白酶消化:每份心肌匀浆液加入250ml胃蛋白酶溶液，心肌匀浆液与胃蛋白酶溶液之间的体积比为1:5 ;胃蛋白酶溶液现配现用，配制组份和量:胃蛋白酶5.2g，NaCl10.0g,6NHCl 28ml,清水 1000ml，PH=1，
将加入胃蛋白酶溶液的心肌匀浆液置于37°C的恒温水浴摇床中lh即可。
[0014](4)过滤离心:将消化好的心肌匀浆液用一次性纱布过滤并分装，用常温低速离心机离心，离心条件:(1200g, lOmin, 25°C )。
[0015](5)调PH:向(4)离心沉淀物中缓慢加入1.2%的碳酸氢钠酚红溶液并震荡，直至溶液颜色由红色变为橘黄色，此时PH接近中性。
[0016](6)加双抗:将(5)得到的橘黄色液体再次离心(1200g lOmin，25°C )除去上清液，加入与沉淀等体积的青链霉素混合液，室温静置约20min即得心肌消化液；青链霉素混合液的配比为:青霉素200U/ml，链霉素200ug/ml ；
C、昆明小鼠皮下接种心肌消化液
选取健康的昆明小鼠10只，并对每只小鼠进行耳标标记，每一只小鼠背部皮下接种lml的心肌消化液，缓慢推针，缓慢退针，以防止接种液溢出。
[0017]D、接种后昆明小鼠的阶段性护理
接种后的小鼠需要每日动态观察体态特征，如果在一周内出现被毛逆立，蜷缩恶动，食欲下降等不良症状，要及时皮下注射抗生素，改善日粮提高营养供给，抗生素配比为:青霉素 200U/ml，链霉素 200ug/ml ；
E、接种后昆明小鼠弓形虫阳性检测
接种后，五周内死亡的小鼠，采取常规剖检，摘取肺脏做组织研磨涂片镜检，若发现有香蕉状的弓形虫速殖子即可判别为弓形虫阳性小鼠；五周内未死亡的小鼠采血获取血清，做弓形虫抗体检测，检测结果阳性的即可判定为弓形虫阳性，同时五周内未死亡的小鼠做大脑压片，检测是否含有弓形虫包囊；
F、弓形虫阳性昆明小鼠分离虫株的获得接种后，五周内死亡的小鼠，经肺部研磨涂片镜检发现香蕉状弓形虫速殖子的，可将小鼠肺部研磨接种于细胞培养，采用Vero细胞，37°C，5%C02,连续培养21天，即可获得105个弓形虫速殖子；五周后的小鼠经弓形虫抗体检测结果为阳性的，可将其大脑或心脏研磨，将研磨液接种于细胞培养(Vero细胞，37°C，5%C02,连续培养21天)，即可获得105个弓形虫速殖子。
[0018]弓形虫分离虫株的验证:形态特征为香蕉状，3-5um;生长特性为在Vero细胞可连续传代；PCR方法鉴定B1基因阳性；WeStern blot方法鉴定SAG1蛋白阳性。
[0019]整个技术实施环节要注意以下几点:
1、要保持阳性样品的新鲜性，提高虫体的存活率；
2、避免大量样品处理时的交叉污染；
3、接种小鼠要极力减少有害细菌的引入，减少小鼠的应激；
4、保障饲养环境的清洁，供给有效的营养日粮；
5、技术实施环节要严格做好记录。
【主权项】
1.一种刚地弓形虫虫株的分离方法，包括以下步骤:A、弓形虫阳性动物样品的获得，B、弓形虫阳性动物心肌消化液的获得，C、昆明小鼠皮下接种弓形虫阳性动物心肌消化液，D、昆明小鼠皮下接种弓形虫阳性动物心肌消化液，E、接种后昆明小鼠的阶段性护理，F、接种后昆明小鼠弓形虫阳性检测；其特征在于: A、弓形虫阳性动物样品的获得 针对弓形虫病流行区域的动物进行采血，将采集的血液离心获得动物血清，采用弓形虫检测试剂对血清弓形虫抗体进行检测，将检测结果为阳性的动物个体标记为弓形虫抗体阳性动物，并摘取该阳性动物的心脏、肌肉、大脑，随机选取三个部位剪取心脏、肌肉、大脑，三部位总重至少为50克，即获得的弓形虫阳性动物心肌样品； B、弓形虫阳性动物心肌消化液的获得: (1)用剪刀将弓形虫阳性动物心肌剪碎； (2)弓形虫阳性动物心肌匀浆:将剪碎后的弓形虫阳性动物心肌置于匀浆机内，加入生理盐水匀浆后倒出匀浆液，再用生理盐水冲洗匀浆机，匀浆液和冲洗液合为一体为弓形虫阳性动物心肌匀浆液，并用广口瓶盛放并贴上标签，体积之比为:弓形虫阳性动物心肌:生理盐水=1:5 ； (3 )胃蛋白酶消化:向弓形虫阳性动物心肌匀浆液内加入胃蛋白酶溶液，加入量按体积比为:弓形虫阳性动物心肌匀浆液:胃蛋白酶溶液=1:0.8—1 ;将加入胃蛋白酶溶液的弓形虫阳性动物心肌匀浆液置于37°C的恒温水浴摇床中lh ； (4)过滤离心:将消化好的弓形虫阳性动物心肌匀浆液用一次性纱布过滤并分装，用常温低速离心机离心； (5)调PH:向(4)离心沉淀物中缓慢加入1.2%的碳酸氢钠酚红溶液并震荡，直至溶液颜色由红色变为橘黄色，此时PH接近中性； (6)加双抗:将(5)得到的橘黄色液体再次离心除去上清液，向沉淀中加入与沉淀等体积的青链霉素混合液，室温静置后即得弓形虫阳性动物心肌消化液；青链霉素混合液中，青霉素 200U/ml，链霉素 200ug/ml ； C、昆明小鼠皮下接种弓形虫阳性动物心肌消化液 选取健康的昆明小鼠若干，并对每只小鼠进行耳标标记，每一只小鼠背部皮下接种1ml的得弓形虫阳性动物心肌消化液； D、接种后昆明小鼠弓形虫阳性检测 接种后，五周内死亡的小鼠，采取常规剖检，摘取肺脏做组织研磨涂片镜检，若发现有香蕉状的弓形虫速殖子即判别为弓形虫阳性小鼠；五周内未死亡的小鼠采血获取血清，做弓形虫抗体检测，检测结果阳性的即判定为弓形虫阳性，同时五周内未死亡的小鼠做大脑压片，检测是否含有弓形虫包囊； E、弓形虫阳性昆明小鼠分离虫株的获得 接种后，五周内死亡的小鼠，经肺部研磨涂片镜检发现香蕉状弓形虫速殖子的，将小鼠肺部研磨接种于细胞培养，采用Vero细胞，37°C，5%C02，连续培养21天，即可获得105个弓形虫速殖子；五周后的小鼠经弓形虫抗体检测结果为阳性的，将其大脑或心脏研磨，将研磨液接种于细胞培养，用Vero细胞，37°C，5%C02,连续培养21天，即可获得105个弓形虫速殖子。2.根据权利要求1所述的一种刚地弓形虫虫株的分离方法，其特征在于: A、弓形虫阳性动物样品的获得 针对弓形虫病流行区域的动物进行采血量为:大动物2-3ml/个体，小动物1ml/个体，将采集的血液离心时，转速为:5000rpm/min，时间为5min，温度为25°C，获得动物血清lOOul，采用弓形虫检测试剂对血清弓形虫抗体进行检测后，摘取该阳性动物的心脏；即获得的弓形虫阳性动物心脏样品； B、弓形虫阳性动物心肌消化液的获得: 所述(1)心脏处理:剔除心脏的被膜、筋膜、结缔组织、脂肪等非心肌成份，并剪取50g心肌，用剪刀将弓形虫阳性动物心脏剪碎； 所述(2)弓形虫阳性动物心肌匀浆:将剪碎后的弓形虫阳性动物心脏置于匀浆机内15sec后，再加生理盐水匀浆； 所述(3)胃蛋白酶消化:向弓形虫阳性动物心脏匀浆液内加入250ml胃蛋白酶溶液，力口入量按体积比为:弓形虫阳性动物心肌匀浆液:胃蛋白酶溶液=1:0.8-1 ;将加入胃蛋白酶溶液的弓形虫阳性动物心肌匀浆液置于37°C的恒温水浴摇床中lh ;胃蛋白酶溶液配制:胃蛋白酶 5.2g，NaCl 10.0g,6NHCl 28ml,蒸馏水 1000ml，PH=1 ; 所述(4 )过滤离心:将消化好的弓形虫阳性动物肌肉匀浆液用一次性纱布过滤并分装，用 Μ温低速尚;1_1、机尚;1_1、，1200 g, lOmin, 25 C ； 所述(6)加双抗:将(5)得到的橘黄色液体再次离心，1200g, lOmin, 25°C，除去上清液，向沉淀中加入与沉淀等体积的青链霉素混合液，室温静置约20min即得弓形虫阳性动物心肌消化液；青链霉素混合液中:青霉素200U/ml，链霉素200ug/ml ； C、昆明小鼠皮下接种心得弓形虫阳性动物肌肉消化液 选取健康的昆明小鼠若干10只，并对每只小鼠进行耳标标记，每一只小鼠背部皮下接种1ml的得弓形虫阳性动物心肌消化液，缓慢推针，缓慢退针； D、接种后昆明小鼠的阶段性护理 接种后的小鼠需要每日动态观察体态特征，如果在一周内出现被毛逆立，蜷缩恶动，食欲下降等不良症状，要及时皮下注射抗生素:青霉素200U/ml，链霉素200ug/ml ； E、接种后昆明小鼠弓形虫阳性检测 接种后，五周内死亡的小鼠，采取常规剖检，摘取肺脏做组织研磨涂片镜检，若发现有香蕉状的弓形虫速殖子即可判别为弓形虫阳性小鼠；五周内未死亡的小鼠采血获取血清，做弓形虫抗体检测，检测结果阳性的即可判定为弓形虫阳性，同时五周内未死亡的小鼠做大脑压片，检测是否含有弓形虫包囊； F、弓形虫阳性昆明小鼠分离虫株的获得 接种后，五周内死亡的小鼠，经肺部研磨涂片镜检发现香蕉状弓形虫速殖子的，将小鼠肺部研磨接种于细胞培养，采用Vero细胞，37°C，5%C02，连续培养21天，即可获得105个弓形虫速殖子。3.根据权利要求2所述的一种刚地弓形虫虫株的分离方法，其特征在于: 接种五周后的小鼠经弓形虫抗体检测结果为阳性的，将其大脑或心脏研磨，将研磨液接种于细胞培养，用Vero细胞，37°C，5%C02,连续培养21天，即获得105个弓形虫速殖子。
【专利摘要】本发明公开了一种刚地弓形虫虫株的分离方法，包括以下步骤：A、弓形虫阳性动物样品的获得，B、弓形虫阳性动物心肌消化液的获得，C、昆明小鼠皮下接种弓形虫阳性动物心肌消化液，D、昆明小鼠皮下接种弓形虫阳性动物心肌消化液，E、接种后昆明小鼠的阶段性护理，F、接种后昆明小鼠弓形虫阳性检测；本发明投入成本较低；能够有大范围高效地筛选弓形虫阳性动物样品；分离出新型弓形虫虫株的程序简单，效果显著，便于常规条件操作；能够更方便地为弓形虫疫苗研究提供新型弓形虫虫株；本发明采用胃蛋白酶消化的方法，可以接种50克或超过50克的组织；背部接种小鼠降低了小鼠的死亡率。
【IPC分类】C12N1/10, C12R1/90
【公开号】CN105420112
【申请号】CN201510951547
【发明人】杨玉荣, 王英华, 冯永杰, 付晓莹, 马超锋, 郭锋, 李尚超, 陆瑶瑶
【申请人】河南农业大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月17日