一种刚地弓形虫虫株的分离方法
【专利说明】
[0001]技术领域:
本发明属于刚地弓形虫疫苗研究领域的新技术，具体就是一种从动物组织样本有效获得到刚地弓形虫虫株的分离方法。
[0002]【背景技术】:
弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫，能寄生在除红细胞外的所有有核细胞内，随血液和淋巴液扩散至全身各部位。中间宿主广泛且无特异性，终末宿主仅限于猫或猫科动物。弓形虫病是一种危害巨大的人畜共患疾病，在中国属二类动物疫病。
[0003]弓形虫作为重要的机会性致病原虫，正常人和动物感染弓形虫后多呈隐性感染，一般不引起明显症状，但可在体内长期潜伏，但如果发生在胎儿、机体免疫功能受损或缺陷的患者(如器官移植、艾滋病及恶性肿瘤患者等)，潜伏感染可以被激活，从而引起严重的甚至危及生命的疾病，对人类健康和畜牧业发展构成严重威胁。弓形虫病是人畜先天性疾病和流产的原因之一，还可引起脑炎和视网膜炎等。
[0004]弓形虫病的预防和治疗至今没有找到有效地途径，弓形虫新型疫苗的研究被认为是最有前景的防治措施，能够有效获得大量的弓形虫分离株，这是弓形虫疫苗研究取得进一步突破的最有效如提。
[0005]由于弓形虫遗传的多样性以及其分布的地域性差异较大，传统的弓形虫虫株分离技术程序繁琐、投入成本较高，分离效果较差。目前的分离弓形虫方法，是采用组织研磨，然后将研磨液腹腔注射小鼠的方法；该方法有2个主要问题，接种的组织体积有限；小鼠易死亡。
[0006]
【发明内容】
:
本发明的目的是根据刚地弓形虫的生活史特点及其在昆明小鼠体内繁殖的特点，提供一套从刚地弓形虫阳性的动物机体通过接种昆明小鼠有效分离获得刚地弓形虫的虫株的便于操作，低成本的刚地弓形虫虫株的分离方法:
本发明的技术方案是以下述方式实现的:
1、一种刚地弓形虫虫株的分离方法，包括以下步骤:A、弓形虫阳性动物样品的获得，B、弓形虫阳性动物心肌消化液的获得，C、昆明小鼠皮下接种弓形虫阳性动物心肌消化液，D、昆明小鼠皮下接种弓形虫阳性动物心肌消化液，E、接种后昆明小鼠的阶段性护理，F、接种后昆明小鼠弓形虫阳性检测；其中:
A、弓形虫阳性动物样品的获得
针对弓形虫病流行区域的动物进行采血，将采集的血液离心获得动物血清，采用弓形虫检测试剂对血清弓形虫抗体进行检测，将检测结果为阳性的动物个体标记为弓形虫抗体阳性动物，并摘取该阳性动物的心脏、肌肉、大脑，随机选取三个部位剪取心脏、肌肉、大脑，三部位总重至少为50克，即获得的弓形虫阳性动物心肌样品；
B、弓形虫阳性动物心肌消化液的获得:
(1)用剪刀将弓形虫阳性动物心肌剪碎；
(2)弓形虫阳性动物心肌匀浆:将剪碎后的弓形虫阳性动物心肌置于匀浆机内，加入生理盐水匀浆后倒出匀浆液，再用生理盐水冲洗匀浆机，匀浆液和冲洗液合为一体为弓形虫阳性动物心肌匀浆液，并用广口瓶盛放并贴上标签，体积之比为:弓形虫阳性动物心肌:生理盐水=1:5 ；
(3 )胃蛋白酶消化:向弓形虫阳性动物心肌匀浆液内加入胃蛋白酶溶液，加入量按体积比为:弓形虫阳性动物心肌:胃蛋白酶溶液=1:5 ;将加入胃蛋白酶溶液的弓形虫阳性动物心肌匀浆液置于37°C的恒温水浴摇床中lh ；
(4)过滤离心:将消化好的弓形虫阳性动物心肌匀浆液用一次性纱布过滤并分装，用常温低速离心机离心；
(5)调PH:向(4)离心沉淀物中缓慢加入1.2%的碳酸氢钠酚红溶液并震荡，直至溶液颜色由红色变为橘黄色，此时PH接近中性；
(6)加双抗:将(5)得到的橘黄色液体再次离心除去上清液，向沉淀中加入与沉淀等体积的青链霉素混合液，室温静置后即得弓形虫阳性动物心肌消化液；青链霉素混合液中，青霉素 200U/ml，链霉素 200ug/ml ；
C、昆明小鼠皮下接种弓形虫阳性动物心肌消化液
选取健康的昆明小鼠若干，并对每只小鼠进行耳标标记，每一只小鼠背部皮下接种1ml的得弓形虫阳性动物心肌消化液；
D、接种后昆明小鼠弓形虫阳性检测
接种后，五周内死亡的小鼠，采取常规剖检，摘取肺脏做组织研磨涂片镜检，若发现有香蕉状的弓形虫速殖子即判别为弓形虫阳性小鼠；五周内未死亡的小鼠采血获取血清，做弓形虫抗体检测，检测结果阳性的即判定为弓形虫阳性，同时五周内未死亡的小鼠做大脑压片，检测是否含有弓形虫包囊；
E、弓形虫阳性昆明小鼠分离虫株的获得
接种后，五周内死亡的小鼠，经肺部研磨涂片镜检发现香蕉状弓形虫速殖子的，将小鼠肺部研磨接种于细胞培养，采用Vero细胞，37°C，5%C02，连续培养21天，即可获得105个弓形虫速殖子；五周后的小鼠经弓形虫抗体检测结果为阳性的，将其大脑或心脏研磨，将研磨液接种于细胞培养，用Vero细胞，37°C，5%C02,连续培养21天，即可获得105个弓形虫速殖子。
[0007]本发明的优选方案还可以是:
A、弓形虫阳性动物样品的获得
针对弓形虫病流行区域的动物进行采血量为:大动物2-3ml/个体，小动物1ml/个体，将采集的血液离心时，转速为:5000rpm/min，时间为5min，温度为25°C，获得动物血清lOOul，采用弓形虫检测试剂对血清弓形虫抗体进行检测后，摘取该阳性动物的心脏；即获得的弓形虫阳性动物心脏样品；
B、弓形虫阳性动物心肌消化液的获得:
(1)心脏处理:剔除心脏的被膜、筋膜、结缔组织、脂肪等非心肌成份，并剪取50g心肌，用剪刀将弓形虫阳性动物心肌剪碎；
(2)弓形虫阳性动物心肌匀浆:将剪碎后的弓形虫阳性动物心脏置于匀浆机内15sec后，再加生理盐水匀浆；
(3)胃蛋白酶消化:向弓形虫阳性动物心脏匀浆液内加入250ml胃蛋白酶溶液，加入量按体积比为:弓形虫阳性动物心肌:胃蛋白酶溶液=1:5;将加入胃蛋白酶溶液的弓形虫阳性动物心肌匀浆液置于37°C的恒温水浴摇床中lh ;胃蛋白酶溶液配制:胃蛋白酶5.2g，NaCl 10.0g,6NHCl 28ml,清水 1000ml，PH=1 ;
(4)过滤离心:将消化好的弓形虫阳性动物肌肉匀浆液用一次性纱布过滤并分装，用常温低速离心机离心，1200 g, lOmin, 25°C ；
(6)加双抗:将(5)得到的橘黄色液体再次离心，1200g ,10min, 25°C，除去上清液，向沉淀中加入与沉淀等体积的青链霉素混合液，室温静置约20min即得弓形虫阳性动物心肌消化液；青链霉素混合液中:青霉素200U/ml，链霉素200ug/ml ；
C、昆明小鼠皮下接种心得弓形虫阳性动物肌肉消化液
选取健康的昆明小鼠若干10只，并对每只小鼠进行耳标标记，每一只小鼠背部皮下接种1ml的得弓形虫阳性动物心肌消化液，缓慢推针，缓慢退针；
D、接种后昆明小鼠的阶段性护理
接种后的小鼠需要每日动态观察体态特征，如果在一周内出现被毛逆立，蜷缩恶动，食欲下降等不良症状，要及时皮下注射抗生素:青霉素200U/ml，链霉素200ug/ml)；
E、接种后昆明小鼠弓形虫阳性检测
接种后，五周内死亡的小鼠，采取常规剖检，摘取肺脏做组织研磨涂片镜检，若发现有香蕉状的弓形虫速殖子即可判别为弓形虫阳性小鼠；五周内未死亡的小鼠采血获取血清，做弓形虫抗体检测，检测结果阳性的即可判定为弓形虫阳性，同时五周内未死亡的小鼠做大脑压片，检测是否含有弓形虫包囊；
F、弓形虫阳性昆明小鼠分离虫株的获得
接种后，五周内死亡的小鼠，经肺部研磨涂片镜检发现香蕉状弓形虫速殖子的，将小鼠肺部研磨接种于细胞培养，采用Vero细胞，37°C，5%C02，连续培养21天，即可获得105个弓形虫速殖子；五周后的小鼠经弓形虫抗体检测结果为阳性的，可将其大脑或心脏研磨，将研磨液接种于细胞培养，用Vero细胞，37°C，5%C02，连续培养21天，即可获得105个弓形虫速殖子。
[0008]本发明积极效果是:
1、投入成本较低；
2、能够有大范围高效地筛选弓形虫阳性动物样品；
3、分离出新型弓形虫虫株的程序简单，效果显著，便于常规条件操作。
[0009]能够更方便地为弓形虫疫苗研究提供新型弓形虫虫株。
[0010]4、本发明采用胃蛋白酶消化的方法，可以接种50克或超过50克的组织；背部接种小鼠降低了小鼠的死亡率。
[0011]【具体实施方式】:
实施例一、
实施弓形虫虫株分离的原料、器械及试剂:
刚地弓形虫阳性动物、昆明小鼠、鼠笼、饮水瓶、号码吊牌、采血针、离心管、离心机、移液枪、弓形虫抗体检测试剂、消化器械:包括天平、剪刀、匀浆机、纱布、一次性过滤碗、胃蛋白酶、6Ν盐酸、生理盐水、1.2%碳酸氢钠溶液、酚红、青链霉素混合液；接种器械:包括一次性注射器、70%酒精、耳标号、耳标钳； 弓形虫虫株的分离可以分为以下几个步骤:
A、弓形虫阳性动物样品的获得
针对弓形虫病流行区域的动物进行采血:大动物2-3ml/个体，小动物1ml/个体，EP管盛放采集的血液即可，将采集的血液离心(5000rpm/min,5min,25°C)获得动物血清lOOul ；采用弓形虫检测试剂对血清弓形虫抗体进行检测，将检测结果为阳性的动物个体标记为弓形虫抗体阳性动物，并摘取该阳性动物的心脏、肌肉、大脑，随机选取三个部位剪取心脏、肌肉、大脑，剪取总量以50g为宜，心脏、肌肉、大脑小于50g的动物个体摘取整个心脏、全部肌肉和大脑。此时即获得的弓形虫阳性动物样品。
[0012]B、弓形虫阳性动物心脏、肌肉消化液的获得
(1)心脏处理:剔除心脏的被膜、筋膜、结缔组织、脂肪等非心肌成份，并剪取50g心肌，用剪刀剪碎。
[0013](2)心肌匀浆:将剪碎后的心肌置于匀浆机内，先不加生理盐水匀浆15sec，加入125ml生理盐水匀浆大约30sec，倒出匀浆液，再用125ml生理盐水冲洗匀浆机，匀浆液和冲洗液合为一体为心肌匀浆液并用1000ml塑料广口瓶盛放并贴上标签；心肌与生理盐水量之比为50:250 ；
(3)胃蛋