一种提高植物乳杆菌冻干存活率的复合保护剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物乳杆菌制品生产技术领域，具体涉及一种提高植物乳杆菌冻干存活率的复合保护剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]随着人们生活水平的提高，益生菌食品的消费量逐年上升，益生菌添加到食品中的主要方式是直接添加菌体或以益生菌制剂的方式添加。越来越多的益生菌被用于替代抗生素的功能。其中乳酸菌(Lactic Acid Bacteria, LAB)是人体重要的的益生菌，具有调节人体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，抑制肠道内腐败菌的生长繁殖和腐败产物的产生等作用。
[0003]植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是乳酸菌的一种，革兰氏染色阳性、厌氧或兼性厌氧、无芽孢、耐酸、耐胆盐，最适生长温度为30?37°C，常见于乳制品、肉类、蔬菜以及果汁中的乳酸菌，能通过胃肠并定植于肠道发挥有益作用。植物乳杆菌无论是在食品发酵，还是工业乳酸发酵以及医疗保健等领域中均有着广泛的应用。
[0004]植物乳杆菌菌粉的制备方法主要有喷雾干燥技术，真空干燥技术及真空冷冻干燥技术。其中喷雾干燥技术单位产品耗热量大，设备的热效率低；进风温度和出风温度高，导致菌体存活率低，若降低温度，则容易出潮粉；对于菌粉的分离装置要求较高，易使产品损失和污染；但喷雾干燥的处理量大，成本低。而真空干燥技术需要配置真空系统，在大型连续化生产设备上还需要在进出口处设置传动部件的真空动密封结构，这种结构元件易造成泄漏；此外最大的问题是处理量小，成本高，适用于高附加值的产品。这两种方法得到的活菌的存活率很低，达不到冷冻干燥的水平，同时得到的菌粉复水性较低。相比之下，真空冷冻干燥技术具有其他干燥方法无可比拟的优点:菌种在低温下干燥，各种成分、酶的活性丧失少；可以保持菌种的形态、色泽；复水性好，能很快地吸水还原成干燥前的鲜活状态；保存期长，储存运输、销售方便。
[0005]但在冷冻干燥过程中，植物乳杆菌要经受冷冻和干燥两种激烈因素的作用，导致菌体死亡，影响其冻干存活率及菌粉活菌数的因素主要有菌株内在因素、培养基、培养条件、预冻条件、菌悬液浓度、冻干保护剂、亚致死处理及残留水分等。其中，冻干保护剂是最为复杂、最难选择的关键因素，它不仅影响植物乳杆菌在冻干过程中的细胞存活率，也影响保藏期间的细胞稳定性。李家鹏等研究了植物乳杆菌冻干保护剂的最佳配方:脱脂乳3.34%、海藻糖1.85%、硫酸锰0.25%，用此配方保护剂冻干样品时，能使细胞存活率能达到很高的存活率；吴满刚等用正交实验研究了植物乳杆菌冻干保护剂的配方为:海藻糖10%、麦芽糖12%、谷氨酸钠8%，此条件下活菌数为3.71X 109cfu/mL，菌体存活率达到75.43%。南昌大学的熊涛等用响应面法研究植物乳杆菌冻干保护剂最佳配方:脱脂奶粉9.24%、海藻糖4.47%, D-山梨醇13.42%，细胞存活率达到91.76%。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种能够解决植物乳杆菌菌粉在冻干过程中存在的冻干存活率低，活菌数少的问题，显著提高植物乳杆菌冻干存活率及菌粉活菌数的复合保护剂及其制备方法。
[0007]为达到上述目的，本发明的复合保护剂按质量份数包括5-12份的大豆多糖、6-10份的半乳糖、8-12份的低聚果糖、5-8份的海藻糖、18-24份的脱脂乳、3_6份的脯氨酸和100份蒸馏水。
[0008]本发明的制备方法方法如下:
[0009]1)按质量份数取100份蒸馏水分为三份，向其中一份加入5-12份的大豆多糖、6-10份的半乳糖、8-12份的低聚果糖和5-8份的海藻糖溶解后，灭菌，冷却后得溶液1 ;
[0010]2)向另一份蒸馏水中加入18-24份的脱脂乳溶解得脱脂乳溶液，灭菌，得溶液2 ;
[0011]3)将3-6份的脯氨酸溶解于剩余的蒸馏水中，配成溶液进行膜过滤除菌得溶液3 ；
[0012]4)将所制备的溶液1、2、3无菌条件下均匀混合，即得复合冻干保护剂。
[0013]所述步骤1)的灭菌是在110°C灭菌15min。
[0014]所述步骤2)的灭菌是在107°C灭菌15min。
[0015]所述步骤3)的过滤膜为0.22微米过滤膜。
[0016]所述步骤3)的过滤膜经121°C灭菌15min。
[0017]所述的大豆多糖的制备如下:将大豆粉经6号抽提溶剂油喷淋脱脂，得到脱脂大豆粉；然后把脱脂大豆粉用无菌水溶解、浓缩得浓缩液，向浓缩液中加入浓缩液1 一 4倍体积的质量浓度为80% -90%的乙醇溶液，在4°C静置后离心沉淀，把沉淀配成质量浓度为
5-10%水溶液，离心除去不溶物，取上清液加入同体积的4-5:1的氯仿-正丁醇的混合液，振摇，分层，取上清液，反复两次至三次，然后再用无水乙醇沉淀离心得到大豆多糖。
[0018]本发明的植物乳杆菌复合冻干保护剂的使用方法为，用MRS培养基活化3代后于高速冷冻离心机中5000r/min?8000r/min离心收集的植物乳杆菌菌泥，后与所述的保护剂按1: 2的体积比混合均匀，于_80°C预冻8-16h，再于5?8Pa条件下-40?_55°C冷冻干燥22-28h，得植物乳杆菌菌粉。
[0019]本发明提供的植物乳杆菌冻干保护剂，在制备菌粉的过程中加入冻干保护剂，可提高菌体的抗冷冻能力，从而提高菌粉的冻干存活率，且保藏期较长，存活率不易降低。所制备的植物乳杆菌菌粉中冻干存活率达到82.73 %?93.26 %，菌粉活菌数为
1.14X10ncfu/g ?1.98X 10ncfu/g。
【具体实施方式】
[0020]实施例1:
[0021]植物乳杆菌冻干保护剂的组成:按质量份数包括6份的大豆多糖、6.5份的半乳糖、8份的低聚果糖、6份的海藻糖、18份的脱脂乳、4份的脯氨酸和100份蒸馏水。
[0022]保护剂的制备方法为:
[0023]1)按质量份数取100份蒸馈水分为三份，向其中一份加入6份的大豆多糖、6.5份的半乳糖、8份的低聚果糖:6份的海藻糖溶解后，在110°C灭菌15min，冷却后得溶液1 ;
[0024]2)向另一份蒸馏水中加入18份的脱脂乳溶解得脱脂乳溶液，在107°C灭菌15min，得溶液2 ;
[0025]3)将4份的脯氨酸溶解于剩余的蒸馏水中，配成溶液采用0.22微米过滤膜过滤除菌得溶液3 ;其中，过滤膜先经过121°C灭菌15min ;
[0026]4)将所制备的溶液1、2、3无菌条件下均匀混合，即得复合冻干保护剂。
[0027]本发明的植物乳杆菌复合冻干保护剂的使用方法为，用MRS培养基活化3代后于高速冷冻离心机中8000r/min离心收集的植物乳杆菌菌泥，后与所述的保护剂按1: 2的体积比混合均匀，即lg菌粉加2mL复合冻干保护剂，于-80°C预冻8h，再于冷冻干燥机中冷冻干燥24h，得植物乳杆菌菌粉。
[0028]本发明提供的植物乳杆菌冻干保护剂，在制备菌粉的过程中加入冻干保护剂，可提高菌体的抗冷冻能力，从而提高菌粉的冻干存活率，且保藏期较长，存活率不易降低。所制备的植物乳杆菌菌粉中冻干存活率达到82.73%，菌粉活菌数为1.14X10ncfu/g。
[0029]实施例2:
[0030]植物乳杆菌冻干保护剂的组成:按质量份数包括8份的大豆多糖、8份的半乳糖、8份的低聚果糖、6份的海藻糖、18份的脱脂乳、5份的脯氨酸和100份蒸馏水。
[0031 ] 保护剂的制备方法为:
[0032]1)按质量份数取100份蒸馏水分为三份，向其中一份加入8份的大豆多糖、8份的半乳糖、8份的低聚果糖和6份的海藻糖溶解后，在110°C灭菌15min，冷却后得溶液1 ;
[0033]2)向另一份蒸馏水中加入18份的脱脂乳溶解得脱脂乳溶液，在107°C灭菌15min，得溶液2 ;
[0034]3)将5份的脯氨酸溶解于剩余的蒸馏水中，配成溶液采用0.22微米过滤膜过滤除菌得溶液3 ;其中，过滤膜先经过121°C灭菌15min ;
[0035]4)将所制备的溶液1、2、3无菌条件下均匀混合，即得复合冻干保护剂。
[0036]本实施例的大豆多糖的制备如下:将大豆粉经6号抽提溶剂油喷淋5次脱脂，得到脱脂大豆粉；然后把脱脂大豆粉用无菌水溶解、浓缩得浓缩液，向浓缩液中加入浓缩液3倍体积的质量浓度为80%的乙醇溶液，在4°C静置后离心沉淀，把沉淀配成质量浓度为5%水溶液，离心除去不溶物，取上清液加入同体积的4:1的氯仿-正丁醇的混合液，振摇，分层，取上清液，反复两次至三次，然后再用无水乙醇沉淀离心得到大豆多糖。
[0037]本发明的植物乳杆菌复合冻干保护剂的使用方法为，用MRS培养基活化3代后于高速冷冻离心机中6000r/min离心收集的植物乳杆菌菌泥，后与所述的保护剂按1: 2的体积比混合均匀，即lg菌粉加2mL复合冻干保护剂，于-80°C预冻8h再于冷冻干燥机中冷冻干燥24h，得植物乳杆菌菌粉。
[0038]本发明提供的植物乳杆菌冻干保护剂，在制备菌粉的过程中加入冻干保护剂，可提高菌体的抗冷冻能力，从而提高菌粉的冻干存活率，且保藏期较长，存活率不易降低。所制备的植物乳杆菌菌粉中冻干存活率达到86.54%，菌粉活菌数为1.61X 10ncfu/g。
[0039]实施例3:
[0040]植物乳杆菌冻干保护剂的组成:按质量份数包括5份的大豆多糖、8份的半乳糖、8份的低聚果糖、7份的海藻糖、120份的脱脂乳、5.5份的脯氨酸和100份蒸馏水。
[0041 ] 保护剂的制备方法为:
[0042]1)按质量份数取100份蒸馏水分为三份，向其中一份加入5份的大豆多糖、8份的半乳糖、