冷诱导甜味降低的马铃薯的制作方法

冷诱导甜味降低的马铃薯的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2012年12月12日提交的美国专利临时申请61/745, 003号的优先权。
技术领域
[0003] 本文提供产生冷诱导甜味降低的土豆变种的材料和方法。
【背景技术】
[0004] 土豆（马铃薯（Solanum tuberosum))是重要的食品作物，2011年全球产量预计 为324百万公吨（联合国食品与农业组织（FA0STAT))，2010作物生产数据，faostat. fao. org/site/567/DesktopDefault. aspx ? PagelD = 567#ancor)。总马铃薯作物中的大部分 (美国2010年作物的61% )加工生产为薯片、油炸薯条和其他加工产品。为了给加工产业 提供全年的高质量未处理马铃薯，需要在使用前对马铃薯根茎进行'冷储存'。冷储存具有 品种/处理器特异性，其温度范围从:TC _13°C不等，可以储存多至12个月，能够防止萌芽、 降低收缩/衰老造成的损失、并使疾病传播最小化。

【发明内容】

[0005] 本文提供产生冷诱导甜味（CIS)降低的土豆变种的材料和方法，冷诱导甜味是冷 储存期间淀粉转变为简单还原糖、葡萄糖和果糖的现象。高温处理后，葡萄糖/果糖会在美 拉德反应中与游离氨基酸接触，产生苦味、深色素产品，其可能含有高水平的丙烯酰胺一疑 似细胞毒素/致癌物质。提供CIS降低的马铃薯变种。
[0006] 本文至少部分基于下述发现：可通过使用序列特异的核酸酶在液泡转化酶 (VInv)基因中产生靶向突变或敲除来获得具有低CIS的马铃薯。相比冷储存后油炸的非改 造马铃薯中丙烯酰胺的水平，改造的马铃薯在油炸后可具有改良的储存特性和低水平的丙 烯酰胺。此外，该马铃薯不携带任何外源DNA，所以监管机构会将其认定为非GM。本文还至 少部分基于由序列特异核酸酶产生的具有功能缺失型VInv突变的马铃薯品种的开发。
[0007] 在一个方面，本发明包括一种茄属（Solanum)植物、植物部分或植物细胞，其中所 述植物、植物部分或植物细胞的内源的至少两个VInv等位基因中包含突变，从而所述植 物、植物部分或植物细胞的液泡转化酶的表达相对没有所述突变的对照茄属植物、植物部 分或植物细胞降低。各突变可以是多于一个核苷酸碱基对的缺失。各突变可位于SEQ ID NO:27所示的靶序列或位于与SEQ ID NO:27具有至少95%相同性的靶序列；或者位于SEQ ID NO: 1所示的靶序列或位于与SEQ ID NO: 1具有至少95%相同性的靶序列。所述植物、植 物部分或植物细胞可用稀有切割内切核酸酶制备（例如转录激活因子样效应子内切核酸 酶（TALE-核酸酶））。TALE-核酸酶可结合至SEQ ID N0:18-23中任一项所列序列。所述 至少两个VInv等位基因各表现为移除内源核酸并且不包含任何外源核酸。每个内源VInv 等位基因都可突变。各VInv等位基因表现为移除内源核酸并且不包含任何外源核酸。所 述植物、植物部分或植物细胞中可检测不到的液泡转化酶的表达。所述茄属植物、植物部分 或植物细胞，其中可为马铃薯植物、植物部分或植物细胞。所述植物、植物部分或植物细胞 可经过冷储存条件。所述植物、植物部分或植物细胞的丙烯酰胺水平相对没有所述突变的 对照植物、植物部分或植物细胞降低。
[0008] 在另一方面，本发明包括制备冷诱导甜味降低的茄属植物的方法。所述方法包括 (a)使含功能性VInv等位基因的茄属植物细胞群接触靶向内源VInv序列的稀有切割内切 核酸酶，（b)从所述群中选择至少两个VInv等位基因已失活的细胞，和（c)使所选植物细 胞生长为茄属植物，其中所述茄属植物的冷诱导甜味相对所述VInv等位基因未失活的对 照茄属植物降低。该茄属植物细胞可以是原生质体。该方法可包括用编码所述稀有切割内 切核酸酶的核酸转化所述原生质体。所述核酸可为mRNA。所述核酸可包含在载体内。该 方法可包括向所述原生质体内导入稀有切割内切核酸酶。所述稀有切割内切核酸酶可为 TALE-核酸酶。所述TALE-核酸酶可靶向SEQ ID N0:27所示的序列或靶向与SEQ ID N0:27 具有至少95%相同性的序列，或者可靶向SEQ ID NO: 1所示的序列或靶向与SEQ ID NO: 1 具有至少95%相同性的序列。TALE-核酸酶可结合至SEQ ID NO: 18-23中任一项所列序列。 该方法还可包括培养所述原生质体以生成植物株系。所述方法可包括从所述原生质体分离 含至少部分VInv基因座的基因组DNA。该茄属植物细胞可以是马铃薯植物细胞。
[0009] 在另一个方面，本文涉及一种生成食品产品的方法。所述方法可包括（a)提供茄 属植物或植物部分，其（i)在所述植物或植物部分的内源的至少两个VInv等位基因中包含 突变，从而所述植物、植物部分或植物细胞的液泡转化酶的表达相对没有所述突变的对照 茄属植物或植物部分降低，并且（ii)经过低温储存；和（b)从所述植物或植物部分生成食 品产品。所述方法还可包括（c)烹饪所述植物或植物部分以获得食品产品，该食品产品的 丙烯酰胺水平相对不含所述突变并且在烹饪前经过冷诱导储存的对照烹饪植物或植物部 分生成的食品产品降低。所述烹饪植物或植物部分与烹饪前未经冷储存的烹饪茄属植物或 植物部分具有约相同的丙烯酰胺水平。各突变可位于SEQ ID N0:27所示的靶序列或位于 与SEQ ID N0:27具有至少95%相同性的靶序列；或者位于SEQ ID N0:1所示的靶序列或 位于与SEQ ID N0:1具有至少95%相同性的靶序列。各突变可用稀有切割内切核酸酶制备 (例如TALE-核酸酶）。TALE-核酸酶可结合至SEQ ID N0:18-23中任一项所列序列。所述 茄属植物或植物部分可为马铃薯植物或植物部分。所述茄植物或植物部分中可检测不到的 液泡转化酶的表达。
[0010] 本发明另一方面包括一种从前属植物或植物部分生成的食品产品，所述前属植物 或植物部分（i)在所述植物或植物部分的内源的各VInv等位基因中包含突变，从而所述植 物、植物部分或植物细胞没有功能性VInv等位基因，并且（ii)经过低温储存。各突变可位 于SEQ ID N0:27所示的靶序列或位于与SEQ ID N0:27具有至少95%相同性的靶序列；或 者位于SEQ ID NO: 1所示的靶序列或位于与SEQ ID NO: 1具有至少95%相同性的靶序列。 各突变可用稀有切割内切核酸酶制备（例如TALE-核酸酶）。TALE-核酸酶可结合至SEQ ID N0:18-23中任一项所列序列。所述食品产品可已烹饪。所述食品产品的丙烯酰胺水平 可相对不含所述突变并且在烹饪前经过冷储存的对照植物或植物部分制备的烹饪食品产 品降低，所述对照植物或植物部分。所述烹饪食品产品可与未经冷储存的茄属植物或植物 部分具有约相同的丙烯酰胺水平。所述茄属植物或植物部分可为马铃薯植物或植物部分 (例如来自选自Ranger Russet、Atlantic和Burbank的品种）。所述食品产品可为薯片或 油炸薯条。
[0011] 除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域普通技 术人员通常所理解的相同。虽然与本文所述类似或等同的方法和材料可用来实施本发明， 但在下文描述合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文 献都通过引用全文纳入本文。在抵触的情况下，以本说明书（包括定义在内）为准。此外， 材料、方法和实施例都仅是说明性的，并不意在构成限制。
[0012] 在附图和以下描述中详细说明了本发明的一种或多种实施方式。本发明的其他特 征、目的和优势通过描述、附图以及权利要求书将是显而易见的。
【附图说明】
[0013] 图1显示VInv TALE内切核酸酶的靶位点。显示VInv基因的DNA序列（SEQ ID NO: 1)。下划线序列代表TALE-核酸识别VInv基因的靶序列（SEQ ID NOS: 18-23)。
[0014] 图2显示VInv基因中TALE核酸酶诱导的突变的示例。各图上部的线显示VInv TALE-核酸酶的识别位置的DNA序列（下划线）。其他序列显示由不精确的非同源末端连 接（NHEJ)诱导的代表性突变。右侧显示缺失的大小。
[0015] 图3显示"Ranger Russet"品种的VInv 2基因座的示例性等位基因，其为开发突 变植物的种质。区分等位基因类型的诊断性单核苷酸多态性（SNP)以下划线和粗体显示。
[0016] 图4显示再生突变"Ranger Russet"植物的示例性缺失概况。TALE核酸识别位点 以下划线表示，SNP位点以阴影表示。
[0017] 发明详述
[0018] 马铃薯基因组包含小的酶家族称为转化酶，其在调节源组织（叶片）和库组织 (块茎、果实、种子）之间的碳分配中有重要作用。该酶不可逆地催化淀粉一蔗糖一葡萄糖 /果糖反应。植物具有三类转化酶，但据信液泡转化酶（VInv)在CIS中有重要作用。
[0019] 本文提供马铃薯植物品种，具体为VInv活性降低或丧失的马铃薯（S. tuberosum) 种。还提供产生此类植物品种的方法、用此类植物品种生产食品产品的方法、和从此类植物