在不存在害虫的情况下提高转基因植物的生产潜力的利用率的方 法，这方面的优选实施方案与本发明第一方面公开的优选实施方案相同。
[0042] 第三方面涉及包含核苷酸序列编码的Bt毒素和本文所述的兰诺定受体调控剂的 协同组合物，所述核苷酸序列包含第一序列和第二序列或SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5的核 苷酸序列或其互补序列，所述第一序列选自SEQ ID N0:1的bp 1385-1415 ;SEQ ID N0:1 的 bp 1350-1450 ;SEQ ID NO:1 的 bp 1300-1500 ;SEQ ID NO:1 的 bp 1200-1600 ;SEQ ID N0:2 的 bp 137-168;SEQ ID N0:2 的 bp 103-203;SEQ ID N0:2 的 bp3-303;所述第二序 列选自 SEQ ID N0:3 的 bp 2680-2780 ;SEQ ID NO: 15 的 bp 2630-2830 ;SEQ ID NO: 15 的 bp 2530-2930 ;SEQ ID NO: 15 的 bp 9071-9171 ;SEQ ID NO: 15 的 bp 9021-9221 ;和 SEQ ID NO:15 的 bp 8921-9321。
[0043] 第四方面涉及Bt-大豆植物，其特征在于，至少0.0 OOOlg的本文所述的兰诺定受 体调控剂附着于其上。
[0044] SEQ ID No: 1 (公开于TO 2013/016516)为大豆株系 pDAB9582. 814. 19. 1 的 5' DNA 侧翼边界序列。核苷酸1-1400为基因组序列。核苷酸1401-1535为pDAB9582的重排序列。 核苷酸1536-1836为插入序列。
[0045] SEQ ID No:2(公开于TO 2013/016516)为大豆株系 pDAB9582. 814. 19. 1 的 3'DNA 侧翼边界序列。核苷酸1-152为插入序列。核苷酸153-1550为基因组序列。
[0046] SEQ ID No:3(公开于 W0 2013/016516)为大豆株系 pDAB4468. 04. 16. 1 的经确认 的序列。其包括5'基因组侧翼序列、pDAB4468T-链插入和3'基因组侧翼序列。
[0047] SEQ ID No:4(公开于W0 2009/064652)为代表大豆基因组DNA和经整合的表达盒 之间的接合区的20个核苷酸序列。该序列对应于SEQ ID N0:9的第5748至5767位。此 外，SEQ ID NO: 1是对应于SEQ ID N0:6的第5748至5757位的核苷酸序列以及对应于SEQ ID N0:8的第1至10位的TIC 107表达盒的经整合的右边界。SEQ ID NO: 1也对应于5' 侧翼序列（SEQ ID N0:6)的第5748至5767位。
[0048] SEQ ID No: 5 (公开于W0 2009/064652)是代表大豆基因组DNA和经整合的表达 盒之间的接合区的20个核苷酸序列。该序列对应于SEQ ID N0:9的第12174至12193位。 此外，SEQ ID N0:2是对应于SEQ ID N0:8的第6417至6426位的核苷酸序列以及对应于 SEQ ED NO:7的第379至388位的3'侧翼序列。
[0049] SEQ ID No:6(公开于W0 2009/064652)为位于最多到并包括转化DNA(T-DNA)插 入区域的M0N87701的插入DNA侧翼的5'序列。
[0050] SEQ ID No: 7 (公开于W0 2009/064652)为位于最多到并包括T-DNA插入区域的 M0N87701的插入DNA侧翼的3'序列。
[0051] SEQID No:8(公开于W0 2009/064652)为经整合的TIC 107表达盒的序列，其包 括整合后的右边界序列和左边界序列。
[0052] SEQIDNo:9(公开于W0 2009/064652)为14, 416bp的核苷酸序列，其代表位于 10呢7701的插入0嫩侧翼的5'序列（3￡〇10勵:6)、经整合的表达盒的序列（3￡〇10勵:8) 和位于M0N87701的插入DNA侧翼的3'序列（SEQIDN0:7)的重叠群。
[0053] 核酸分子如果显示出完全的互补性，则其被称为另一核酸分子的"互补序列"。如 本文所使用的，当一个分子的每一个核苷酸与另一个分子的核苷酸互补时，分子被称为显 示出"完全的互补性"。如果它们的相互杂交具有足够的稳定性以使它们在至少常规的"低 严格性"条件下保持相互退火，则这两个分子被称为是"最低度互补的"。类似地，如果他们 可相互杂交具有足够的稳定性以使他们在常规的"高严格性"条件下保持相互退火，则分子 被称为是"互补的"。常规的严格性条件由Sambrook et al，1989和Haymes et al记载于 Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC(1985) 中，因此偏离完全互补性是允许的，只要这种偏离不完全排除分子形成双链结构的能力。为 了使核酸分子充当引物或探针，仅需在序列中充分的互补，以使得在所使用的特定溶剂和 盐浓度下能形成稳定的双链结构。
[0054] 如在本文中使用的，"基本同源序列"是在高严格性条件下会和其与之相比较的核 酸序列的互补序列特异性杂交的核酸序列。促进DNA杂交的合适严格条件，例如在约45°C 下6. 0X氯化钠/柠檬酸钠（SSC)中，然后在50°C下用2.0 XSSC洗涤，是本领域技术人 员公知的或者并可在 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons，N. Y. (1989)，6. 3. 1-6. 3. 6中找到。例如，可在以下范围内选择洗涤步骤中的盐浓度：从50°C 下约2. OX SSC的低严格性至50 °C下约0. 2 XSSC的高严格性。此外，洗涤步骤中的温度可 从室温（约22°C)的低严格性条件升高到约65°C的高严格性条件。温度条件和盐浓度都 可发生改变，或者其中一个可保持不变而另一个变量发生改变。在一个优选的实施方案中， 本发明的核酸在中等严格条件下（例如在约2. 0XSSC和约65°C下）将与SEQ ID NO: 1和 2或其互补序列或其中一个的片段所示的核酸分子的一个或多个进行特异性杂交。在一个 特别优选的实施方案中，本发明的核酸在高严格性条件下将与SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2 或其互补序列或其中一个的片段所示的核酸分子的一个或多个进行特异性杂交。在本发明 的一个方面中，本发明的优选的标记物核酸分子具有SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2或其互 补序列或其中一个的片段所示的核酸序列。在本发明的另一方面中，本发明的优选的标记 物核酸分子与SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2或其互补序列或其中一个的片段所示的序列具 有 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 95 %、96 %、97 %、98 %、99 %和100 %的序列同一性。在本发明的其他方面中，本发明的优选 的标记物核酸分子与SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2或其互补序列或其中一个的片段所示的 序列具有95%96%、9