一种诱导独一味增殖培养基及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种诱导独一味增殖培养基及其制备方法，其特征在于：MS+白糖20～40g/L+卡拉胶6.5～11g/L+BA0.2～3mg/L+NAA0.1～1.5mg/L+IBA0.1～1.0mg/L+ZT0.1～4mg/L。该独一味培养基通过采用特定含量MS培养基、BA、NAA、IBA及ZT的共同协同调节作用，不仅为独一味的组培提供丰富的营养元素，大大降低了生产成本低，并且不受自然条件影响显著提高其繁殖系数，从而大大提高独一味的经济价值。
【专利说明】
-种诱导独一味増殖培养基及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种组培增殖培养基及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 唇形科独一味属唯一物种，多年生草本，高2. 5-10厘米；根茎伸长，粗厚，径达1厘 米。叶片常4枚，福状两两相对，菱状圆形、菱形、扇形、横肾形W至Ξ角形，苦，微寒。有活 血桂疲，消肿止痛之功效。独一味是青藏高原特有的一种重要药用植物，广泛分布于西藏， 而在青海、甘肃、四川和云南只有零星分布，常生于海拔3500-5100米的石质高山草甸、河 滩地或强度风化的碎石滩上。现有组培技术中，对独一味的培养报道很少，大多对外植体原 球茎进行诱导培养、增殖、分化、生化培养，得到小苗，独一味对生境条件要求苛刻，难开低 海拔地区栽培，在人工仿野生栽培条件下，种子萌发率相当低且野生资源溯危灭绝；因此， 独一味组培中增殖诱导培养对提高其繁殖系数及资源保护具有非常重要的意义；而现有的 应用传统种子繁殖虽可获得一定的萌发率率，但萌发率低，成本高，抗性差，且易感染病害。
[0003] 并且，组培中通常情况下，培养基的制备过程中一般采用热灌装的方式，即白糖和 卡拉胶均经加热煮沸后倒入灌装机中灌装，该方法制备出的培养基营养元素及植物激素流 失严重，且由于罐装时溫度逐渐降低卡拉胶呈现半凝胶状揽拌不均匀导致罐装到组培瓶中 营养液不均匀，不利于接种、转接和苗的生长。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种诱导独一味增殖培养基及其制备方法，该培养基克服 现有传统的栽培播种技术中独一味的种子营养不良导致繁殖系数低的问题，诱导独一味在 组培中增殖分化，提高独一味的繁殖系数。 阳〇化]为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：提供一种诱导独一味增殖 的培养基，其特征在于：包括MS+白糖20~40g/L+卡拉胶6. 5~llg/L+BAO. 2~3mg/ L+NAA0. 1~1. 5mg/L+IBA 0. 1~1. Omg/L+ZTO. 1~4mg/L。所述独一味诱导增殖培养基 中，每升MS培养基中各组分的含量如下：饥挪〇3 165mg、KN03 1 900mg、CaClz · 2&0 440mg、 MgS〇4*7H2〇 370mg、KH2P〇4 170mg、KI 0.83mg、H3B〇3 6.2mg、MnS〇4*H2〇 16.9mg、ZnS〇4*7H2〇 8. 6mg、Na2Mo〇4 ·細2〇 〇· 25mg、CuS〇4 ·甜2〇 〇· 〇25mg、C0CI2 ·細2〇 〇· 〇25mg、FeS〇4 · 7馬0 27. 8mg、胞2-邸ΤΑ · 2&0 37. 3mg、肌醇lOOmg、烟酸0. 5mg、盐酸化唉锋0. 5mg、盐酸硫胺素 0.1 mg、甘氨酸 2mg。
[0006] 本发明所述的独一味诱导增殖培养基，其特征在于：包括MS+白糖30g/L+卡拉胶 6. 5g/L+BA 1. Omg/L+NAA 0. 2mg/L+IBA 0. 30mg/L+ZT0. 2mg/L〇
[0007] 上述独一味诱导增殖培养基的制备方法包括W下步骤：
[000引曰、首先将白糖和卡拉胶进行预处理：分别将白糖和卡拉胶按照比例称量再加入 15倍质量的蒸馈水溶解，静置3~4小时；
[0009] b、MS培养基母液的配制，包括母液1、母液2、母液3、母液4、母液5母液6、母液7 和母液8的配制，其中
[0010] 母液1的配制：称取170g KH2PO4置于烧杯中，加入蒸馈水揽拌溶解，定容至 10000ml，保存到栋色磨合瓶中；
[00川母液2的配制：称取1900g KN03置于烧杯中，加入蒸馈水揽拌溶解，定容至 10000ml，保存到栋色磨合瓶中； 阳01引母液3的配制：称取1650g NH4NO3置于烧杯中，加入蒸馈水揽拌溶解，定容至 10000ml，保存到栋色磨合瓶中；
[0013] 母液4的配制：370g Μ拆〇4· 7&0置于烧杯中，加入蒸馈水揽拌溶解，定容至 10000ml，保存到栋色磨合瓶中；
[0014] 母液5的配制：称取440g化C12 · 2&0置于烧杯中，加入蒸馈水揽拌溶解，定容至 10000ml，保存到栋色磨合瓶中； 阳01 引 母液 6 的配审ij :分另U 称量 1. 66g ΚΙ、12. 4g &6〇3、33. 8g MnS〇4 · &0、 17. 2拉nS〇4 · 7&0、0. 5g Na2Mo〇4 · 2&0、0. 05g CuS〇4 · 5&0 和 0. 05g C0CI2 · 6&0,加入烧杯 中溶解，定容至10000ml，保存到栋色磨合瓶中；
[0016] 母液7的配制：分别称量200g肌醇、Ig烟酸、Ig盐酸化唉锋、0. 2g盐酸硫胺素和 4g甘氨酸，加入烧杯中溶解，定容至10000ml，保存到栋色磨合瓶中；
[0017] 母液 8 的配制：称量 55. 6g FeS〇4 · 7&0、74. 6g Naz-EDTA · 2&0 分别加入 3000ml 蒸馈水溶解，然后将两种溶液混合，加热煮沸15分钟，并不断揽拌，充分馨合，再定容至 10000ml，保存到栋色磨合瓶中；
[0018] C、将预处理的白糖和卡拉胶水溶液、lOml/L母液1、lOml/L母液2、lOml/L母液3、 lOml/L母液4、lOml/L母液5。5ml/L母液6、5ml/L母液7、5ml/L母液8分别倒入灌装机 中，再加入84、酷4、184、21'。加水定容，并揽拌15111111，调节抑值至5.8，后灌装，在121°(：、 0. 16MPa的条件下灭菌23分钟，冷凝后制得。
[0019] 所述灌装时间为3s，间歇时间为0. 7s。
[0020] 本发明独一味诱导增殖培养基通过采用特定含量的MS培养基、该独一味培养基 通过采用特定含量MS培养基、BA、NAA、IBA及ZT的共同协同调节作用，不仅为独一味的组 培提供丰富的营养元素，大大降低了生产成本低，并且不受自然条件影响显著提高其繁殖 系数，从而大大提高独一味的经济价值。本发明提供的独一味诱导增殖培养基的制备方法 通过将卡拉胶及白糖进行预处理及采用冷灌装方式，可大大减小微量元素、维生素及植物 激素等营养元素在制备培养基过程中的损失，并且制备的培养基硬度适中，颜色白中透亮， 为独一味诱导增殖提供了关键的培养基条件；经该诱导增殖培养基培养后的独一味的繁殖 率提高到90 %，且植株变异率低，植株结构完整健壮度好。
【具体实施方式】 阳OW 实施例1
[0022] 该独一味诱导增殖培养基的配方为：MS+白糖30g/L+卡拉胶6. 5g/L+BAl. Omg/ L+NAA 0. 2mg/L+IBA 0. 30mg/L+ZT0. 2mg/L。其中，MS基本培养基的配方为：每升培养基中 组分的含量如下： 阳OU] NH4NO3 165mg、KN〇3 1900mg、CaCl2 *2&0 440mg、M拆O4.7&0 370mg、KH2P〇4 170mg、 ΚΙ 0· 83mg、H3BO3 6· 2mg、MnS〇4 ·馬0 16. 9mg、ZnS〇4 · 7馬08· 6mg、Na2Mo〇4 ·細2〇 〇· 25mg、 CuS〇4 · 5馬0 0· 025mg、C0CI2 · 6H2O 0· 025mg、FeS〇4 · 7馬0 27. 8mg、Na2_EDTA · 2馬0 37. 3mg、 肌醇lOOmg、烟酸0. 5mg、盐酸化唉醇0. 5mg、盐酸硫胺素 0.1 mg、甘氨酸2mg。
[0024] 上述独一味诱导增殖培养基的配制过程为： 阳0巧](1)MS基本培养基母液的配制：包括母液1、母液2、母液3、母液4、母液5、母液6、 母液7和母液8的配制，其中
[0026] 母液1的配制：称取170g KH2PO4置于烧杯中，加入蒸馈水揽拌溶解，定容至 10000ml，保存到栋色磨合瓶中； W27] 母液2的配制：称取1900g KN03置于烧杯中，加入蒸馈水揽拌溶解，定容至 10000ml，保存到栋色磨合瓶中；
[0028] 母液3的配制：称取1650g NH4NO3置于烧杯中，加入蒸馈水揽拌溶解，定容至 10000ml，保存到栋色磨合瓶中；
[0029] 母液4的配制：370g MgS〇4 · 7&0置于烧杯中，加入蒸馈水揽拌溶解，定容至 10000ml，保存到栋色磨合瓶中；
[0030] 母液5的配制：称取440g化C12 · 2&0置于烧杯中，加入蒸馈水揽拌溶解，定容至 10000ml，保存到栋色磨合瓶中； 阳的1]母液 6 的配审IJ :分别称量 1. 66g ΚΙ、12. 4g &6〇3、33. 8g MnS〇4 · &0、17. 2g ZnS〇4 · 7&0、0. 5g 化2Mo〇4 · 2&0、0. 05g CuS〇4 · 5&0 和 0. 05g C0CI2 · 6&0,加入烧杯中溶 解，定容至10000ml，保存到栋色磨合瓶中；
[0032] 母液7的配制：分别称量200g肌醇、Ig烟酸、Ig盐酸化唉锋、0.2g盐酸硫胺素和 4g甘氨酸，加入烧杯中溶解，定容至10000ml，保存到栋色磨合瓶中；
[0033] 母液 8 的配制：称量 55. 6g FeS〇4 · 7&0、74. 6g Naz-EDTA · 2&0 分别加入 3000ml 蒸馈水溶解，然后将两种溶液混合，加热煮沸15分钟，并不断揽拌，充分馨合，再定容至 10000ml，保存到栋色磨合瓶中；
[0034] (2)白糖和卡拉胶进行预处理：分别将白糖和卡拉胶按照比例称量再加入15倍质 量的蒸馈水溶解，静置4小时；
[0035] (3)将预处理的白糖和卡拉胶水溶液、lOml/L母液1、lOml/L母液2、lOml/L母液 3、510ml/L母液4、lOml/L母液5。5ml/L母液6、5ml/L母液7、5ml/L母液8分别倒入灌装机 中，再加入 BA l.Omg/LNAA 0. 2mg/L、IBA0. 30mg/L、ZT0. 2mg/L。加水定容，并揽拌 15min， 调节抑值至5. 8,后灌装，在12rC、0. 16MPa的条件下灭菌23分钟，冷凝后制得；其中，灌 装时间为3s，间歇时间为0.7s。
[0036] 实施例2
[0037] 该独一味增殖诱导培养基的配方为：MS+白糖20g/L+卡拉胶8g/L+BA3. Omg/L+NAA 0. 5mg/L+IBA 0. 50mg/L+ZT0. 8mg/L。其中，MS基本培养基的配方为：每升培养基中组分的 含量如下：
[0038] NH4NO3 165mg、KN〇3 1900mg、CaCl2 *2&0 440mg、M拆〇4.7&0 370mg、KH2P〇4 170mg、 ΚΙ 0· 83mg、H3BO3 6· 2mg、MnS〇4 ·馬0 16. 9mg、ZnS〇4 · 7馬08· 6mg、Na2Mo〇4 ·細2〇 〇· 25mg、 CuS〇4 · 5馬0 0· 025mg、C0CI2 · 6H2O 0· 025mg、FeS〇4 · 7馬0 27. 8mg、Na2_EDTA · 2馬0 37. 3mg、 肌醇lOOmg、烟酸0. 5mg、盐酸化唉醇0. 5mg、盐酸硫胺素 0.1 mg、甘氨酸2mg。
[0039] 上述独一味诱导增殖培养基的配制过程为：
[0040] (1)MS基本培养基母液的配制：包括母液1、母液2、母液3、母液4、母液5、母液6、 母液7和母液8的配制，其中
[OOW 母液1的配制：称取170g KH2PO4置于烧杯中，加入蒸馈水揽拌溶解，定容至 10000ml，保存到栋色磨合瓶中； W42] 母液2的配制：称取1900g KN03置于烧杯中，加入蒸馈水揽拌溶解，定容至 10000ml，保存到栋色磨合瓶中； 阳0创母液3的配制：称取1650g NH4NO3置于烧杯中，加入蒸馈水揽拌溶解，定容至 10000ml，保存到栋色磨合瓶中；
[0044] 母液4的配制：370g Μ拆〇4 · 7&0置于烧杯中，加入蒸馈水揽拌溶解，定容至 10000ml，保存到栋色磨合瓶中；
[0045] 母液5的配制：称取440g化C12 · 2&0置于烧杯中，加入蒸馈水揽拌溶解，定容至 10000ml，保存到栋色磨合瓶中；
[0046] 母液 6 的配审ij :分另U 称量 1. 66g ΚΙ、12. 4g &6〇3、33. 8g MnS〇4 · &0、 17. 2拉nS〇4 · 7&0、0. 5g Na2Mo〇4 · 2&0、0. 05g CuS〇4 · 5&0 和 0. 05g C0CI2 · 6&0,加入烧杯 中溶解，定容至10000ml，保存到栋色磨合瓶中；
[0047] 母液7的配制：分别称量200g肌醇、Ig烟酸、Ig盐酸化唉锋、0. 2g盐酸硫胺素和 4g甘氨酸，加入烧杯中溶解，定容至10000ml，保存到栋色磨合瓶中；
[0048] 母液 8 的配制：称量 55. 6g FeS〇4 · 7&0、74. 6g Naz-EDTA · 2&0 分别加入 3000ml 蒸馈水溶解，然后将两种溶液混合，加热煮沸15分钟，并不断揽拌，充分馨合，再定容至 10000ml，保存到栋色磨合瓶中； W例 似白糖和卡拉胶进行预处理：分别将白糖和卡拉胶按照比例称量再加入15倍质 量的蒸馈水溶解，静置4小时；
[0050] (3)将预处理的白糖和卡拉胶水溶液、lOml/L母液1、lOml/L母液2、lOml/L母液 3、lOml/L母液4、lOml/L母液5。5ml/L母液6、5ml/L母液7、5ml/L母液8分别倒入灌装机 中，再加入 BA 3. Omg/l、NAA 0. 5mg/L、IBA0. 50mg/L、ZT0. 8mg/L。加水定容，并揽拌 15min， 调节抑值至5. 8,后灌装，在12rC、0. 16MPa的条件下灭菌23分钟，冷凝后制得；其中，灌 装时间为3s，间歇时间为0.7s。 阳0川实施例3
[0052] 该铁皮石解开花诱导培养基的配方为：1/2MS+白糖40g/L+卡拉胶lOg/L+BA 2. Omg/L+NAA 1. 5mg/L+IBA 0. 80mg/L+ZT0. 4mg/L。其中，1/2MS 基本培养基的配方为：每升 培养基中组分的含量如下：
[0053] NH4NO3 82. 5mg、KN03 9 50mg、CaC!2 · 2&0 220mg、MgS〇4 · 7&0 185mg、KH2PO4 85mg、 KI 0. 415mg、H3BO3 3. Img、MnS〇4 · &0 8. 45mg、ZnS〇4 · 7&04. 3mg、NazMoO* · 2&0 0. 125mg、 QiS〇4*5H2〇 0. 0125mg、CoCl2*6H2〇0. 0125mg、FeS〇4*7H2〇 13. 9mg、Na2-EDTA*2H2〇 18. 65mg、 肌醇50mg、烟酸0. 25mg、盐酸R比唉醇0. 25mg、盐酸硫胺素0. 05mg、甘氨酸Img。
[0054] 上述独一味诱导增殖培养基的配制过程为： 阳化日](1)MS基本培养基母液的配制：包括母液1、母液2、母液3、母液4、母液5、母液6、 母液7和母液8的配制，其中
[0056] 母液1的配制：称取170g KH2PO4置于烧杯中，加入蒸馈水揽拌溶解，定容至 10000ml，保存到栋色磨合瓶中； W57] 母液2的配制：称取1900g KN03置于烧杯中，加入蒸馈水揽拌溶解，定容至 10000ml，保存到栋色磨合瓶中；
[0058] 母液3的配制：称取1650g NH4NO3置于烧杯中，加入蒸馈水揽拌溶解，定容至 10000ml，保存到栋色磨合瓶中；
[0059] 母液4的配制：370g Μ拆〇4 · 7&0置于烧杯中，加入蒸馈水揽拌溶解，定容至 10000ml，保存到栋色磨合瓶中；
[0060] 母液5的配制：称取440g化C12 · 2&0置于烧杯中，加入蒸馈水揽拌溶解，定容至 10000ml，保存到栋色磨合瓶中；
[0061] 母液 6 的配审IJ :分另U 称量 1.66g ΚΙ、12. 4g &6〇3、33. 8g MnS〇4.H2〇、 17. 2拉nS〇4 · 7&0、0. 5g Na2Mo〇4 · 2&0、0. 05g CuS〇4 · 5&0 和 0. 05g C0CI2 · 6&0,加入烧杯 中溶解，定容至10000ml，保存到栋色磨合瓶中；
[0062] 母液7的配制：分别称量200g肌醇、Ig烟酸、Ig盐酸化唉锋、0.2g盐酸硫胺素和 4g甘氨酸，加入烧杯中溶解，定容至10000ml，保存到栋色磨合瓶中；
[0063] 母液 8 的配制：称量 55. 6g FeS〇4 · 7&0、74. 6g Naz-EDTA · 2&0 分别加入 3000ml 蒸馈水溶解，然后将两种溶液混合，加热煮沸15分钟，并不断揽拌，充分馨合，再定容至 10000ml，保存到栋色磨合瓶中；
[0064] (2)白糖和卡拉胶进行预处理：分别将白糖和卡拉胶按照比例称量再加入15倍质 量的蒸馈水溶解，静置4小时； 阳0化](3)将预处理的白糖和卡拉胶水溶液、5ml/L母液l、5ml/L母液2、5ml/L母液3、 5ml/L母液4、5ml/L母液5。2. 5ml/L母液6、2. 5ml/L母液7、2. 5ml/L母液8分别倒入灌装 机中，再加入 BA2. 0mg/X、NAA 1. 5mg/X、IBA 0. 80mg/X、ZT0. 4mg/L 加水定容，并揽拌 15min， 调节抑值至5. 8,后灌装，在12rC、0. 16MPa的条件下灭菌23分钟，冷凝后制得；其中，灌 装时间为3s，间歇时间为0.7s。
[0066] 试验例
[0067] 选取四川阿巧州野生独一味的植物叶片作为外植体培养诱导愈伤组织，经诱导 培养及增殖培养后，得到丛生芽，将该丛生芽接种于本发明实施例1制备的独一味诱导增 殖培养基中，采用28瓦巧白识灯灯管作为光源，光照强度为30001X，在日溫为24°C夜溫 22°C，培养室空气湿度为55%，光照时间13小时/天的条件下，培养50天，进行诱导增殖； 其中，表1为采用诱导增殖培养基进行培养与采用简单培养基进行培养的植株生长状态的 对照：
[0068] 表 1
[0069]
[0070] 从上表可W看出，采用诱导增殖培养基培养后丛生芽的繁殖系数比例得到大大提 局。
[0071] 虽然结合具体实施例对本发明的【具体实施方式】进行了详细地描述，但并非是对本 专利保护范围的限定。在权利要求书所限定的范围内，本领域的技术人员不经创造性劳动 即可做出的各种修改或调整仍受本专利的保护。
【主权项】
1. 一种诱导独一味增殖培养基，其特征在于：MS+白糖20~40g/L+卡拉胶6. 5~ llg/L+BA 0· 2 ~3mg/L+NAA0. 1 ~I. 5mg/L+IBA 0· 1 ~I. 0mg/L+ZT0· 1 ~4mg/L。所述独 一味诱导增殖培养基中，每升13培养基中各组分的含量如下：順4勵 316511^、謂03 1 90〇11^、 CaCl2 · 2H20 440mg、MgSO4 · 7H20 370mg、KH2P04170mg、KI 0· 83mg、Η3Β036· 2mg、MnSO4 · H2O 16. 9mg、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg、Na2MoO4 · 2H20 0· 25mg、CuSO4 · 5H20 0· 025mg、CoCl2 · 6H20 0· 025mg、FeSO4 · 7H20 27. 8mg、Na2-EDTA · 2H20 37. 3mg、肌醇 lOOmg、烟酸 0· 5mg、盐酸吡哆 锌0. 5mg、盐酸硫胺素0. lmg、甘氨酸2mg。2. 根据权利要求1所述的独一味组培培养基，其特征在于：包括MS+白糖30g/L+卡拉 胶 6. 5g/L+BA 1.0 mg/L+NAA 0· 2mg/L+IBA 0· 30mg/L+ZT0. 2mg/L。3. -种权利要求1所述的独一味诱导增殖培养基的制备方法，其特征在于，包括： a、 首先将白糖和卡拉胶进行预处理：分别将白糖和卡拉胶按照比例称量再加入15倍 质量的蒸馏水溶解，静置3~4小时； b、 MS培养基母液的配制，包括母液1、母液2、母液3、母液4、母液5母液6、母液7和母 液8的配制，其中 母液1的配制：称取170g KH2PO4置于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至10000ml， 保存到棕色磨合瓶中； 母液2的配制：称取1900g KNO3置于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至10000ml，保 存到棕色磨合瓶中； 母液3的配制：称取1650g NH4NO3置于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至10000ml， 保存到棕色磨合瓶中； 母液4的配制：370g MgSO4 · 7H20置于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至10000ml， 保存到棕色磨合瓶中； 母液5的配制：称取440g CaCl2 · 2H20置于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至 10000ml，保存到棕色磨合瓶中； 母液 6 的配制：分别称量 I. 66g KI、12. 4g Η3Β03、33· 8g MnSO4 ·Η20、17· 2gZnS04 ·7Η20、 0· 5g Na2MoO4 · 2Η20、0· 05g CuSO4 · 5Η20 和 0· 05g CoCl2 · 6Η20,加入烧杯中溶解，定容至 10000ml，保存到棕色磨合瓶中； 母液7的配制：分别称量200g肌醇、Ig烟酸、Ig盐酸吡哆锌、0. 2g盐酸硫胺素和4g甘 氨酸，加入烧杯中溶解，定容至10000ml，保存到棕色磨合瓶中； 母液8的配制：称量55. 6g FeSO4 ·7Η20、74.68 Na2-EDTAdH2O分别加入3000ml蒸馏水 溶解，然后将两种溶液混合，加热煮沸15分钟，并不断搅拌，充分螯合，再定容至10000ml， 保存到棕色磨合瓶中； c、 将预处理的白糖和卡拉胶水溶液、10ml/L母液I、10ml/L母液2、10ml/L母液3、 10ml/L母液4、10ml/L母液5。5ml/L母液6、5ml/L母液7、5ml/L母液8分别倒入灌装机 中，再加入84、熟4、18六、21'。加水定容，并搅拌151^11，调节？!1值至5.8，后灌装，在121°(：、 0. 16MPa的条件下灭菌23分钟，冷凝后制得。4. 根据权利要求3所述的独一味诱导增殖培养基的制备方法，其特征在于：所述灌装 时间为3s，间歇时间为0. 7s。
【文档编号】A01H4/00GK105875405SQ201410615972
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年10月29日
【发明人】林忠全
【申请人】四川深达生物科技有限公司