专利名称：小果型番茄花药的愈伤组织诱导方法
技术领域：
本发明涉及的是一种农业育种技术领域的方法，具体是一种小果型番茄花药的愈
伤组织诱导方法。
背景技术：
小果型番茄属茄科(Solanaceae)番茄属(lycopersicon)番茄半栽培亚种，其营 养丰富，风味独特。近年来，随着产业结构的调整和消费需求的增加，其种植面积迅猛发展， 在市场供应中占有越来越重要的地位。花药培养是番茄单倍体育种中十分有效的方法，结 合染色体加倍可以省去多代自交，快速建立和育纯番茄品系、克服杂种后代性状分离，加快 番茄育种的进程。 经过对现有技术的检索发现，朱丽萍等对番茄花药培养的取材时期做了一定的研 究工作，论文发表在《上海交通大学学报(农业科学版)》2005年第23巻第3期的239页 至243页，题目为《番茄不同花药长短及花粉发育时期其愈伤组织诱导率的相关性》。结果 发现，不同果型番茄品种，花粉发育与花药长度呈正相关。当番茄花粉发育处于单核靠边期 时进行花药培养，诱导愈伤组织的频率最高，是最适时期。但是该现有技术并未对番茄花药 培养最适取材时期的外部形态做深入的研究。本发明针对现有技术的不足，对小果型番茄 花药培养最适取材时期的花蕾长度及其外部形态进行了研究，为小果型番茄花药培养的研 究提供了科学的理论依据。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种小果型番茄花药的愈伤组织诱导
方法，在番茄花药培养过程中，诱导产生愈伤组织的关键是确定花粉的发育时期。通过研究
小果型番茄花药培养过程中花蕾长度对愈伤诱导率的影响，并且与花粉的发育时期进行比
较，确定了小果型番茄花药培养取材的最适时期。 本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤 第一步、在同一时间采摘若干小果型番茄的花蕾，经长度分类后放入标准固定液 中固定保存。 所述的长度分类是指将长度为3 12mm的花蕾，以lmm为间隔进行分类； 所述的小果型番茄是指黄銮、瑞珍小型番茄、高农交配、维多利1S9、鲜丰X奇斯
曼尼等巳杂种； 所述的标准固定液的组分及其体积比为5%福尔马林、5%冰醋酸和90%乙醇溶 液； 所述的福尔马林是指38%体积比浓度的甲醛溶液；
所述的乙醇溶液是指70%体积比浓度的乙醇水溶液； 第二步、将固定保存的小果型番茄中的花粉发育时期处于单核靠边期的花蕾取 出，进行消毒杀菌处理。
所述的处于单核靠边期的花蕾是指花蕾长度为8 9mm，花蕾明显长大，花冠高于 萼片，呈黄绿色，花萼基本开裂。 所述的消毒杀菌处理是指将花蕾置于fC条件下保存2天，然后用饱和漂白粉上 清液消毒花蕾18分钟后，再用无菌水冲洗3 5次。 第三步、在无菌条件下将花药从花蕾中取出并接种在诱导愈伤组织培养基上，接 种后的花药进行暗培养处理，获得小果型番茄花药的愈伤组织。 所述的暗培养处理是指在25t:环境下对花药进行暗培养三周，然后补充光照 12h，光强2000Lux，诱导愈伤组织。 所述的诱导愈伤组织培养基的组分及其含量为基本培养基MS(Murashige &
Skoog)、激动素(KT) 1. Omg/L、萘乙酸(NAA)O. 5mg/L、蔗糖40g/L、琼脂7g/L。 现有的技术是通过番茄花药的长度确定番茄花药培养的最适取材时期，而且取材
时比较繁琐，要用镊子将花蕾拨开后才能观察。本发明通过观察研究小果型番茄花粉发育
时期与花蕾长度及其外部形态、愈伤诱导率的相关性，揭示了小果型番茄花药培养最适取
材时期的花蕾长度及其外部形态。在实际应用中我们就可以直接依据花蕾的长度及其外部
形态判断花粉发育时期，直接取材。这样不仅省时、省力，而且提高了取材的准确度，从而提
高了番茄花药培养的愈伤诱导率。
图1为本发明小果型番茄花粉各发育时期的细胞学特征。
图2为本发明实施例3种不同番茄品种花蕾长度对愈伤诱导率的影响。
图3为本发明实施例3种不同番茄品种花蕾长度对愈伤诱导率的影响。
图4为本发明实施例3种不同番茄品种花蕾长度对愈伤诱导率的影响。
具体实施例方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。 实施例1 本实施例选用三种小果型番茄品种黄銮、瑞珍小型番茄、高农交配。 第一步、在同一时间采摘若干小果型番茄的花蕾，经长度分类后放入标准固定液
中固定保存。 第二步、观察小果型番茄不同花蕾长度(3 12mm，以lmm为间隔)的外部形态，研 究花粉各发育时期(小孢子母细胞时期、四分体时期、单核早期、单核中期、单核靠边期、二 核期、成熟花粉粒期)的细胞学特征。 通过研究小果型番茄花粉各发育时期的细胞学特征，发现在小果型番茄中，花蕾 长度与花粉发育时期成正相关，并且随着花蕾长度的增大花蕾的外部形态也发生显著的变 化。当花蕾长为3 4mm时，花粉处于小孢子母细胞时期，此时花蕾很小，花冠完全被萼片包 被，呈闭合状态，萼片上着生浓密的绒毛；当花蕾长为4 5mm时，花粉处于四分体时期，此时 花蕾稍大一点；当花蕾长为5 7mm时，花粉处于单核早期，此时花蕾开始明显长大，花冠被萼片包被稍低于萼片，萼片上着生的绒毛开始变稀疏；当花蕾长为7 8rnrn时，花粉处于单核 中期，此时花蕾明显长大，花冠微露于萼片外，萼片顶端开始分离；当花蕾长为8 9mm时，花 粉处于单核靠边期，此时花冠略高于萼片且开始露于萼片外，露出的花冠呈黄绿色，萼片基 本分离；当花蕾长为9 12mm时，花粉处于二核期，此时花蕾充分膨大，当花冠伸长到一定程 度，随着萼片进一步开展，花冠也逐渐向外展开，花瓣也随之长大，颜色逐渐变黄；当花蕾长 度大于12mm时，为成熟花粉粒时期，此时花冠、萼片完全分离并向外反巻，花药、柱头外露， 花冠呈深黄色。 由此可见，小果型番茄花粉发育时期与花蕾长度、外部形态的变化密切相关，可以 根据其之间的关系确定花粉的发育时期。 第三步、将固定保存后的花蕾置于fC条件下保存2天，然后用饱和漂白粉上清液 消毒花蕾18分钟后，再用无菌水冲洗3 5次。 第四步、在无菌条件下将花药从花蕾中取出并接种在诱导愈伤组织培养基上，接 种后的花药置于25t:环境下暗培养三周，然后补充光照12h，光强2000Lux，诱导愈伤组织。 四周后统计出愈率(出愈率=产生愈伤组织的花药数/接种花药数X100% )。
此实施例中三个品种不同长度的花蕾均可通过花药培养获得愈伤组织。出愈率随 番茄品种不同，花蕾长度不同而有所差异。黄銮和瑞珍小型番茄的出愈率明显高于高农交 配。三种番茄当花蕾长为8 9mm时均获得最高的出愈率。根据前面的石蜡切片结果，知道 当花蕾长为8 9mm时，花粉处于单核靠边期。因此，初步确定当花蕾长为8 9mm，花粉处于单 核靠边期，是黄銮、瑞珍小型番茄和高农交配三种番茄花药培养的最适时期。
实施例2 本实施例选用三种小果型番茄品种维多利189、高农交配、黄銮。 第一步、在同一时间采摘若干小果型番茄的花蕾，经长度分类后放入标准固定液
中固定保存。 第二步、观察小果型番茄不同花蕾长度(3 12mm，以lmm为间隔)的外部形态，研 究花粉各发育时期(小孢子母细胞时期、四分体时期、单核早期、单核中期、单核靠边期、二 核期、成熟花粉粒期)的细胞学特征。 通过研究小果型番茄花粉各发育时期的细胞学特征，发现在小果型番茄中，花蕾 长度与花粉发育时期成正相关，并且随着花蕾长度的增大花蕾的外部形态也发生显著的变 化。当花蕾长为3 4mm时，花粉处于小孢子母细胞时期，此时花蕾很小，花冠完全被萼片包 被，呈闭合状态，萼片上着生浓密的绒毛；当花蕾长为4 5mm时，花粉处于四分体时期，此时 花蕾稍大一点；当花蕾长为5 7mm时，花粉处于单核早期，此时花蕾开始明显长大，花冠被 萼片包被稍低于萼片，萼片上着生的绒毛开始变稀疏；当花蕾长为7 8mm时，花粉处于单核 中期，此时花蕾明显长大，花冠微露于萼片外，萼片顶端开始分离；当花蕾长为8 9mm时，花 粉处于单核靠边期，此时花冠略高于萼片且开始露于萼片外，露出的花冠呈黄绿色，萼片基 本分离；当花蕾长为9 12mm时，花粉处于二核期，此时花蕾充分膨大，当花冠伸长到一定程 度，随着萼片进一步开展，花冠也逐渐向外展开，花瓣也随之长大，颜色逐渐变黄；当花蕾长 度大于12mm时，为成熟花粉粒时期，此时花冠、萼片完全分离并向外反巻，花药、柱头外露， 花冠呈深黄色。 由此可见，小果型番茄花粉发育时期与花蕾长度、外部形态的变化密切相关，可以根据其之间的关系确定花粉的发育时期。 第三步、将固定保存后的花蕾置于fC条件下保存2天，然后用饱和漂白粉上清液 消毒花蕾18分钟后，再用无菌水冲洗3 5次。 第四步、在无菌条件下将花药从花蕾中取出并接种在诱导愈伤组织培养基上，接 种后的花药置于25t:环境下暗培养三周，然后补充光照12h，光强2000Lux，诱导愈伤组织。 四周后统计出愈率(出愈率=产生愈伤组织的花药数/接种花药数X100% )。
此实施例中三个品种不同长度的花蕾均可通过花药培养获得愈伤组织。出愈率随 番茄品种不同，花蕾长度不同而有所差异。黄銮的出愈率明显高于高农交配和维多利189 两种番茄。三种番茄当花蕾长为8 9mm时均获得最高的出愈率。因此，初步确定当花蕾长 为8 9mm，花粉处于单核靠边期，是黄銮、高农交配和维多利189三种番茄花药培养的最适 时期。 实施例3 本实施例选用三种小果型番茄品种维多利189、高农交配、鲜丰X奇斯曼尼。
第一步、在同一时间采摘若干小果型番茄的花蕾，经长度分类后放入标准固定液 中固定保存。 第二步、观察小果型番茄不同花蕾长度(3 12mm，以lmm为间隔)的外部形态，研 究花粉各发育时期(小孢子母细胞时期、四分体时期、单核早期、单核中期、单核靠边期、二 核期、成熟花粉粒期)的细胞学特征。 通过研究小果型番茄花粉各发育时期的细胞学特征，发现在小果型番茄中，花蕾 长度与花粉发育时期成正相关，并且随着花蕾长度的增大花蕾的外部形态也发生显著的变 化。当花蕾长为3 4mm时，花粉处于小孢子母细胞时期，此时花蕾很小，花冠完全被萼片包 被，呈闭合状态，萼片上着生浓密的绒毛；当花蕾长为4 5mm时，花粉处于四分体时期，此时 花蕾稍大一点；当花蕾长为5 7mm时，花粉处于单核早期，此时花蕾开始明显长大，花冠被 萼片包被稍低于萼片，萼片上着生的绒毛开始变稀疏；当花蕾长为7 8mm时，花粉处于单核 中期，此时花蕾明显长大，花冠微露于萼片外，萼片顶端开始分离；当花蕾长为8 9mm时，花 粉处于单核靠边期，此时花冠略高于萼片且开始露于萼片外，露出的花冠呈黄绿色，萼片基 本分离；当花蕾长为9 12mm时，花粉处于二核期，此时花蕾充分膨大，当花冠伸长到一定程 度，随着萼片进一步开展，花冠也逐渐向外展开，花瓣也随之长大，颜色逐渐变黄；当花蕾长 度大于12mm时，为成熟花粉粒时期，此时花冠、萼片完全分离并向外反巻，花药、柱头外露， 花冠呈深黄色。 由此可见，小果型番茄花粉发育时期与花蕾长度、外部形态的变化密切相关，可以 根据其之间的关系确定花粉的发育时期。 第三步、将固定保存后的花蕾置于fC条件下保存2天，然后用饱和漂白粉上清液 消毒花蕾18分钟后，再用无菌水冲洗3 5次。 第四步、在无菌条件下将花药从花蕾中取出并接种在诱导愈伤组织培养基上，接 种后的花药置于25t:环境下暗培养三周，然后补充光照12h，光强2000Lux，诱导愈伤组织。 四周后统计出愈率(出愈率=产生愈伤组织的花药数/接种花药数X100% )。
此实施例中三个品种不同长度的花蕾均可通过花药培养获得愈伤组织。出愈率随 番茄品种不同，花蕾长度不同而有所差异。鲜丰X奇斯曼尼的出愈率明显高于高农交配和维多利189两种番茄。三种番茄当花蕾长为8 9mm时均获得最高的出愈率。根据前面的石蜡切片结果，知道当花蕾长为8 9mm时，花粉处于单核靠边期。因此，初步确定当花蕾长为8 9mm，花粉处于单核靠边期，是鲜丰X奇斯曼尼、高农交配和维多利189三种番茄花药培养的最适时期。
权利要求
一种小果型番茄花药的愈伤组织诱导方法，其特征在于，包括以下步骤第一步、在同一时间采摘若干小果型番茄的花蕾，经长度分类后放入标准固定液中固定保存；第二步、将固定保存的小果型番茄中的花粉发育时期处于单核靠边期的花蕾取出，进行消毒杀菌处理；第三步、在无菌条件下将花药从花蕾中取出并接种在诱导愈伤组织培养基上，接种后的花药进行暗培养处理，获得小果型番茄花药的愈伤组织。
2. 根据权利要求1所述的小果型番茄花药的愈伤组织诱导方法，其特征是，所述的长 度分类是指将长度为3 12mm的花蕾，以lmm为间隔进行分类。
3. 根据权利要求1所述的小果型番茄花药的愈伤组织诱导方法，其特征是，所述的小 果型番茄是指黄銮、瑞珍小型番茄、高农交配、维多利1S9、鲜丰x奇斯曼尼的Fl杂种。
4. 根据权利要求1所述的小果型番茄花药的愈伤组织诱导方法，其特征是，所述的标 准固定液的组分及其体积比为5%福尔马林、5%冰醋酸和90%乙醇溶液，其中福尔马林是指38%体积比浓度的甲醛溶液；乙醇溶液是指70%体积比浓度的乙醇水溶液。
5. 根据权利要求1所述的小果型番茄花药的愈伤组织诱导方法，其特征是，所述的处 于单核靠边期的花蕾是指花蕾长度为8 9mm。
6. 根据权利要求1所述的小果型番茄花药的愈伤组织诱导方法，其特征是，所述的消 毒杀菌处理是指将花蕾置于4t:条件下保存2天，然后用饱和漂白粉上清液消毒花蕾18 分钟后，再用无菌水冲洗3 5次。
7. 根据权利要求1所述的小果型番茄花药的愈伤组织诱导方法，其特征是，所述的暗 培养处理是指在25t:环境下对花药进行暗培养三周，然后补充光照12h，光强2000Lux，诱 导愈伤组织。
8. 根据权利要求1所述的小果型番茄花药的愈伤组织诱导方法，其特征是，所述的诱 导愈伤组织培养基的组分及其含量为基本培养基MS、激动素1. Omg/L、萘乙酸0. 5mg/L、蔗 糖40g/L和琼脂7g/L。
全文摘要
一种农业育种技术领域的小果型番茄花药的愈伤组织诱导方法，包括在同一时间采摘若干小果型番茄的花蕾，经长度分类后放入标准固定液中固定保存；将固定保存的小果型番茄中的花粉发育时期处于单核靠边期的花蕾取出，进行消毒杀菌处理；在无菌条件下将花药从花蕾中取出并接种在诱导愈伤组织培养基上，接种后的花药进行暗培养处理，获得小果型番茄花药的愈伤组织。本发明在番茄花药培养过程中，诱导产生愈伤组织的关键是确定花粉的发育时期。通过利用小果型番茄花药培养过程中花蕾长度对愈伤诱导率的影响，并且与花粉的发育时期进行比较，确定了小果型番茄花药培养取材的最适时期。
文档编号A01H4/00GK101773074SQ201010300869
公开日2010年7月14日 申请日期2010年1月28日 优先权日2010年1月28日
发明者刘杨, 王芹芹, 陈火英, 韩洪强 申请人:上海交通大学