可高密度培养的裂殖壶菌及其生产富含dha的油脂的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体涉及可高密度培养的裂殖壶菌及其生产富含 DHA的油脂的方法。
【背景技术】
[0002] DHA是人类大脑和视网膜组织中细胞膜的重要组成成分，是人体自身发育必需的 n-3系列多不饱和脂肪酸系，其对婴幼儿大脑及视力的发育有至关重要的作用，同时它在预 防高血压、动脉硬化、关节炎以及癌症等疾病方面具有显著功效。另外，n-3系列不饱和脂肪 酸也是鱼虾生长所必需，而其本身不能合成，养殖时必须依靠饲料提供，尤其是仔幼阶段， DHA缺乏会导致死亡率升高以及体表白化等疾病。传统的DHA生产途径主要来源于鱼油的 提取纯化，但提取得率低、资源有限、易氧化、有鱼腥味，而且生产工艺复杂、产品成本高。随 着渔业资源萎缩以及海洋污染的加剧，鱼油来源的DHA面临着发展乏力的困境，难以满足 市场需求。
[0003] 目前，已发现一些低等海洋细菌、海洋真菌和微藻类，如希瓦氏菌（Shewanella)、 破囊壶菌（Thraustochytrium)、裂殖壶菌（Schizochytrium)、寇氏隐甲藻(Crythecodiniumcohnii)等都能合成DHA。其中裂殖壶菌，也叫裂殖壶藻，属真菌门、网粘 菌纲、破囊壶菌目、破囊壶菌科的一类海洋真菌，单细胞、球形。且生长周期短，可异养发酵， 生物量及油脂含量高，油脂可达细胞干重50%，其中DHA可达40-50%。国家已批准裂殖壶 藻为新资源食品，其DHA油脂可用于婴幼儿配方食品。其安全性也早已得到美国食品药品 管理局（FDA)认可，批准为GRAS级营养添加物。欧盟也于2014年7月16日公布批准微藻 裂殖壶菌油脂作为新型食品配料投放市场，欧盟食品安全局并于同年10月9日宣布扩大新 型食品配料，当中EPA和DHA的每日摄入量总和不超过5g时不会对成人构成安全风险。
[0004] CN104312929A"一株高产DHA裂殖壶菌菌株及其培养方法与应用"，公开了一株高 产DHA裂殖壶菌菌株，发酵后裂殖壶菌的生物量为30~45g/L，DHA含量为8. 6~12. 5g/ L。其生物量和DHA含量较低，限制其生产应用。CN104031843A"一种裂殖壶菌及其应用" 公开了 一种裂殖壶菌，发酵后获得生物量为180~200g/L，DHA产量为50~65g/L。然而 这只是在3L和5L的发酵罐中高密度发酵培养的结果，无法大规模生产。并且其发酵培养 过程中，需长时间流加50% (w/v)的玉米浆溶液，整个发酵过程中采用了补糖操作，玉米浆 溶液用量大，生产成本过高，不适合量产。
【发明内容】
[0005] 本发明提供可高密度培养的裂殖壶菌及其生产富含DHA的油脂的方法，该裂殖壶 菌适合高密度培养并生产富含DHA的油脂，其生产方法成本低，所得生物量及DHA产量高。
[0006] 为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：可高密度培养的裂殖壶菌，其 分类命名为裂殖壶菌（Schizochytriumsp.)SLTW3,已于2015年10月8日保藏于中国典型 培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏编号为CCTCCN〇:M2015591。该裂殖壶菌生长 速度快，适合高密度发酵。其主要长链不饱和脂肪酸的代谢产物为DHA，基因序列如SEQID NO:1所示。
[0007] 所述的可高密度培养的裂殖壶菌，是以SR21作为出发菌株，通过多次紫外诱变及 筛选后，得到所述的裂殖壶菌；所述筛选包括裂殖壶菌的初筛和复筛；所述裂殖壶菌的初 筛为培养诱变的菌液，筛选出细胞直径大、生长快的裂殖壶菌菌株；所述裂殖壶菌的复筛 为，将初筛得到的裂殖壶菌菌株进行挡板摇瓶培养，并检测脂肪酸成分，筛选出生物量、总 脂肪酸含量以及DHA含量高的菌株。
[0008] 本发明筛选所得裂殖壶菌的形态特征如图1、图2所示，细胞直径为5-15μm。进 行挡板摇瓶培养后，检测结果为：总脂肪酸含量为细胞干重的51. 7%，其中DHA含量占 45. 53%〇
[0009] -种利用裂殖壶菌生产富含DHA的油脂的方法，以上述的裂殖壶菌为出发菌株， 经高密度发酵收集菌体，提取富含DHA的油脂。
[0010] 所述的高密度发酵包括以下步骤：
[0011] (1)菌株活化培养：将保存在甘油管的菌株经划线培养于平板培养中，经过 40-48h培养，得到单菌落；
[0012] ⑵一级种子培养：将平板中的单菌落接入装有50mL种子培养基的250mL摇瓶 中，在20-30°C、150-220rpm条件下摇床培养20-24h，获得一级种子；
[0013] (3)二级种子培养：将一级种子接入装有100mL种子培养基的500mL摇瓶中，接种 量为5-10% (V/V)，在20-30°C、150-220rpm条件下摇床培养20-24h，获得二级种子；
[0014] (4)发酵罐放大培养：将二级种子接入装有发酵培养基的发酵罐中进行培养，接 种量为5-10 % (V/V)，搅拌转速200-400rpm，通气量上限3m3/h，培养温度25-30°C，通过通 气量和转速控制溶氧10 % -20 %，通过自动流加40 %磷酸或40 %氢氧化钠维持发酵液pH 为6. 0,发酵周期为70-96h。
[0015] 发酵过程中，当还原糖含量低于l〇g/L，且发酵液中溶解氧开始升高时，添加适量 的培养液，维持发酵液中碳氮的质量比为3-2:1，并使发酵液中还原糖的含量为10-20g/L; 如果还原糖含量较低，但溶解氧变化不明显时，无需添加葡萄糖。
[0016] 优选的：所述发酵罐放大培养中添加的培养液为无菌玉米浆干粉溶液和无菌葡萄 糖溶液。
[0017] 优选的：所述发酵罐放大培养的发酵培养基包含以下组分：葡萄糖60-90g/L， 酵母膏 10_20g/L，玉米浆干粉 20-30g/L，蛋白胨l-5g/L，海水素 10-15g/L，MgS04 · 7H20 1· 5-2. 5g/L，KH2P03 1· 5-2. 5g/L，KC1 0· 5-0. 7g/L，CaCl2 0· 1-0. 2g/L。
[0018] 优选的：所述一级种子培养和二级种子培养的种子培养基包含以下组分：葡萄糖 20-60g/L，酵母粉 5-15g/L，蛋白胨l-5g/L，海水素 10-15g/L，且PH为 6. 0。
[0019]当进行大规模高密度培养时，优选的，所述发酵罐放大培养为多联发酵培养。
[0020] 优选的：高密度发酵结束后，离心收集湿菌体喷雾干燥，通过酸热法提取并旋转蒸 发得到富含DHA的油脂。
[0021] 本发明具有以下有益效果：本发明以SR21作为出发菌株，通过紫外诱变并筛选获 得一种裂殖壶菌，该裂殖壶菌生长速度快，适合高密度发酵。并且提供了一种利用该裂殖壶 菌生产富含DHA的油脂的方法，经高密度发酵培养，最终生物量可达170-190g/L，其中DHA 产量可达25g/L。所述高密度发酵的发酵罐放大培养中，仅当还原糖含量低于10g/L，且发 酵液中溶解氧开始升高时，需添加适量的培养液。在实现高生物量和DHA产量的同时，降低 了生产成本，适合工业化发酵生产。
【附图说明】
[0022] 图1为裂殖壶菌菌落形态图；
[0023] 图2为裂殖壶菌在光学显微镜下的形态图。
【具体实施方式】
[0024] 实施例一
[0025] 1、裂殖壶菌的诱变及筛选
[0026] 1. 1紫外诱变
[0027] 出发菌株为（Schizochytriumsp.)SR21 (购自美国ATCC)，具体步骤为：
[0028] (1)取保藏菌株（1. 0ml融化菌液）接种于50ml种子培养基中，于20-30°C、 150-220印111条件下摇床培养20-2411，得到对数期菌液；然后按5-10%(￥/￥)转接到新鲜的 种子培养基中，在相同条件下培养至对数期。
[0029] (2)将上述得到的对数期菌液经无菌蒸馏水洗涤离心，并制成菌悬液，菌悬液的菌 液浓度0D650为0. 3-0. 8;取适量菌悬液倒入培养皿，使该菌液成为厚度l-5mm的薄层菌 膜；于15-30W紫外灯下，20-30cm距离处照射20-lOOs，得到诱变的菌液。
[0030] 1.2裂殖壶菌的筛选
[0031]1.2.1裂殖壶菌的初筛
[0032] (1)在无菌条件下，取l_2ml上述诱变的菌液接种到新鲜的种子培养基中，于 20-30°C、150-220rpm的黑暗条件下摇床培养12-20h。
[0033] (2)培养后的菌液适当稀释后涂布于固体培养基（葡萄糖5g/L，酵母粉lg/L，蛋白 胨lg/L，海盐15g/L，琼脂粉17g/L，pH为6.0)平板上，在20-30°C下培养至长出单菌落。
[0034] (3)从单菌落中，筛选出生长较快、细胞直径较大的裂殖壶菌菌株，在进行纯化后 转接于固体培养基斜面，在20-30°C下培养后于4°C下保藏。
[0035] 1.2. 2裂殖壶菌的复筛
[0036] (1)将初筛保藏的裂殖壶菌菌株进行挡板摇瓶培养，挡板摇瓶培养的具体步骤如 下：
[0037] a、菌株活化培养：将保存在斜面的菌株经划线培养于平板培养基（葡萄糖5g/L， 酵母粉lg/L，蛋白胨lg/L，海盐15g/L，琼脂粉17g/L，pH为6.0)中，经过40h培养，得到单 菌落。
[0038] b、种子培养：将平板中的单菌落接入装有50mL种子培养基（葡萄糖20g/L，酵母 粉l〇g/L，蛋白胨5g/L，海水素15g/L，pH为6. 0)的250mL摇瓶中，在28°C、200rpm条件下 摇床培养20h，获得一级种子。
[0039] 〇、按10%的接种量接入到装有10〇11^发酵培养基（葡萄糖5(^/1，酵母浸膏3(^/ L，蛋白胨5g/L，海盐15g/L，pH6. 0)的500mL挡板摇瓶中，28°C、200r/min摇瓶培养56h，直 至葡萄糖消耗完毕。
[0040] (2)取一定量的发酵液，通过酸热法提取，三氟化硼甲酯化-气相色谱法 (Agilent7890A气相色谱仪，SupelcoSPTM-2560石英毛细管柱）进行检测，筛选出生物量、 总脂肪酸含量以及DHA含量高的菌株。
[0041] 经过多次诱变及筛选后，得到本发明所提供的裂殖壶菌。该裂殖壶菌的形态特征 如图1、图2所示，细胞直径为5-15μπι。检测结果为：总脂肪酸含量为细胞干重的51. 7%， 其中DHA含量占45. 53%，其脂肪酸的组成成分分析如下表所不：
[0042]
[0043] 上述的裂殖壶菌分类命名为裂殖壶菌（Schizochytriumsp. )SLTW3,已保藏于中 国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCN〇:M2015591，经检测基因序列如SEQIDN0:1 所示。
[0044] 实施例二
[0045] 裂殖壶菌（Schizochytriumsp.)SLTW3的20L高密度发酵生产
[0046] 具体步骤如下：
[0047] (1)菌株活化培养：将保存在甘油管的菌株经划线培养于平板培养基（葡萄糖 5g/L，酵母粉lg/L，蛋白胨lg/L，海盐15g/L，琼脂粉17g/L，pH为6.0)中，经