一种植物乳杆菌及其培养分离方法、筛选方法和应用
【专利摘要】本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌及其培养分离方法、筛选方法和应用，所述植物乳杆菌分类命名为：Lactobacillus plantarum，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC M 2016037，保藏日期为2016年1月14日。本发明提供的一种植物乳杆菌及其培养分离方法、筛选方法和应用，合理设计植物乳杆菌的培养分离方法和筛选方法，最终有效获得在混合果蔬汁中产酸能力强、耐酸性高且生长速率快的优质植物乳杆菌，且本发明筛选得到的植物乳杆菌具有很宽的温度适应性，在8℃至45℃范围内均能生长，本发明的植物乳杆菌能够广泛应用于酵素发酵和混合果蔬等乳酸菌发酵。CCTCC NO: M201603720160114
【专利说明】
-种植物乳杆菌及其培养分离方法、筛选方法和应用
技术领域
[0001] 本发明设及微生物技术领域，具体设及一种植物乳杆菌及其培养分离方法、筛选 方法和应用。
【背景技术】
[0002] 植物乳杆菌属于乳杆菌科中的乳杆菌属，，最适生长溫度为30~35°C，厌氧或兼性 厌氧，菌种为直或弯的杆状，单个、有时成对或成链状，最适抑为6.5左右，属于同型发酵乳 酸菌。植物乳杆菌与人类的生活关系密切，是一种常见于奶油、肉类及许多蔬菜发酵制品中 的乳酸菌，能通过胃并定植于肠道发挥有益作用。它对肠道微生物有重要影响，无论在食品 发酵，还是在工业乳酸发酵W及医疗保健等领域，都有着广泛的应用。
[0003] 目前我国拥有丰富的乳酸菌资源，可W筛选出发酵性能优良的酸敏性菌株，继而 生产出高质量的酸敏性发酵剂，不但可W打破外国公司在该领域的垄断，还可W发展具有 自主知识产权的商品发酵剂，降低生产成本，延长产品货架期，具有良好的社会效益和经济 效益。例如申请号为200910033694.8的发明专利公开了一种酸敏性保加利亚乳杆菌菌株及 其用法，在对天然乳品发酵剂一西藏灵茹的研究中分离、筛选到1株酸敏性菌株L.B-FM-6， 经鉴定为德±乳杆菌保加利亚亚种。对由该菌株与其它微生物菌株组合的发酵剂发酵的发 酵乳制品、发酵果汁、发酵蔬菜汁酸度的胆藏稳定性研究，解决活性乳酸菌饮品保质期短的 缺陷，显示出由该菌株参与的发酵剂在发酵乳制品、活性乳酸菌果蔬汁方面的优势，开发成 商业化的食品发酵剂有较大的经济价值。
[0004] 由于乳杆菌在代谢过程中能分解糖类产生大量有机酸类，其中主要是乳酸，随着 发酵进程继续，乳酸含量逐渐增加，致使培养基的酸度升高，乳杆菌的繁殖便被抑制，所W 普通发酵的最高活菌数仅能达到107~108c化/ml。为了促进乳杆菌的生长繁殖，一般采用 化学中和法或缓冲盐法调节和控制发酵液pH，保证乳杆菌生长繁殖必需的条件，可使活菌 数达109c化/ml左右。当需要较高产酸量时，往往较难实现，尤其是在批量生产中操作繁 杂，生产不便，工作量大，效率低下，针对性不强，难W在短时间内获得较高的酸量。
[0005] 由此可见，为了解决解决现有技术中的不足，迫切需要一种有效的植物乳杆菌筛 选方法和培育分离方法，W得到一种生长速率快、产酸量高并且耐酸性强的植物乳杆菌。
【发明内容】
[0006] 本发明为了解决上述技术问题，提供一种植物乳杆菌及其培养分离方法、筛选方 法和应用，本发明针对植物乳杆菌的培养分离方法及筛选方法易操作且方法简便，且使得 最终筛选的植物乳杆菌具有产酸量高且生长速率快的有点。
[0007] 为了达到上述技术效果，本发明包括W下技术方案：
[000引一种植物乳杆菌，所述植物乳杆菌分类命名为：Lactobacillus plantarum，保藏 于中国典型培养物保藏中屯、CCTCC，保藏编号为CCTCC Μ 2016037,保藏日期为2016年1月14 日。保藏地址，中国武汉，武汉大学。
[0009] 所述植物乳杆菌的16s DM序列见SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列。
[0010] -种细菌素，所述细菌素由上述植物乳杆菌发酵制得。
[0011] -种上述植物乳杆菌的培养分离方法，包括W下步骤:取混合果蔬酵素自然发酵 中期和后期的发酵膠样品，稀释后吸取涂布至分离培养基平板，25~38Γ静置培养，挑取菌 落大小为0.5~1.1mm，形态为圆形，颜色为乳白色的单菌落，转接至培养基斜面，25~38°C 静置培养得到植物乳杆菌。
[0012] 进一步的，所述的静止培养的时间为2天。
[0013] 进一步的，所述的分离培养基平板上的分离培养基为常规培养基、寡营养培养基 和模拟环境培养基中的一种或两种W上，
[0014] 所述常规培养基为西红柿琼脂培养基、西红柿汁琼脂培养基III、BCP培养基、牛肉 膏蛋白腺培养基、MC培养基、MRS培养基和LB培养基中的一种或两种W上；
[0015] 所述寡营养培养基的制备方法包括W下步骤:分别称取重量分数为1~5份的酵 母膏、2~10份的蛋白腺和20份琼脂，加热溶解于水中，调节抑至7,定容1L，分装后12rC灭 菌20分钟；
[0016] 所述模拟环境培养基包括pH值为3~7的LB培养基，其制备方法包括W下步骤:分 别取酵母膏、蛋白腺和琼脂，加热溶解于水中，调节pH至3~7,定容1L，分装后12rC灭菌20 分钟。
[0017] 进一步的，所述常规培养基的配制方法见中国科学院微生物研究所《菌种保藏手 册》编著组Barnett J A所撰写的文章内容。
[0018] 所述寡营养培养基:将LB培养基的两种营养成分(葡萄糖、蛋白腺)依次递减20%， W提供寡营养的生长环境，分别包括LB培养基II至LB培养基V，具体制备方法和成分如下： [0019] LB培养基II(LB II):酵母膏4.Og，蛋白腺8.Og，琼脂20.Og，加热溶于适量水中，调 节抑至7,定容至1L。分装后121°C灭菌20分钟。
[0020] LB培养基III(LB III):酵母膏3.Og，蛋白腺6.Og，琼脂20.Og，加热溶于适量水中， 调节pH至7,定容至1L。分装后121°C灭菌20分钟。
[0021] LB培养基IWLB IV):酵母膏2. Og，蛋白腺4. Og，琼脂20.0 g，加热溶于适量水中，调 节抑至7,定容至1L。分装后121°C灭菌20分钟。
[0022] LB培养基V(LB V):酵母膏l.Og，蛋白腺2.0g，琼脂20.0g，加热溶于适量水中，调节 抑至7,定容至1L。分装后121°C灭菌20分钟。
[0023] 模拟环境培养基（用于模拟环境培养）：设计调整LB培养基的抑从7至3依次递减， 来模拟细菌生长的原始酸性环境条件，W配合不同种类细菌对环境、营养条件不同程度的 需要。分别包括LB培养基VI至LB培养基VIII，具体制备方法和成分如下：
[0024] LB培养基VKLB VI):酵母膏5. Og，蛋白腺10.0 g，琼脂20.0 g，加热溶于适量水中， 调节抑至6,定容至1L。分装后121°C灭菌20分钟。
[00巧]LB培养基VII(LBVII):酵母膏5.Og，蛋白腺10.Og，琼脂20.Og，加热溶于适量水中， 调节pH至5,定容至1L。分装后121°C灭菌20分钟。
[00%] LB培养基VIII(LBVIII):酵母膏5.Og，蛋白腺10.Og，琼脂20.Og，加热溶于适量水 中，调节抑至4,定容至1L。分装后121°C灭菌20分钟。
[0027] -种上述植物乳杆菌的筛选方法，包括W下步骤：
[0028] 步骤一:植物乳杆菌菌株的培养分离:取混合果蔬酵素自然发酵中期和后期的发 酵膠样品，稀释后吸取涂布至分离培养基平板，25~38Γ静置培养，挑取菌落大小为0.5~ 1.1mm，形态为圆形，颜色为乳白色的单菌落，转接至培养基斜面，25~38°C静置培养保存备 用；
[0029] 步骤二:植物乳杆菌菌体的制备:取步骤一得到的植物乳杆菌菌株于35~40°C静 置培养后，取出细菌斜面菌种，用无菌水洗下菌苔，加入至灭菌离屯、管中，离屯、得到菌体沉 淀物，将菌体沉淀物洗涂后得到植物乳杆菌菌体；
[0030] 步骤植物乳杆菌序列分析:取步骤二制备的植物乳杆菌菌体进行DNA提取，W 提取的DNA为模板进行PCR扩增得到扩增产物，对扩增产物进行测序，得到植物乳杆菌菌株 的leSrDNA序列，由SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列组成，进行分析鉴定，筛选出同类的植物 乳杆菌菌株；
[0031] 步骤四：植物乳杆菌的筛选:将步骤Ξ得到的同类的植物乳杆菌菌株的单菌落分 别接种到MRS液体中静止培养，得到菌液，将菌液接种至果蔬汁液体中培养，在培养过程中 巧憶培养液的0D值、pH值和耐酸性，根据测定结果筛选植物乳杆菌。
[0032] 进一步的，所述的步骤一中，分离培养基平板上的分离培养基包括常规培养基、寡 营养培养基和模拟环境培养基中的一种或两种W上，
[0033] 所述常规培养基为西红柿琼脂培养基、西红柿汁琼脂培养基III、BCP培养基、牛肉 膏蛋白腺培养基、MC培养基、MRS培养基和LB培养基中的一种或两种W上；
[0034] 所述寡营养培养基的制备方法包括W下步骤:分别称取重量分数为1~5份的酵母 膏、2~10份的蛋白腺和20份琼脂，加热溶解于水中，调节抑至7,定容1L，分装后12rC灭菌 20分钟；
[0035] 所述模拟环境培养基包括抑值为3~7的LB培养基，其制备方法包括W下步骤:分 别取酵母膏、蛋白腺和琼脂，加热溶解于水中，调节pH至3~7,定容1L，分装后12rC灭菌20 分钟。
[0036] 采用规培养基、寡营养培养基和模拟环境培养基共同培养，可有效并全面筛选本 发明植物乳杆菌。
[0037] 进一步的，所述步骤二中静置培养的时间为2地，离屯、条件为1000化pm的速度离屯、 15,洗涂方法为用无菌水洗涂2次。
[0038] 进一步的，所述步骤Ξ中，W上游引物：
[0039] 5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ' 和下游引物
[0040] 5 ' -AAGGAGGTGAACCAGCCGCA-3 '为特异性引物对提取的DNA为模板进行PCR扩增，所 述上游引物和下游引物的核巧酸序列分别见SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，PCR扩增反应条 件为:94 °C预变性4min后，94 °C变性30 s，55 °C退火30s，72 °C延伸Imin，2~4步循环30次，再 72°C 延长 lOmin。
[0041] 进一步的，所述步骤四中，所述菌液W3%的接种量转接装有lOOmL果蔬汁液体的 150mL摇瓶中，37°C培养2地。
[0042] -种植物乳杆菌的应用，所述的植物乳杆菌用于发酵制备果蔬醋、粮食醋和果蔬 酵素。
[0043] 采用上述技术方案，包括W下有益效果:本发明提供的一种植物乳杆菌及其培养 分离方法、筛选方法和应用，合理设计植物乳杆菌的培养分离方法和筛选方法，最终有效获 得在混合果蔬汁中产酸能力强、耐酸性高且生长速率快的优质植物乳杆菌，且本发明筛选 得到的植物乳杆菌具有很宽的溫度适应性，在8Γ和45Γ下均能生长，本发明的植物乳杆菌 能够广泛应用于酵素发酵和混合果蔬等乳酸菌发酵。避免了采用化学中和法或缓冲盐法调 节和控制发酵液pH，保证乳酸菌生长繁殖必需的条件，来控制乳杆菌持续产生乳酸。
【附图说明】
[0044] 图1为本发明植物乳杆菌菌落图；
[0045] 图2为本发明植物乳杆菌100倍放大显微图；
[0046] 图3为本发明实施例Ξ中不同植物乳杆菌菌株生长曲线图；
[0047] 图4为本发明实施例Ξ中不同植物乳杆菌菌株产酸能力图。
【具体实施方式】
[0048] 下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。
[0049] 实施例一：一种植物乳杆菌，所述植物乳杆菌分类命名为：Lactobaci 1 lus 口1曰111曰圳111，保藏于中国典型培养物保藏中屯、0：了0：，保藏编号为0：了0：1 2016037，保藏日 期为2016年1月14日。
[0050] -种细菌素，所述细菌素由上述植物乳杆菌发酵制得。
[0051] -种上述植物乳杆菌的应用，所述的植物乳杆菌用于发酵制备果蔬醋、粮食醋和 果蔬酵素。
[0052] 实施例一的植物乳杆菌菌株的形态特征：
[0053] 菌落形态特征描述:如图1所示，菌落呈圆形，菌落直径0.6~1mm，菌落凸起成近球 形，表面光滑，乳白色。有酸、麻的气味。
[0化4] 个体形态特征：如图2所示，圆端短杆菌，为0.43~0.92μηιΧ 0.56~1.63μηι，单个、 成对或短链状。革兰氏阳性，不生芽抱。
[0055] 实施例二:一种上述植物乳杆菌的培养分离方法，包括W下步骤:取混合果蔬酵素 自然发酵中期和后期的发酵膠样品，稀释后吸取涂布至分离培养基平板，25Γ静置培养2 天，挑取菌落大小为0.5~1.1mm，形态为圆形，颜色为乳白色的单菌落，转接至培养基斜面， 38Γ静置培养2天得到植物乳杆菌。
[0056] 优选地，所述的分离培养基平板上的分离培养基为常规培养基、寡营养培养基和 模拟环境培养基，
[0057] 所述常规培养基为西红柿琼脂培养基、西红柿汁琼脂培养基III、BCP培养基、牛肉 膏蛋白腺培养基、MC培养基、MRS培养基和LB培养基；
[0058] 所述寡营养培养基的制备方法包括W下步骤:分别称取重量分数为1~5份的酵母 膏、2~10份的蛋白腺和20份琼脂，加热溶解于水中，调节抑至7,定容1L，分装后12rC灭菌 20分钟；
[0059] 所述模拟环境培养基包括pH值为3~7的LB培养基，其制备方法包括W下步骤:分 别取酵母膏、蛋白腺和琼脂，加热溶解于水中，调节抑至3~7,定容1L，分装后12rC灭菌20 分钟。
[0060] -种上述植物乳杆菌的筛选方法，包括W下步骤：
[0061 ]步骤一:植物乳杆菌菌株的培养分离:取混合果蔬酵素自然发酵中期和后期的发 酵膠样品，稀释后吸取涂布至分离培养基平板，25Γ静置培养，挑取菌落大小为0.5~ 1.1mm，形态为圆形，颜色为乳白色的单菌落，转接至培养基斜面，38Γ静置培养保存备用；
[0062] 步骤二:植物乳杆菌菌体的制备：取步骤一得到的植物乳杆菌菌株于35Γ静置培 养的细菌斜面菌种，用无菌水洗下菌苔，加入至灭菌离屯、管中，离屯、得到菌体沉淀物，将菌 体沉淀物洗涂后得到植物乳杆菌菌体；
[0063] 步骤植物乳杆菌序列分析:取步骤二制备的植物乳杆菌菌体进行DNA提取，W 提取的DNA为模板进行PCR扩增得到扩增产物，对扩增产物进行测序，得到植物乳杆菌菌株 的leSrDNA序列，由SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列组成，进行分析鉴定，筛选出同类的植物 乳杆菌菌株；
[0064] 步骤四：植物乳杆菌的筛选:将步骤Ξ得到的同类的植物乳杆菌菌株的单菌落分 别接种到MRS液体中静止培养，得到菌液，将菌液接种至果蔬汁液体中培养，在培养过程中 巧憶培养液的0D值、pH值和耐酸性，根据测定结果筛选植物乳杆菌。
[0065] 优选地，所述步骤二中静置培养的时间为24h，离屯、条件为100(K)rpm的速度离屯、 15,洗涂方法为用无菌水洗涂2次。
[0066] 优选地，所述步骤Ξ中，
[0067] W 上游引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和下游引物5'- AAGGAGGTGAACCAGCCGCA-3 '为特异性引物对提取的DNA为模板进行PCR扩增，所述上游引物 和下游引物的核巧酸序列分别见SEQ ID N02和SEQ ID N0.3，PCR扩增反应条件为:94°C预 变性4min后，94°C变性3〇8,55°(：退火3〇3,72°(：延伸1111111，2~4步循环30次，再72°(：延长 lOmin;所述步骤四中，所述菌液W3%的接种量转接装有lOOmL果蔬汁液体的150mL摇瓶中， 37°C培养2地。
[0068] 优选地，所述的分离培养基平板上的分离培养基包括常规培养基、寡营养培养基 和模拟环境培养基，
[0069] 所述常规培养基为西红柿琼脂培养基、西红柿汁琼脂培养基III、BCP培养基、牛肉 膏蛋白腺培养基、MC培养基、MRS培养基和LB培养基；
[0070] 所述寡营养培养基的制备方法包括W下步骤:分别称取重量分数为1~5份的酵母 膏、2~10份的蛋白腺和20份琼脂，加热溶解于水中，调节抑至7,定容1L，分装后12rc灭菌 20分钟。
[0071] 所述模拟环境培养基包括pH值为3~7的LB培养基，其制备方法包括W下步骤:分 别取酵母膏、蛋白腺和琼脂，加热溶解于水中，调节pH至3~7,定容1L，分装后12rC灭菌20 分钟。
[0072] 所述寡营养培养基分别包括LB培养基II至LB培养基V，具体制备方法和成分如下：
[0073] LB培养基IKLB II):酵母膏4.Og，蛋白腺8.Og，琼脂20.Og，加热溶于适量水中，调 节抑至7,定容至1L。分装后121°C灭菌20分钟。
[0074] LB培养基III(LB III):酵母膏3.Og，蛋白腺6.Og，琼脂20.Og，加热溶于适量水中， 调节pH至7,定容至1L。分装后121°C灭菌20分钟。
[0075] LB培养基IWLB IV):酵母膏2. Og，蛋白腺4. Og，琼脂20.0 g，加热溶于适量水中，调 节抑至7,定容至IL。分装后121°C灭菌20分钟。
[0076] LB培养基V(LB V):酵母膏l.Og，蛋白腺2.0g，琼脂20.0g，加热溶于适量水中，调节 抑至7,定容至1L。分装后121°C灭菌20分钟。
[0077] 所述模拟环境培养基分别包括LB培养基VI至LB培养基VIII，具体制备方法和成分 如下：
[007引 LB培养基VKLB VI):酵母膏5. Og，蛋白腺10.0 g，琼脂20.0 g，加热溶于适量水中， 调节抑至6,定容至1L。分装后121°C灭菌20分钟。
[0079] LB培养基VII (LBVII):酵母膏5 . Og，蛋白腺10.0 g，琼脂20 . Og，加热溶于适量水 中，调节抑至5,定容至1L。分装后121°C灭菌20分钟。
[0080] LB培养基VIIKLBVIII):酵母膏5.Og，蛋白腺10.Og，琼脂20.Og，加热溶于适量水 中，调节抑至4,定容至1L。分装后121°C灭菌20分钟。
[0081] 实施例Ξ: -种上述植物乳杆菌的培养分离方法，包括W下步骤:取混合果蔬酵素 自然发酵中期和后期的发酵膠样品，稀释后吸取涂布至分离培养基平板，25Γ静置培养2 天，挑取菌落大小为0.5~1.1mm，形态为圆形，颜色为乳白色的单菌落，转接至培养基斜面， 38Γ静置培养2天得到植物乳杆菌。
[0082] 优选地，所述的分离培养基平板上的分离培养基为常规培养基、寡营养培养基和 模拟环境培养基中的一种，
[0083] 所述常规培养基为西红柿琼脂培养基、西红柿汁琼脂培养基III、BCP培养基和牛 肉膏蛋白腺培养基中的一种；
[0084] 所述寡营养培养基的制备方法包括W下步骤:分别称取重量分数为1~5份的酵母 膏、2~10份的蛋白腺和20份琼脂，加热溶解于水中，调节抑至7,定容1L，分装后12rC灭菌 20分钟；
[0085] 所述模拟环境培养基包括pH值为3~7的LB培养基，其制备方法包括W下步骤:分 别取酵母膏、蛋白腺和琼脂，加热溶解于水中，调节pH至3~7,定容1L，分装后12rC灭菌20 分钟。
[0086] -种上述植物乳杆菌的筛选方法，包括W下步骤：
[0087] 步骤一:植物乳杆菌菌株的培养分离:取混合果蔬酵素自然发酵中期和后期的发 酵膠样品，稀释后吸取涂布至分离培养基平板，38Γ静置培养，挑取菌落大小为0.5~ 1.1mm，形态为圆形，颜色为乳白色的单菌落，转接至培养基斜面，25Γ静置培养保存备用；
[0088] 步骤二:植物乳杆菌菌体的制备：取步骤一得到的植物乳杆菌菌株于4(TC静置培 养的细菌斜面菌种，用无菌水洗下菌苔，加入至灭菌离屯、管中，离屯、得到菌体沉淀物，将菌 体沉淀物洗涂后得到植物乳杆菌菌体；
[0089] 步骤植物乳杆菌序列分析:取步骤二制备的植物乳杆菌菌体进行DNA提取，W 提取的DNA为模板进行PCR扩增得到扩增产物，对扩增产物进行测序，得到植物乳杆菌菌株 的leSrDNA序列，由SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列组成，进行分析鉴定，筛选出同类的植物 乳杆菌菌株；
[0090] 步骤四：植物乳杆菌的筛选:将步骤Ξ得到的同类的植物乳杆菌菌株的单菌落分 别接种到MRS液体中静止培养，得到菌液，将菌液接种至果蔬汁液体中培养，在培养过程中 巧憶培养液的0D值、pH值和耐酸性，根据测定结果筛选植物乳杆菌。
[0091] 优选地，所述步骤二中静置培养的时间为24h，离屯、条件为100(K)rpm的速度离屯、 15,洗涂方法为用无菌水洗涂2次。
[0092] 优选地，所述步骤Ξ中，
[0093] W 上游引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和下游引物5'- AAGGAGGTGAACCAGCCGCA-3 '为特异性引物对提取的DNA为模板进行PCR扩增，所述上游引物 和下游引物的核巧酸序列分别见SEQ ID N02和SEQ ID N0.3，PCR扩增反应条件为:94°C预 变性4min后，94°C变性3〇8,55°(：退火3〇3,72°(：延伸1111111，2~4步循环30次，再72°(：延长 lOmin;所述步骤四中，所述菌液W3%的接种量转接装有lOOmL果蔬汁液体的150mL摇瓶中， 37°C培养2地。
[0094] 优选地，所述的分离培养基平板上的分离培养基包括常规培养基、寡营养培养基 和模拟环境培养基中的一种，
[00M]所述常规培养基为西红柿琼脂培养基、西红柿汁琼脂培养基III、BCP培养基和牛 肉膏蛋白腺培养基中的一种；
[0096] 所述寡营养培养基的制备方法包括W下步骤:分别称取重量分数为1~5份的酵母 膏、2~10份的蛋白腺和20份琼脂，加热溶解于水中，调节抑至7,定容1L，分装后12rC灭菌 20分钟。
[0097] 所述模拟环境培养基包括pH值为3~7的LB培养基，其制备方法包括W下步骤:分 别取酵母膏、蛋白腺和琼脂，加热溶解于水中，调节pH至3~7,定容1L，分装后12rC灭菌20 分钟。
[0098] 所述寡营养培养基分别包括LB培养基II至LB培养基V，具体制备方法和成分如下：
[0099] LB培养基IKLB II):酵母膏4.Og，蛋白腺8.Og，琼脂20.Og，加热溶于适量水中，调 节抑至7,定容至1L。分装后121°C灭菌20分钟。
[0100] LB培养基m(LB III):酵母膏3.0g，蛋白腺6.0g，琼脂20.0g，加热溶于适量水中， 调节pH至7,定容至1L。分装后121°C灭菌20分钟。
[0101] LB培养基IWLB IV):酵母膏2. Og，蛋白腺4. Og，琼脂20.0 g，加热溶于适量水中，调 节抑至7,定容至1L。分装后121°C灭菌20分钟。
[0102] LB培养基V(LB V):酵母膏l.Og，蛋白腺2.0g，琼脂20.0g，加热溶于适量水中，调节 抑至7,定容至1L。分装后121°C灭菌20分钟。
[0103] 所述模拟环境培养基分别包括LB培养基VI至LB培养基VIII，具体制备方法和成分 如下：
[0104] LB培养基VKLB VI):酵母膏5. Og，蛋白腺10.0 g，琼脂20.0 g，加热溶于适量水中， 调节抑至6,定容至1L。分装后121°C灭菌20分钟。
[0105] LB培养基VII (LB VII):酵母膏5. Og，蛋白腺10 . Og，琼脂20 . Og，加热溶于适量水 中，调节抑至5,定容至1L。分装后121°C灭菌20分钟。
[0106] LB培养基VIII(LB VIII):酵母膏5.Og，蛋白腺10.Og，琼脂20.Og，加热溶于适量水 中，调节抑至4,定容至1L。分装后121°C灭菌20分钟。
[0107] 实施例四：一种植物乳杆菌的培养分离方法，包括W下步骤:取混合果蔬酵素自然 发酵中、后3个时期（即发酵第45、90天）的发酵膠样品lOg，放入盛有90mL无菌水的Ξ角瓶 中，振荡5分钟，充分摇匀，稀释至合适浓度，吸取10化1涂布分离培养基平板，28±rC静置 培养2d，根据菌落大小、形态和颜色等表型特征挑取单菌落，转接相应培养基斜面，28 ± rC 静置培养2d，编号保存备用。
[0108] 将涂布后的平板置于37±rC静置培养2d，待培养基表面长出单个菌落，其中根据 菌落大小、形态和颜色、透明圈等表型特征挑取单菌落，转接到相应培养基斜面，37±rC 静置培养2d。
[0109] -种植物乳杆菌的筛选方法，包括W下步骤：
[0110] 步骤一:植物乳杆菌菌株的培养分离:取混合果蔬酵素自然发酵中、后3个时期（即 发酵第45、90天）的发酵膠样品lOg，放入盛有90mL无菌水的Ξ角瓶中，振荡5分钟，充分摇 匀，稀释至合适浓度，吸取1〇化1涂布分离培养基平板，28 ± rC静置培养2d，根据菌落大小、 形态和颜色等表型特征挑取单菌落，转接相应培养基斜面，28 ± rC静置培养2d，编号保存 备用。
[0111] 将涂布后的平板置于37±rC静置培养2d，待培养基表面长出单个菌落，其中根据 菌落大小、形态和颜色、透明圈等表型特征挑取单菌落，转接到相应培养基斜面，37±rC静 置培养2d。
[0112] 步骤二:植物乳杆菌菌体的制备:将于37±rC静置培养24h左右的细菌斜面菌种， 用无菌水洗下菌苔，加入到灭菌离屯、管中，Wl〇〇(K)rpm的速度离屯、15s，将菌体沉淀物再用 无菌水洗涂2次后，备用。
[0113] 步骤植物乳杆菌序列分析:取步骤二制备的植物乳杆菌菌体进行DNA提取，DNA 提取按照试剂盒标准抽提步骤进行，W上游引物：5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '和下游引 物5 ' -AAGGAGGTGAACCAGCCGCA-3 '为特异性引物对提取的DNA为模板进行PCR扩增，在PCR反 应管中加入DNA模版化l，2XMix 1：3μ1，10μΜ BSF8/20 化Ι,ΙΟμΜ BSR1541/20 化l，d地20 9 μ1，混匀后进行PCR反应。PCR扩增反应条件为:94°C预变性4min后，94°C变性30s，55°C退火 30s，72°C延伸lmin，2-4步循环30次，再72°C延长lOmin，得到扩增产物，对扩增产物进行测 序，DNA测序采用双脱氧终止法，采用ClustalW2.1对分离菌株的leSrDNA序列进行多序列比 对分析，将完全一致的序列所代表的菌株归为一类。然后利用BLASTN2.2.29+程序捜索核算 数据库，下载得分高、序列一致性达到95%W上的序列，采用ClustalW2.1进行多序列比对 分析，用MEGA6.06软件采用N-J法重建系统发育树。数据分析采用最大组合似然模型 (Maximum Composite Likelihood),采取 1000次bootstrap检验(Xarkin MA，2007;Tamura 1(，2013;2}16112}1日雌，2000;41643日11化]\1〇巧11113,2008)。采用常规培养基、寡营养培养基^ 及模拟环境培养基从自然发酵果蔬酵素中共分离到细菌9株乳酸菌菌株，编号为LP4、LP18、 1口16、1^^3、1^^3、1^^、1^^5、1^^2、1^^2。经形态学、生理生化实验^及分子生物学165抽魁序 列鉴定运9个菌株均为Lactobacillus plantar皿(植物乳杆菌）。
[0114] 步骤四：植物乳杆菌的筛选:将筛选得到的LP4、LP18、LP16、LP3、LP13、LP8、LP15、 LP12、LP2 9株植物乳杆菌单菌落分别接种到装有lOOmL MRS液体培养的150mL摇瓶中，37°C 静止培养20h，分别制得菌液。
[0115] 所述常规培养基为西红柿琼脂培养基、西红柿汁琼脂培养基III、BCP培养基和牛 肉膏蛋白腺培养基；
[0116] 所述寡营养培养基的制备方法包括W下步骤:分别称取重量分数为1~5份的酵母 膏、2~10份的蛋白腺和20份琼脂，加热溶解于水中，调节抑至7,定容1L，分装后12rC灭菌 20分钟。
[0117] 所述模拟环境培养基包括pH值为3~7的LB培养基，其制备方法包括W下步骤:分 别取酵母膏、蛋白腺和琼脂，加热溶解于水中，调节pH至3~7,定容1L，分装后12rC灭菌20 分钟。
[0118] 所述寡营养培养基分别包括LB培养基II至LB培养基V，具体制备方法和成分如下：
[0119] LB培养基IKLB II):酵母膏4.Og，蛋白腺8.Og，琼脂20.Og，加热溶于适量水中，调 节抑至7,定容至1L。分装后121°C灭菌20分钟。
[0120] LB培养基III(LB III):酵母膏3.Og，蛋白腺6.Og，琼脂20.Og，加热溶于适量水中， 调节pH至7,定容至1L。分装后121°C灭菌20分钟。
[0121] LB培养基IWLB IV):酵母膏2. Og，蛋白腺4. Og，琼脂20.0 g，加热溶于适量水中，调 节抑至7,定容至1L。分装后121°C灭菌20分钟。
[0122] LB培养基V(LB V):酵母膏l.Og，蛋白腺2.0g，琼脂20.0g，加热溶于适量水中，调节 抑至7,定容至1L。分装后121°C灭菌20分钟。
[0123] 所述模拟环境培养基分别包括LB培养基VI至LB培养基VIII，具体制备方法和成分 如下：
[0124] LB培养基VKLB VI):酵母膏5. Og，蛋白腺10.0 g，琼脂20.0 g，加热溶于适量水中， 调节抑至6,定容至1L。分装后121°C灭菌20分钟。
[01巧]LB培养基VII (LB VII):酵母膏5. Og，蛋白腺10 . Og，琼脂20 . Og，加热溶于适量水 中，调节抑至5,定容至1L。分装后121°C灭菌20分钟。
[01 %] LB培养基VIII(LB VIII):酵母膏5.Og，蛋白腺10.Og，琼脂20.Og，加热溶于适量水 中，调节抑至4,定容至1L。分装后121°C灭菌20分钟。
[0127] 生长特性试验:将制得的菌株 1^^、1^^8、1口16、1^^3、1^^3、1口8、1口15、1^^2、1口2菌液 按3 %的接种量转接装有lOOmL混合果蔬汁液体培养的150mL摇瓶中，37 °C，培养时间为2地。 在培养的过程中每间隔化取1次培养液测定0D值。
[0128] 产酸试验:将筛选得到的LP4、LP18、LP16、LP3、LP13、LP8、LP15、LP12、LP2 9株植物 乳杆菌单菌落分别接种到装有lOOmL混合果蔬汁液体培养的150mL摇瓶中，37Γ静止培养 20h，分别制得菌液。将制得的菌株LP4、LP18、LP16、LP3、LP13、LP8、LP15、LP12、LP2菌液按 3%的接种量转接装有10〇1^135液体培养的15〇1^摇瓶中，37°(：，培养时间为48}1。在培养的 过程中每间隔化取1次培养液进行抑的测定，培养液pH采用P的十在20°C条件下测定。
[01 巧]耐酸试验:将筛选得到的LP4、LP18、LP16、LP3、LP13、LP8、LP15、LP12、LP2 9株植物 乳杆菌单菌落分别接种到装有lOOmL MRS液体培养的150mL摇瓶中，37°C静止培养20h，分别 制得菌液。
[0130] 在抑7.4的PBS缓冲液基础上用盐酸调整抑至2.5,每150mL摇瓶中装140mL，12rC， 高压灭菌 20min，冷却。然后按 6%(V/V)的量将 LP4、LP18、LP16、LP3、LP13、LP8、LP15、LP12、 LP29株植物乳杆菌菌液转入已灭菌的装有pH2.5的PBS缓冲液中，37°C厌氧，分别作用化、 化、化、1化、1化、2化测定活菌数。
[0131] 实施例四步骤四植物乳杆菌筛选的实验结果：
[0132] 按照实施例四所述的筛选方法，得到生长特性试验结果见图3,图3中菌株LP15在 混合果蔬汁中能快速适应，并且迅速生长，生长速率显著快于其它菌株。
[0133] 得到耐酸试验结果见图4,图4中表明菌株LP15在混合果蔬汁中能快速合成乳酸， 并且产酸量显著大于其它菌株。
[0134] 得到耐酸试验结果见表1，表1中表明LP15的耐酸性最强，在抑=2.5的缓冲液中处 理20h仍还有82%的菌体存活见表1，而其它几个菌株的存活率仅有一半。因此最终筛选出 LP15的植物乳杆菌。
[0135] 表1植物乳杆菌菌株在pH2.5不同时间处理的存活率
[0136]
[0137] 菌株号为LP15的植物乳杆菌为本专利所保护的植物乳杆菌，其16s DNA序列见SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列。
[0138] 筛选的LP15菌株发酵特性分析与种类的鉴定：
[0139] 将筛选到的LP15菌株进行糖发酵试验，其结果见表2,能发酵葡萄糖但不产生气 体，属同型乳酸发酵类型，细胞壁中不含有二氨基庚二酸(meso-DAP)，产生化-乳酸。均分解 核糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、薦糖、麦芽糖、纤维二糖、乳糖等产酸，不利用纤维二 糖、松Ξ糖、菊粉、肌醇、屯叶巧、扁桃巧。根据伯杰氏手册(第八版)将LP15菌株鉴定为植物 乳杆菌。溫度生长试验发现，LP15菌株在8°C和45°C下均能生长，该菌株对溫度具有很好的 适应性。
[0140] 表2糖发酵试验
[0141]
[0142] 筛选的LP15菌株16s rDNA分子鉴定：
[0143] 通过PCR扩征获得LP15菌株16s rDNA分子序列，全长1417bp。通过Blast分析，与其 它植物乳杆菌化actobacillus planta;rum)16s rDNA分子序列的相似性达到100%和 99%。联合形态学特征，生理生化特征W及16s rDNA分子特征将LP1 5菌株鉴定为 Lactobacillus plantarum。W上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发 明，对于本领域的技术人员来说，本发明可W有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则 之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种植物乳杆菌，其特征在于，所述植物乳杆菌分类命名为：Lactobaci 1 lus ?1&1^&^1111，保藏于中国典型培养物保藏中心0^0：，保藏编号为0^0：1 2016037，保藏日 期为2016年1月14日。2. -种细菌素，其特征在于，所述细菌素由权利要求1所述的植物乳杆菌发酵制得。3. -种权利要求1所述的植物乳杆菌的培养分离方法，其特征在于，包括以下步骤:取 混合果蔬酵素自然发酵中期和后期的发酵醪样品，稀释后吸取涂布至分离培养基平板，25 ~38°C静置培养，挑取菌落大小为0.5~1.1mm，形态为圆形，颜色为乳白色的单菌落，转接 至培养基斜面，25~38 °C静置培养得到植物乳杆菌。4. 根据权利要求3所述的种植物乳杆菌的培养分离方法，其特征在于，所述的静止培养 的时间为2天。5. 根据权利要求3所述的一种植物乳杆菌的培养分离方法，其特征在于，所述的分离培 养基平板上的分离培养基为常规培养基、寡营养培养基和模拟环境培养基中的一种或两种 以上； 所述常规培养基为西红柿琼脂培养基、西红柿汁琼脂培养基ΠI、BCP培养基、牛肉膏蛋 白胨培养基、MC培养基、MRS培养基和LB培养基中的一种或两种以上； 所述寡营养培养基的制备方法包括以下步骤:分别称取重量分数为1~5份的酵母膏、2 ~10份的蛋白胨和20份琼脂，加热溶解于水中，调节pH至7，定容1L，分装后121°C灭菌20分 钟； 所述模拟环境培养基包括pH值为3~7的LB培养基，其制备方法包括以下步骤:分别取 酵母膏、蛋白胨和琼脂，加热溶解于水中，调节pH至3~7,定容1L，分装后121°C灭菌20分钟。6. -种权利要求1所述的植物乳杆菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤一:植物乳杆菌菌株的培养分离:取混合果蔬酵素自然发酵中期和后期的发酵醪 样品，稀释后吸取涂布至分离培养基平板，25~38°C静置培养，挑取菌落大小为0.5~ 1.1mm，形态为圆形，颜色为乳白色的单菌落，转接至培养基斜面，25~38°C静置培养保存备 用； 步骤二:植物乳杆菌菌体的制备：取步骤一得到的植物乳杆菌菌株于35~40°C静置培 养后，取出细菌斜面菌种，用无菌水洗下菌苔，加入至灭菌离心管中，离心得到菌体沉淀物， 将菌体沉淀物洗涤后得到植物乳杆菌菌体； 步骤三:植物乳杆菌序列分析:取步骤二制备的植物乳杆菌菌体进行DNA提取，以提取 的DNA为模板进行PCR扩增得到扩增产物，对扩增产物进行测序，得到植物乳杆菌菌株的 16SrDNA序列，进行分析鉴定，筛选出同类的植物乳杆菌菌株； 步骤四：植物乳杆菌的筛选:将步骤三得到的同类的植物乳杆菌菌株的单菌落分别接 种到MRS液体中静止培养，得到菌液，将菌液接种至果蔬汁液体中培养，在培养过程中测定 培养液的0D值、pH值和耐酸性，根据测定结果筛选植物乳杆菌。7. 根据权利要求6所述的一种植物乳杆菌的筛选方法，其特征在于，所述步骤二中静置 培养的时间为24h，离心条件为lOOOOrpm的速度离心15,洗涤方法为用无菌水洗涤2次。8. 根据权利要求6所述的一种植物乳杆菌的筛选方法，其特征在于，所述步骤三中， 以上游引物：5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ' 和下游引物5 ' -AAGGAGGTGAACCAGCCGCA-3 ' 为特异性引物对提取的DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增反应条件为:94°C预变性4min后， 94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，2~4步循环30次，再72°C延长lOmin; 所述步骤四中，所述菌液以3%的接种量转接装有100mL果蔬汁液体的150mL摇瓶中，37 。(:培养 24h。9. 根据权利要求6所述的一种植物乳杆菌的筛选方法，其特征在于，所述的分离培养基 平板上的分离培养基包括常规培养基、寡营养培养基和模拟环境培养基中的一种或两种以 上， 所述常规培养基为西红柿琼脂培养基、西红柿汁琼脂培养基ΠI、BCP培养基、牛肉膏蛋 白胨培养基、MC培养基、MRS培养基和LB培养基中的一种或两种以上； 所述寡营养培养基的制备方法包括以下步骤:分别称取重量分数为1~5份的酵母膏、2 ~10份的蛋白胨和20份琼脂，加热溶解于水中，调节pH至7，定容1L，分装后121°C灭菌20分 钟； 所述模拟环境培养基包括pH值为3~7的LB培养基，其制备方法包括以下步骤:分别取 酵母膏、蛋白胨和琼脂，加热溶解于水中，调节pH至3~7,定容1L，分装后121°C灭菌20分钟。10. -种权利要求1所述的植物乳杆菌的应用，其特征在于，所述的植物乳杆菌用于发 酵制备果蔬醋、粮食醋和果蔬酵素。
【文档编号】C12Q1/04GK106010997SQ201610278215
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】周礼红, 潘肇仪
【申请人】周礼红