植物乳杆菌固定化制剂制备方法
【技术领域】：
[0001 ]本发明属于微生物菌剂领域。
【背景技术】：
[0002] 乳酸菌是对一类能利用可发酵糖类产生大量乳酸的细菌的通称。在分类学上属于 非正式、非规范的惯用名称，但因为它很容易被人们所理解和接受而广泛引用。乳酸菌是正 常人体肠道中极为重要的生理菌群之一，它具有维持人体微生态平衡、促进消化、防癌抗 癌、增强免疫力、抗衰老等作用，与机体健康息息相关。近年来，乳酸菌作为一种有益菌得到 了广泛的研究和开发，目前已广泛应用于保健食品、医药和食品等行业中 [1]。但是乳酸菌较 难长期保存，因此，乳酸菌的保藏成了热门的研究课题。利用真空冷冻干燥技术生产活菌制 剂是多种保藏方法中较为理想的一种 [2]。而制作菌粉的关键是保护剂种类及配比的选择。 因此，选择一种使用便捷的保藏形式，以及研究使菌种存活率高的保护剂配方有着积极意 义。
[0003] 乳酸菌容易退化、失活，如何解决乳酸菌的保藏是生产中面临的首要问题。目前， 日本把培养的乳酸菌制成悬浮液密封在包装材料里(包装材料可用合成树脂薄膜制或用铝 箱制），其装量可根据具体情况而定。封好的乳酸菌悬液，一定要保存在30°C以下，最好在Ο-? 〇°C 保存。
[0004] 乳酸菌的长期保藏方法，多采用冷冻干燥法或喷雾干燥法，将乳酸菌制成粉剂，用 以延长保存时间。冷冻干燥是将欲保藏的微生物细胞悬浮液冻结后，在真空条件下使冰升 华，最后达到干燥的目的。此方法主要是根据微生物生理、生化特点，干燥后使微生物的代 谢处于不活泼、生长繁殖受到抑制，达到休眠状态，以保持菌株原有特性。而且用这种方法 生产的发酵剂与喷雾干燥法等其他方法生产的发酵剂相比具有更高的稳定性、活性。
[0005] 但真空冷冻干燥过程是使发酵液中的游离水在冻结状态下失去的一个过程，冷冻 和干燥两个过程会造成部分微生物细胞的损伤、死亡及某些酶蛋白分子的钝化 [8]，如果冻 干工艺中保护剂选择不当，就会使乳酸菌的存活率下降。发酵液干燥前后乳酸菌的存活率 大小可直接体现不同保护剂对乳酸菌活力的影响。因此，冻干保护剂是制作干燥发酵剂最 为关键的因素之一，它不仅影响发酵剂在冻干过程中的细胞存活率，也影响保藏期间的细 胞稳定性。
[0006] 如今对于微生物菌粉保护剂的研究日益深入，骆承库、刘振民等[9]研究发现乳酸 菌经过冻融处理后，致死率增加。引起致死损伤的主要因素是机械效应、溶质效应和干燥效 应。在冷冻保存菌种时加入保护剂或采取适宜的冻藏、冻干条件，可以减轻菌体的生理性或 致死性损伤。保护剂明显提高菌体存活率的原因是由于：
[0007] ①保护剂存在的氢键和/或离子基团具有与细胞蛋白质结合的能力，这种结合起 到稳定细胞蛋白结构的作用，从而保护菌体，避免损伤。不同保护剂结合能力不同，所形成 的网络结构紧密程度就不一样。
[0008] ②保护剂的持水性和形成的网络，使得干燥过程中细胞的水分不至于急剧下降， 而使细胞蛋白质结构遭到破坏，菌体受损。网络结构越紧密，干剂残存水分含量越高。
[0009]③网络结构还使较多的菌体被包裹其中，从而减少菌体与氧气接触的机会，得到 较好的保护。而纤维结构表面积大，包裹的菌相对较少，大量的菌体暴露于表面，受损严重。 [0010]保护剂可以改变生物样品冷冻干燥时的物理、化学环境，进而减轻或防止冷冻干 燥或复水对细胞的损害，尽可能保持原有的各种生理生化特性和生物活性。保护剂按作用 方式可分为能透入细胞的保护剂和不能透入细胞的保护剂2种，按分子大小分为低分子化 合物(如低聚糖类、醇类、缓冲盐类、氨基酸和维生素类） [1()]和高分子化合物(如蛋白质、多 肽和多糖类)[11]。曹永梅[12]等对大分子保护剂对乳酸菌的保护作用进行了研究，他们认为 以脱脂奶粉与蔗糖、甘油复配后的保护效果最佳。这是因为三者具有互补作用，脱脂奶粉主 要在细胞表面起保护层作用，甘油能渗透到细胞内部。吕为群等 [13]提出作为低分子保护剂 应具有较强亲水性，结构上应具备3个以上氢键，对糖、醇而言应有5个以上羟基，可与菌体 细胞膜的磷脂中的磷酸基团或与菌体蛋白质极性基团形成氢键 [14]，从而保持菌体结构与 功能的完整。而大分子保护剂主要是通过包裹菌体而起到保护作用，且能对低分子保护剂 有促进作用 [11>14]，可两者协同使用效果更佳。
[0011]随着20世70年代兴起的固定化微生物细胞技术的发展，为细胞浓缩和发酵剂保藏 开辟了新的途径。人们发现固定化的微生物细胞因受固定化材料的保护而提高了微生物对 环境的适应性。把细胞固定在某种载体上，可提高细胞的稳定性、抗污染能力，并缩短细胞 的延迟期。细胞的固定化材料很多，如蛋白质、多糖、聚乙烯醇等无毒性的聚合物，其能够形 成凝胶状结构。
【发明内容】
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[0012] 本发明提供一种植物乳杆菌固定化制剂及其制备方法。
[0013] 技术方案如下：
[0014] 植物乳杆菌固定化制剂由如下方法制得植物乳杆菌液体培养到对数期中后期时 停止发酵离心收集菌体备用。
[0015] 冷冻干燥保护剂以10%脱脂乳为悬浮基质，添加2-5%小分子聚谷氨酸(20万Da)、 1-2 %大分子普鲁兰多糖、5-12 %麦精，混合冷冻干燥保护剂溶液稀释菌体，将悬浮液中菌 体浓度调节为101()cfu/mL左右。悬浮液lmL置于-20°C冰箱预冻4小时后，置于真空度为1 .Opa 的冷冻干燥器冻干24小时制得菌粉。
[0016] 植物乳杆菌为CGMCC NO. 11763,所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)于 2015年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC)，保 藏号为，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮 编：100101 〇
[0017] 植物乳杆菌益生特性如下：
[0018] 本发明所提供的植物乳杆菌CGMCC N0.11763经实验发现能够在pH为1.50的条件 下存活，在1%胆盐培养4小时后仍处于存活状态;植物乳杆菌CGMCC N0.11763降解亚硝酸 盐速度快，分解能力达到10.9mg/h/kg，该菌种在生产泡菜时，整个发酵过程中亚硝酸盐浓 度在4.8mg/kg以下；CGMCC N0.11763在发酵60h小时后，对胆固醇降解率可达到64.76%。 CGMCC N0 · 11763黏附能力测定的自凝集率为95 · 71 %。
[0019] CGMCC NO. 11763对胆固醇降解能力研究和测定：
[0020] 取lml CGMCC N0.11763母液接种于10mL的MRS胆固醇液体培养基（胆固醇含量 0. 1mg/ml，pH 6.2)中，37°C的恒温静置分别培养20h、40h、60h备用，以接入lmL无菌水的MRS 胆固醇培养基为对照，取以上培养不同时间的菌液样品及对照液各lml，9000r/min，4°C下 离心10min，得到发酵上清液，邻苯二甲醛法测定上清液中胆固醇含量(具体为:取各上清液 0 . lml于相应的试管中，加冰醋酸0.3ml，lmg/ml的邻苯二甲醛0.15ml，缓缓加入浓硫酸 1. 〇ml，混合均匀。室温静置lOmin，于550nm下测吸光值）。每一处理3个重复，以同样方法制 作胆固醇标准曲线，计算上清液中胆固醇含量及降解率，结果见表1。可知，CGMCCN0.11763 对胆固醇有很好的降解作用，在发酵60h小时后，降解率可达到64.76%。
[0021] 弄1对昍固醇的隆魅愔况"
[0022]
[0023] 菌CGMCC N0.11763菌株的耐胆盐试验：
[0024] 取CGMCCN0.11763菌液lmL接种菌种于含有不同胆盐（含量梯度为0.0%、0.2%、 0.4%、0.6%、0.8%、1%)的1011^]\?5液体培养基(？!1=6.4)，置于37°(3下分别培养0、2、411， 每个处理3个重复。各取lml样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释度溶液，取0.1ml稀释 液于MRS中涂布，于37°C生化培养箱中倒置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录计算平 板上的菌数个数。结果见表2。可知该菌在胆盐浓度为1 %处理4h后菌的生长量依然达到 0· 59±0·92 X 107(cfu/ml)，有很好的耐胆盐能力。
[0025] 表2耐胆盐能力检测[(土s) X 107cfu/ml]
[0026]
[0028] 菌CGMCC NO.11763菌株的耐酸试验
[0029] 取HLX37母液按lml接种菌种于不同pH值(pH梯度为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0)的 lOmLMRS液体培养基，置于37°C下分别培养0、2、4h，每一处理3个重复。各取lml样品菌液于 9ml生理盐水中混匀，制备稀释溶液，取0 . lml稀释液于MRS中