一种检测猪弓形虫病的引物、试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，更具体地，本发明涉及一种检测猪弓形虫病的 引物、试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 弓形虫病（Toxoplasmosis)是刚地弓形虫（Toxoplasma gondii)引起的一种世界 范围广泛分布的人兽共患病，宿主范围十分广泛，人及大多数动物感染率都较高。弓形虫病 常导致动物流产、弱胎、死胎、生长受阻及死亡(王金苹.弓形虫病PCR和ELISA诊断方法的建 立和初步应用.[硕士学位论文]，2005,华中农业大学;江涛.猪弓形虫病分子诊断方法的建 立与基因免疫研究.[博士学位论文]，2006，华中农业大学）。
[0003] 猪弓形虫病是养猪生产中较为常见和多发的一种传染性寄生虫病。临床上以高热 稽留、呼吸及神经系统异常为主要发病特征，发病急、传染性强，病死率较高。怀孕母猪感染 发病后多发生流产或死胎。
[0004] 目前猪弓形虫病的检测方法主要为病原学诊断方法，包括病料直接镜检和病原分 离。病原学诊断方法较为简单，结果可靠，但检出率低，耗时，容易漏诊，一般不能进行生前 诊断。
【发明内容】
[0005] 基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种猪弓形虫病的检测方 法，以及该检测方法所使用的引物，该引物可特异性扩增猪弓形虫，快速对临床样品进行检 测 。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
[0007] 一种检测猪弓形虫病的引物，所述引物如SEQ ID No:l和SEQ ID No:2所示。
[0008] 上述引物在制备检测猪弓形虫病的试剂盒中的应用。
[0009] -种检测猪弓形虫病的试剂盒，所述试剂盒包括上述检测猪弓形虫病的引物。
[0010] -种检测猪弓形虫病的方法，采用上述引物，包括以下步骤：
[0011] 以待检猪样本基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，电泳鉴定;所述PCR扩增反应 的反应体系为： Premix EX Taq 12 5μΙ SEQ ID No: 1 liiL
[0012] SEQ ID No:2 IpL 糢板 IpL· 灭菌蒸馏水 加至25pL ;
[0013] 所述PCR扩增反应的反应程序为：94°C 5min进行预变性；然后94°C 30s，55 °C 30s，72 °C40s，35次循环；最后72°C延伸lOmin。
[0014] 与现有技术相比，本发明具有以下显著效果：
[0015] 1、本发明的检测猪弓形虫病的引物可以特异性地扩增猪弓形虫，对其他常见病原 如猪附红细胞体、猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪 嗜血杆菌等无反应；
[0016] 2、本发明的检测猪弓形虫病的方法具有很高的灵敏性，灵敏度可达0.15ng左右， 可以方便、快捷的对各种临床猪样本的猪弓形虫进行检测，有利于快速制定针对性的防控 措施，操作简单、实用。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明实施例1中猪弓形虫病的临床样品检测，其中泳道1为猪弓形虫阳性 对照，泳道2为猪弓形虫阴性对照，泳道3、4、5、6分别为临床样品；
[0018] 图2为本发明试验例1中猪弓形虫的PCR检测方法的特异性的电泳图谱，其中：泳道 1为猪弓形虫阳性样品，泳道2为猪弓形虫阴性样品，泳道3-8分别为猪附红细胞体、猪肺炎 支原体、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌样品；
[0019] 图3为本发明试验例2中猪弓形虫病的PCR检测方法的灵敏度的电泳图谱，其中泳 道1、2、3、4、5、6、7的0麻浓度分别为0.14948、0.01494 8、1.49叫、0.149叫、0.0149叫、 1·49pg、0·149pg〇
【具体实施方式】
[0020] 以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
[0021] 以下实施例中涉及的实验材料如无特殊说明，均来源于市售，以下实施例中所采 用的操作均为本领域技术人员所熟知的常规操作。
[0022] 实施例1检测猪弓形虫病的引物和方法
[0023] 1、引物设计
[0024] 根据NCBI登陆的猪弓形虫多拷贝B1基因序列（登录号：EU340881，KT266796， LN714499，KF413760，EU340874，AF179871)进行比对，并设计了一对特异性扩增猪弓形虫的 引物，分别为F1、R1。
[0025] F1：CCCTTACTGCAAGAGAAGT(SEQ ID N0:1)
[0026] R1：GCTGCTTGAAGAGAGACGCT(SEQ ID NO:2)
[0027] 2、检测方法
[0028] 包括以下步骤：
[0029] (1)待检猪样本基因组DNA提取
[0030]采用爱思进生物技术(杭州)有限公司DNA/RNA小量试剂盒。200yL待检猪场采集的 抗凝血(编号3)、100mg的猪肺脏(编号4)、淋巴结(编号5)、胸腔积液(编号6)病料分别加入 lmL PBS缓冲液进行充分研磨，-20°C反复冻融3次，8000rpm离心10min，取上清液200yL，转 入1.5mL离心管中。加200yL Buffer V-L，漩涡振荡混合均匀，静置5min。加75yL Buffer V-N，漩涡振荡混合均匀，12000g离心5min。将上清转移到新的2mL离心管中，加300yL异丙醇 (含1%冰醋酸），上下倒置6-8次混匀。将制备管置于2ml离心管中，将混合液移入制备管中， 8000g离心lmin。弃滤液，将制备管置回到2mL离心管中，加500yL Buf f er W1A，室温静置 lmin。12000g离心lmin。弃滤液，将制备管置回到2mL离心管中，加800yL Buf fer W2，12000g 离心lmin。将制备管置回到2mL离心管中，12000g离心lmin。将制备管置于洁净的1.5mL离心 管中，在制备管膜中央加入40yL Buffer TE，室温静置lmirul^OOOg离心lmin，离心下来的 溶液即为基因组DNA模板。
[0031] (2)、PCR 扩增
[0032] 将PCR反应液加入PCR反应管混合均匀后，加入基因组DNA模板，将PCR管置于PCR仪 上进行循环扩增反应；
[0033] PCR反应体系如下，其中Premix EX Taq是PCR反应用的DNA Polymerase、Buffer、 dNTP Mixture的2倍浓度的混合物，包含DNA Polymerase 1.25U/25yL、Buffer(Tris-HCl, ρΗ8·3 20mM，KCl 100mM，MgCl2 3mM)、dNTP Mixture各0.4mM:
[0034] Premix EX Taq 12.5μΙ.. FI 叫 R1 IpL
[0035] 模板 lpL 灭菌蒸馏水 加至25μL ;
[0036] 所述PCR扩增反应的反应程序为:94 °C5min进行预变性;然后94 °C 30s，55 °C 30s，72 °C40s，35次循环；最后72°C延伸lOmin。
[0037] (3)、电泳鉴定
[0038] PCR扩增后取5yL反应产物，在1 % (质量比）的琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定，PCR产 物出现431bp条带，即为猪弓形虫阳性，无条带出现的为阴性，本实施例的猪样本检测结果 见图1，猪样本4、6检测为阳性;猪样本3、5检测为阴性。
[0039]试验例1特异性试验
[0040] 以猪附红细胞体、猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪胸膜肺炎放线 杆菌、副猪嗜血杆菌样品进行特异性检测。使用实施例1中所提供的方法和引物进行检测， 结果显示，除阳性对照组外均没有扩增曲线，扩增结果见图2。
[0041] 试验例2灵敏度试验
[0042] 用实施例1中制备的基因组模板用灭菌蒸馏水做10倍的梯度稀释，基因组DNA含量 分别为〇 · 149yg、0 · 0149yg、1 · 49ng、0 · 149ng、0 · 0149ng、1 · 49pg、0 · 149pg。每个稀释度各取1 yL作为模板，按实施例l方法进行检测，观察阳性条带，以出现阳性预期条带所用模板量的 最高稀释度计算其敏感性，结果表明最小检出量为〇.149ng，见图3。
[0043] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种检测猪弓形虫病的引物，其特征在于，所述引物如SEQ ID No:l和SEQ ID No:2 所示。2. 权利要求1所述的引物在制备检测猪弓形虫病的试剂盒中的应用。3. -种检测猪弓形虫病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的检测 猪弓形虫病的引物。4. 一种检测猪弓形虫病的方法，其特征在于，采用如SEQ ID No: 1和SEQ ID No:2所示 的引物，包括W下步骤： W待检猪样本基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，电泳鉴定;所述PCR扩增反应的反 应体系为： Premix 防 Taq 12 5|iL SEQ ID No: 1 IpL SEQID No:2 I阵 模板 l|iL 巧茵蒸链水 加至25pL ; 所述PCR扩增反应的反应程序为：94°C5min进行预变性;然后94°C30s，55°C30s，72°C 4〇3,35次循环;最后72°(：延伸1〇111111。
【专利摘要】本发明公开了一种检测猪弓形虫病的引物、试剂盒及方法，所述引物如SEQ？ID？No:1和SEQ？ID？No:2所示，所述方法是以待检猪样本基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，电泳鉴定。本发明的检测猪弓形虫病的引物可以特异性地扩增猪弓形虫，对其他常见病原无反应；方法具有很高的灵敏性，可以方便、快捷的对各种临床猪样本的猪弓形虫进行检测，有利于快速制定针对性的防控措施，操作简单、实用。
【IPC分类】C12N15/11, C12R1/90, C12Q1/68
【公开号】CN105648104
【申请号】
【发明人】宋爽, 欧阳海平, 王晓飞, 潘永飞, 王东东, 宋延华
【申请人】广东温氏食品集团股份有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年4月6日