弓形虫核酸适配体序列及其用于制备弓形虫病诊断试剂或者制品上的用图
【专利摘要】本发明涉及利用核酸适配体用于弓形虫病早期急性感染检测和诊断的方法，核酸适配体分别为YZ?39，YZ?56。该核酸适配体的作用机理是与弓形虫的棒状体分泌蛋白ROP特异性结合。由于分泌蛋白ROP蛋白是弓形虫侵染宿主细胞的早期分泌蛋白，对于弓形虫病的早期急性感染诊断有重要意义。目前国内外还没有关于利用核酸适配体检测分泌蛋白ROP对弓形虫早期急性感染进行检测的报道。ROP特异性的核酸适配体的发现和应用对于弓形虫病的早期急性感染的检测提供新方法。
【专利说明】
弓形虫核酸适配体序列及其用于制备弓形虫病诊断试剂或者制品上的用途
技术领域
[0001]本发明属于生物医学和临床医学的技术领域，涉及一类与弓形虫相关的核酸适配体用于弓形虫病的早期急性感染诊断和检测的试剂或者制品上的用途。
【背景技术】
[0002]自从利用杂交瘤技术产生单克隆抗体发明以来，抗体对于整个医学研究，临床诊断和生物治疗的发展做出了巨大贡献。核酸适配体不但和抗体一样能与靶分子高效、特异地结合，而且具有许多抗体无法比拟的优点，如分子量小、自身稳定性强、变性复性快速可逆、易修饰修与标记等。基于核酸适配体的识别与检测方法，正逐渐成为一种新的、普遍适用的技术，为化学、分子生物学以及医学等领域提供一种高效、快速的分析检测方法。
[0003]核酸适配体是通过指数富集配体系统进化(systematic evolut1n of ligandsby exponential enrichment ,SELEX)技术从体外人工筛选得到的，能与相应配体专一性紧密结合的一类RNA或单链DNA (ssDNA)分子，一般由几十个核苷酸(20 —100 nt)组成。核酸适配体与各种配体的结合是基于单链核酸结构和空间构象的多样性，它可通过链内某些互补碱基间的配对以及静电作用、氢键作用等自身发生适应性折叠，形成一些稳定的三维空间结构，如发卡(hairpin)、假结(pseudoknot)、凸环(stem loop)、G2四分体(G2 quartet)等。
[0004]刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种专性细胞内寄生，机会致病原虫，引起人和动物共患的弓形虫病(toxoplasmosis)，尤其在宿主免疫功能低下时，可致严重后果。WHO数据显示弓形虫的感染呈世界性分布，全球成人感染率从10%到90%不等。弓形虫感染通常是无症状的，但先天性感染和免疫功能低下者的获得性感染常引起严重的弓形虫病。
[0005]先天性弓形虫病:感染弓形虫的初孕妇女，可经胎盘血流将弓形虫传播给胎儿。在孕前3个月内感染，可造成流产、早产、畸胎或死胎。
[0006]获得性弓形虫病:弓形虫常累及脑和眼部，引起中枢神经系统损害，如脑炎、癫痫和精神异常，弓形虫眼病以视网膜脉络膜炎为多见，成人表现为视力突然下降，婴幼儿可见手抓眼症，对外界事物反应迟钝，也有出现斜视、虹膜睫状体炎、色素膜炎等。
[0007]隐性感染者若患有恶性肿瘤、因长期接受免疫抑制剂和放射治疗等引起的医源性免疫受损或先天性、后天性免疫缺陷者，如艾滋病患者，都可使隐性感染转变为急性或亚急性，从而出现严重的全身性弓形虫病，其中多因并发弓形虫脑炎而死亡。
[0008]弓形虫病的实验室诊断包括:病原学检查，免疫学诊断，分子生物学检测，影像学检查。弓形虫抗体检测是目前最主要的辅助检查方法，通常需联合进行IgG和IgM抗体平行检测，1.1gM抗体升高是急性感染出现较早的敏感标志，一般在感染后I周出现，维持3?6个月，个别感染者可持续I年以上。2.1gG抗体通常在感染后I?2周出现，I?2个月后达高峰，以后逐渐下降，并可终生持续阳性，因此IgG阳性不能区分急慢性感染由Reshika Dhakal等人进行的研究中，研究对象为2003年至2013年来自非参考实验室，将IgM和IgG阳性的451名患者标本拿到帕洛阿尔托基础医学弓形虫实验室(PAMF-TSL)采用酶联免疫法(ELISA)检测，对这些病人进行回顾性的评估:是急性感染还是慢性感染。该研究将患者分成4组:慢性感染，急性感染，没有感染，结果不确定。AMF-TSL结果显示:在451名患者中，有335名(74%)属于慢性感染，100名(22%)属于急性感染，有7名(2%)没有感染，而且有9名(2%)的结果不确定。由此可以看出，在非参考实验室中获得的弓形虫IgM和IgG阳性结果不能准确的区分慢性感染和急性感染。鉴于多种因素的影响，一种慢性的弓形虫感染会错误的归为急性感染，从而导致一些不良的后果，特别针对妊娠女性，会造成极大的精神压力和引起不必要的干预措施，包括终止妊娠。
[0009]因此开发一种弓形虫早期急性感染的快速，特异的检测方法对于传统IgG和IgM抗体平行检测具有很好的辅助作用，具有重要的临床诊断意义。
【发明内容】
[0010]为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供可用于识别弓形虫的核酸适配体，以及利用该核酸适配体制备用于弓形虫早期急性感染的诊断试剂或者制品的用途。核酸适配体YZ-39和YZ-56是基于SELEX方法筛选出来的核酸适配体。我的研究发现，YZ-39和YZ-56核酸适配体可以特异性识别弓形虫棒状体分泌蛋白以及弓形虫感染的人体细胞和人体血清样本。利用核酸适配体对于弓形虫的分泌蛋白检测尚未有任何报道，其将为弓形虫的早期诊断提供新的策略。
[0011]核酸适配体YZ-39和YZ-56，序列为
YZ-39:TCCTGGCAGCGCTTTTGCTTGTTTGCTCTCGTACCTGTCCYZ-56:CGCACCGATCCGGTGTTAATCTCGACGTCCCTTAAGTTTG
所述的核酸适配体YZ-39和YZ-56的用途，用于弓形虫早期急性感染的检测的诊断试剂或者制品。
[0012]本发明的YZ-39和YZ-56是一类能特异性靶向结合弓形虫早期感染的棒状体分泌蛋白的核酸适配体，可以在实验室条件下和临床条件下特异性检测含有弓形虫棒状体分泌蛋白的溶剂，弓形虫虫体，血清样本等。具有核酸适配体的通用特点，如:高亲和力，高特异性，稳定性高，无毒性，免疫原性低。核酸适配体YZ-39和YZ-56能特异性识别弓形虫棒状体分泌蛋白R0P，而不识别对照标签蛋白GST;荧光标记的核酸适配体YZ-39和YZ-56能特异性识别感染到人体细胞内的弓形虫;其中YZ-39和YZ-56核酸适配体可以特异性识别含有弓形虫抗原的人体血清样本；同时YZ-39和YZ-56可以特异性识别患有急性弓形虫病的病人血清样本。综上，YZ-39和YZ-56对弓形虫感染的早期分泌蛋白ROP的特异性的识别，将有助于开发针对弓形虫早期急性感染快速检测试剂。
[0013]本发明的主要优点和有益效果:
核酸适配体不但和抗体一样能与靶分子高效、特异地结合，而且具有许多抗体无法比拟的优点，如分子量小、靶分子广泛(包括毒素、免疫原性弱和不具有免疫原性的物质)、自身稳定性强、变性复性快速可逆、免疫原性低、体外筛选不依赖动物或细胞和易进行多种修饰修与标记等。核酸适配体YZ-39和YZ-56能特异性结合弓形虫致病性的棒状体蛋白R0P。核酸适配体YZ-39和YZ-56同时能特异性识别感染到人体细胞内的弓形虫。在临床研究上，该核酸适配体可以有效的识别含有弓形虫抗原的血清样本和急性弓形虫病的病人的血清样本。上述结果显示YZ-39和YZ-56是一种新型检测弓形虫的后续制剂。本发明对于弓形虫的特异性诊断，尤其是早期急性感染的快速诊断具有重大意义。
[0014]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
【附图说明】
[0015]图1为采用核酸适配体YZ-39，YZ-56和弓形虫棒状体分泌蛋白ROP特异性结合。
[0016]图2为采用不同浓度核酸适配体ΥΖ-39和弓形虫棒状体分泌蛋白ROP特异性结合图3为采用核酸适配体ΥΖ-39和ΥΖ-56与侵染到人体细胞内弓形虫特异性结合
图4为采用核酸适配体ΥΖ-39和ΥΖ-56与含有弓形虫抗原的血清样本特异性结合图5为采用核酸适配体ΥΖ-39和ΥΖ-56和弓形虫早期急性感染的病人血清样本特异性全士么彡口 I=I
【具体实施方式】
[0017]下面结合附图对本发明做详细具体的介绍，旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0018]核酸适配体ΥΖ-39和ΥΖ-56是采用一种基于SELEX的方法，采用弓形虫棒状体分泌蛋白ROP-GST为筛选对象，GST标签蛋白为反向筛选对象，经过15轮的筛选出来，能特异性与弓形虫棒状体分泌蛋白ROP特异性结合的核酸适配体。ΥΖ-39和ΥΖ-56是通过DNA合成仪按照它们的序列顺序合成，然后通过高效液相色谱(HPLC)或者是变性电泳(ULTRAPAGE)纯化，最后通过离心浓缩干燥而制备。
[0019]优选的，为了明确筛选的核酸适配体YZ-39和YZ-56对弓形虫棒状体分泌蛋白特异性结合，我选取了 GST标签蛋白和棒状体分泌蛋白ROP-GST进行结合实验，通过三次独立重复实验后，结果如图1所示，相比于标签蛋白GST的对照，发现YZ-39和YZ-56都能特异性的结合弓形虫分泌蛋白ROP。进一步采用ROP-GST棒状体分泌蛋白和FI TC荧光标记的不同浓度的核酸适配体YZ-39 反应(OnM，6.25nM，12.5nM，25nM，50nM，10nM，200nM，400nM)，经过三次独立重复试验后，结果如图2所示，YZ-39能呈现剂量依赖性结合弓形虫棒状体分泌蛋白ROPCKd 值约为 I OOnM)。
[0020]优选的，为了观察YZ-39和YZ-56与感染到人体细胞内的弓形虫结合情况，将10nM FITC荧光标记的核酸适配体YZ-39和YZ-56分别与弓形虫感染的人包皮成纤维(Human foreskin fibroblast，HFF)细胞和正常未感染的HFF细胞在室温条件下孵育，制片后在荧光显微镜下观察。结果如图3所示，可见核酸适配体YZ-39和YZ-56能特异性识别感染到HFF细胞内的弓形虫。
[0021]优选的，为了研究核酸适配体是否能应用于临床，对弓形虫患者的血清的检测，300nM B1tin标记的核酸适配体YZ-39和YZ-56与含有不同浓度的弓形虫抗原的人血清样本(12.5yg/ml, 25yg/ml, 100yg/ml，200yg/ml)相互作用，结果如图4所不，相比于BSA对照，YZ-39和YZ-56能呈现剂量依赖性结合含有弓形虫抗原的人血清。300nM B1tin标记的核酸适配体YZ-39和YZ-56与弓形虫早期急性感染的病人血清样本相互作用，结果如图5所示，核酸适配体YZ-39和YZ-56可以特异性识别弓形虫病新近急性感染的病人的血清样本。
[0022]结论: 1)核酸适配体YZ-39和YZ-56能特异性识别弓形虫棒状体分泌蛋白ROP，而不结合对照标签蛋白GST;
2)核酸适配体YZ-39和YZ-56能特异性识别感染到人体细胞内的弓形虫；
3)核酸适配体YZ-39和YZ-56能特异性识别含有弓形虫抗原的人血清。
[0023]核酸适配体YZ-39和YZ-56能特异性识别弓形虫早期急性感染的病人的血清样本。
【主权项】
1.一类核酸适配体YZ-39，YZ-56其特征在于，序列为 ΥΖ-39:TCCTGGCAGCGCTTTTGCTTGTTTGCTCTCGTACCTGTCC ΥΖ-56: CGCACCGATCCGGTGTTMTCTCGACGTCCCTTAAGTTTG。2.根据权利要求1所述的核酸适配体ΥΖ-39，ΥΖ-56的用途，其特征在于，用于制备弓形虫病早期急性感染的诊断的试剂或者制品。
【文档编号】C12N15/115GK105861511SQ201610210954
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月1日
【发明人】张阳
【申请人】张阳