一种醋酸杆菌及其培养分离方法、筛选方法和应用
【专利摘要】本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种醋酸杆菌及其培养分离方法、筛选方法和应用，所述醋酸杆菌分类命名为：Acetobacter pasteurianus，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC M 2016036，保藏日期为2016年1月14。本发明提供的一种醋酸杆菌及其培养分离方法、筛选方法和应用，合理设计醋酸杆菌的培养分离方法和筛选方法，最终有效获得在混合果蔬汁中产酸能力强且耐酒精性高的优质醋酸杆菌，且本发明筛选得到的醋酸杆菌具有很宽的温度适应性，在8℃和42℃下均能生长，本发明的醋酸杆菌能够广泛应用于酵素发酵和混合果蔬发酵。CCTCC NO: M201603620160114
【专利说明】
-种醋酸杆菌及其培养分离方法、筛选方法和应用
技术领域
[0001] 本发明设及微生物技术领域，具体设及一种醋酸杆菌及其培养分离方法、筛选方 法和应用。
【背景技术】
[0002] 果醋是W水果或果品加工的下脚料为主要原料，经酒精发酵、醋酸发酵酿制而成 的一种营养丰富，风味优良，保健作用突出的新一代酸性调味品或饮料。我国果醋历史悠 久，几乎与果酒是同时代的产物，早在夏朝就开始有记载。与粮食醋相比，果醋的营养成分 更为丰富，含有10种W上有机酸和人体所需的多种氨基酸、维生素、无机盐、矿物质、碳水化 合物等。随着人们生活水平的不断提高，果醋的保健功能愈来愈受到人们的重视，研究表 明：果醋具有食疗保健、减肥瘦身、美白护肤、抗病、抗衰老、抗疲劳等功能，并被誉为"21世 纪的食品"。国内也正掀起喝果醋的热潮。目前，有关果醋菌种选育、果醋工艺和果醋调配的 研究也越来越受到研究者的青睐，而果醋酿造用菌种是影响果醋口感和品质的重要因素之 〇
[0003] 目前，在果醋酿造过程中我国主要用到的有两种醋酸菌。一种是果醋液态发酵中 使用的菌种是Asl.41(A.rancensL.)恶臭醋酸杆菌浑浊变种，另一种是沪酿1.01醋酸杆菌 (A.lovanienseL.)罗旺醋酸杆菌，是上海酿造科学研究所和上海醋厂从丹东速酿醋中分离 的菌种。醋酸菌是一类能将酒精氧化成醋酸的细菌。早在1400多年W前我国已有了对醋酸 菌的特性了解，并成功利用[23] nPasteur在1868年阐明了醋酸菌是食醋中的微生物。根据 醋酸菌的生理生化特性，可将醋酸细菌分为醋杆菌属（Acetobacter)和葡萄糖杆菌属 (Gluconobacter)。醋杆菌属主要是将酒精氧化为醋酸，常用于酿醋工业;葡萄糖杆菌属主 要是将葡萄糖氧化为葡萄糖酸。醋酸菌可W被用来生产食醋、葡萄糖酸、α-酬戊二酸和山梨 酸、并且还可进一步合成Vc。所W醋酸菌被应用到食醋酿造工业及Vc制造工业上。
[0004] 果醋菌种的选择是影响果醋品质的关键因素之一。当前用于果醋生产的菌种放入 食醋菌种AS1.41(A.rancens L)恶臭醋酸杆菌浑浊变种和沪酿1.01醋酸杆菌 (A. lovaniense L)，均存在产酸能力、耐酒精能力不高，形成的果醋香气不足的缺点。
[0005] 由此可见，为了解决现有技术中的不足，迫切需要一种有效的醋酸杆菌筛选方法 和培育分离方法，W得到一种品质优良、产酸能力强、耐酒精能力高的醋酸杆菌。
【发明内容】
[0006] 本发明为了解决上述技术问题，提供一种醋酸杆菌及其培养分离方法、筛选方法 和应用，本发明针对醋酸杆菌的培养分离方法及筛选方法易操作且方法简便，且使得最终 筛选的醋酸杆菌具有产酸量高且生长速率快的有点。
[0007] 为了达到上述技术效果，本发明包括W下技术方案：
[000引一种醋酸杆菌，所述醋酸杆菌分类命名为:Acetobacter pasteurianus，保藏于中 国典型培养物保藏中屯、CCTCC，保藏编号为CCTCC Μ 2016036,保藏日期为2016年1月14。
[0009] 所述醋酸杆菌的16s DM序列见SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。
[0010] -种细菌素，所述细菌素由上述醋酸杆菌发酵制得。
[0011] -种上述醋酸杆菌的培养分离方法，包括W下步骤:取混合果蔬或粮食中自然发 酵醋的醋酷样品，放于盛有基础培养基的容器中，振荡培养后，取稀释后的增殖液，用涂布 法将醋酷样品接种于分离培养基上进行培养，培养结束后挑选有透明圈的单菌落转接至斜 面保藏培养基，保存得到醋酸杆菌。
[0012] 进一步的，所述振荡培养的条件为在转速12化/min,调节溫度30°C振荡培养4她； 所述增殖液用无菌水分别稀释100000倍、1000000倍、10000000倍，取各稀释浓度增殖液增 殖液采用涂布法将醋酷样品接种于分离培养基上进行培养上，3(TC培养7化后培养结束。
[0013] 进一步的，所述的基础培养基的制备方法包括W下步骤:取相同质量的酵母膏和 葡萄糖，加热溶解于水中，调节抑至4.5,定容1L，分装后12rc灭菌20分钟；
[0014] 所述分离培养基的制备方法包括W下步骤：取100ml所述基础培养基加入琼脂， 0.1 MPa、12rC条件下灭菌，然后加入无菌化C〇3和无水乙醇，分别装于无菌培养皿中，制成 分离培养基;所述琼脂占所述分离培养基的体积百分数为2%，所述无菌CaC〇3占所述分离 培养基的体积百分数为2%，所述无水乙醇占所述分离培养基的体积百分数为3% ;
[0015] 所述斜面保藏培养基的制备方法包括W下步骤:取上述制备的基础培养基加入琼 月旨，于0.1 MPa、12rC条件下灭菌，灭菌后加入无菌化C03和无水乙醇得到斜面保藏培养基。
[0016] -种上述醋酸杆菌的筛选方法，包括W下步骤：
[0017] 步骤一:醋酸杆菌菌株的培养分离:取混合果蔬或粮食中自然发酵醋的醋酷样品， 放于盛有基础培养基的容器中，振荡培养后，取稀释后的增殖液，用涂布法将醋酷样品接种 于分离培养基上进行培养，培养结束后挑选有透明圈的单菌落转接至斜面保藏培养基，保 存得到醋酸杆菌；
[0018] 步骤二:醋酸杆菌的筛选:将步骤一得到的醋酸杆菌转接于基本培养基中，振荡培 养后得到醋酸杆菌菌株种子液，将制得的醋酸杆菌菌株种子液分别接种于含有体积百分数 为0 %、5 %、9 %、11 %、13 %、15 %的酒精的基础培养基中，摇床培养，然后测定0D值和产酸 量，根据测定结果筛选醋酸杆菌。
[0019] 进一步的，所述步骤一中，所述振荡培养的条件为在转速12化/min,调节溫度30°C 振荡培养4她;所述增殖液用无菌水分别稀释到10-5、10-6、10-7浓度，取各浓度增殖液采用 涂布法将醋酷样品接种于分离培养基上进行培养上，3(TC培养7化后培养结束。
[0020] 进一步的，所述步骤一中，所述的基础培养基的制备方法包括W下步骤:取相同质 量的酵母膏和葡萄糖，加热溶解于水中，调节抑至4.5,定容1L，分装后12rC灭菌20分钟；
[0021] 所述分离培养基的制备方法包括W下步骤：取100ml所述基础培养基加入琼脂， 0.1 MPa、12rC条件下灭菌，然后加入无菌CaC〇3和无水乙醇，分别装于无菌培养皿中，制成 分离培养基;所述琼脂占所述分离培养基的体积百分数为2%，所述无菌CaC〇3占所述分离 培养基的体积百分数为2%，所述无水乙醇占所述分离培养基的体积百分数为3% ;
[0022] 所述斜面保藏培养基的制备方法包括W下步骤:取上述制备的基础培养基加入琼 月旨，于0.1 MPa、12rC条件下灭菌，灭菌后加入无菌化C〇3和无水乙醇得到斜面保藏培养基。
[0023] 进一步的，所述步骤二中，所述振荡培养条件为30°C、200r/min、振荡培养24h;所 述摇床培养条件为30°C、200~22化/min、摇床培养4她;所述测定0D值的方法为，用分光光 度计在波长为600nm时测定吸光度，计算OD值。
[0024] -种醋酸杆菌的应用，所述的醋酸杆菌用于粮食混合酒精发酵后或果蔬汁的醋酸 发酵。
[0025] 采用上述技术方案，包括W下有益效果:本发明提供的一种醋酸杆菌及其培养分 离方法、筛选方法和应用，合理设计醋酸杆菌的培养分离方法和筛选方法，最终有效获得在 混合果蔬汁中产酸能力强、耐酒精性高且生长速率快的优质醋酸杆菌，且本发明筛选得到 的醋酸杆菌具有很宽的溫度适应性，在8Γ和42Γ下均能生长，本发明的醋酸杆菌能够广泛 应用于酵素发酵和混合果蔬发酵。
【附图说明】
[0026] 图1为本发明醋酸杆菌菌落图；
[0027] 图2为本发明醋酸杆菌100倍放大显微图。
【具体实施方式】
[0028] 下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。
[0029] 实施例一：一种醋酸杆菌，所述醋酸杆菌分类命名为：Acetobacter pasteurianus，保藏于中国典型培养物保藏中屯、CCTCC，保藏编号为CCTCC Μ 2016036，保藏 日期为2016年1月14。保藏地址中国武汉，武汉大学。
[0030] -种细菌素，所述细菌素由上述醋酸杆菌发酵制得。
[0031] -种上述醋酸杆菌的应用，所述的醋酸杆菌用于用于果蔬汁、粮食混合酒精发酵 后的醋酸发酵。
[0032] 实施例一的醋酸杆菌菌株的鉴定
[0033] 形态学鉴定：
[0034] 菌落形态特征描述:如图1所示，菌落圆形，1~1.5mm，凸起呈近球形，表面光滑，湿 润，不透明，浅黄栋色。
[0035] 个体形态特征:如图2所示，细胞短杆状，0.985~0.990 X 1.523~4.031μπι，革兰氏 阴性菌，单生，不产芽抱，非运动性好氧菌。
[0036] 16s rDNA分子生物学鉴定：
[0037] 通过PCR扩增获得醋酸杆菌菌株16s rDNA分子全长序列，1352bp。经blast程序捜 索核酸数据库，醋酸杆菌菌株16s rDNA分子全长序列与数据库中Acetobacter pasteurianus所有醋酸杆菌菌株16s rDNA序列的相似性达到99~100%分析。根据16s rDNA分子序列分析将醋酸杆菌菌株初步鉴定为Acetobacter pasteurianus。
[0038] 实施例二:一种醋酸杆菌的培养分离方法，包括W下步骤:取混合果蔬或粮食中自 然发酵醋的醋酷样品，放于盛有基础培养基的容器中，振荡培养后，取稀释后的增殖液，用 涂布法将醋酷样品接种于分离培养基上进行培养，培养结束后挑选有透明圈的单菌落转接 至斜面保藏培养基，保存得到醋酸杆菌。
[0039] -种醋酸杆菌的筛选方法，包括W下步骤：
[0040] 步骤一:醋酸杆菌菌株的培养分离:按照上述制备方法得到醋酸杆菌；
[0041] 步骤二:醋酸杆菌的筛选:将步骤一得到的醋酸杆菌转接于基本培养基中，振荡培 养后得到醋酸杆菌菌株种子液，将制得的醋酸杆菌菌株种子液分别接种于含有体积百分数 为0 %、5 %、9 %、11 %、13 %、15 %的酒精的基础培养基中，摇床培养，然后测定0D值和产酸 量，根据测定结果筛选醋酸杆菌。
[0042] 实施例Ξ: -种醋酸杆菌的培养分离方法，包括W下步骤:取混合果蔬或粮食中自 然发酵醋的醋酷样品，放于盛有基础培养基的容器中，在转速12化/min,调节溫度30°C振荡 培养48h，取增殖液用无菌水分别稀释100000倍、1000000倍、10000000倍，取各稀释浓度增 殖液，采用涂布法将醋酷样品接种于分离培养基上进行培养上，3(TC培养7化后培养，培养 结束后挑选有透明圈的单菌落转接至斜面保藏培养基，保存得到醋酸杆菌。
[0043] -种醋酸杆菌的筛选方法，包括W下步骤：
[0044] 步骤一:醋酸杆菌菌株的培养分离:按照上述制备方法得到醋酸杆菌；
[0045] 步骤二:醋酸杆菌的筛选:将步骤一得到的醋酸杆菌转接于基本培养基中，振荡培 养后得到醋酸杆菌菌株种子液，将制得的醋酸杆菌菌株种子液分别接种于含有体积百分数 为0 %、5 %、9 %、11 %、13 %、15 %的酒精的基础培养基中，摇床培养，然后测定0D值和产酸 量，根据测定结果筛选醋酸杆菌。
[0046] 实施例四：一种醋酸杆菌的的培养分离方法，包括W下步骤：
[0047] 步骤一：制备基础培养基:取相同质量的酵母膏和葡萄糖，加热溶解于水中，调节 抑至4.5,定容1L，分装后121°C灭菌20分钟；
[004引步骤二：制备分离培养基:取100ml所述基础培养基加入琼脂，0 . IMPa、12rC条件 下灭菌，然后加入无菌化C03和无水乙醇，分别装于无菌培养皿中，制成分离培养基;所述琼 脂占所述分离培养基的体积百分数为2 %，所述无菌化C03占所述分离培养基的体积百分数 为2%，所述无水乙醇占所述分离培养基的体积百分数为3% ;
[0049] 步骤Ξ:制备斜面保藏培养基:取上述制备的基础培养基加入琼脂，于0.1 MPa、121 °C条件下灭菌，灭菌后加入无菌化C〇3和无水乙醇得到斜面保藏培养基。
[0050] 步骤四：醋酸杆菌菌株的培养分离:称取约20g混合果蔬或粮食中自然发酵醋的醋 酷样品，放于盛有100血基础培养基的500血Ξ瓶中，在转速12化/min,30°C振荡培养4她后， 所述增殖液用无菌水分别稀释100000倍、1000000倍、10000000倍，取各稀释浓度增殖液 0.2mL，用涂布法接种于分离培养基上。3(TC培养7化后，挑选出菌落丰厚，且生长占优势的 单菌落进行纯化，即培养结束后挑选有透明圈的单菌落转接至斜面保藏培养基，保存得到 醋酸杆菌，最后分离获得9株杆菌，经革兰氏染色和芽抱染色，显微镜观察，其中5株为芽抱 杆菌，4株为革兰氏阴性杆菌，分子生物学方法初步鉴定为醋酸杆菌。编号分别为ΑΡΤΙ、 ΑΡΤ10、ΑΡΤ18、ΑΡΤ17;
[0051] -种醋酸杆菌的筛选方法，包括W下步骤：
[0052] 步骤一:醋酸杆菌菌株的培养分离:按照上述制备方法得到醋酸杆菌；
[0053] 步骤二:醋酸杆菌的筛选：
[0化4]耐酸性强度测定:将4株醋酸杆菌APT1、APT10、APT18、APT17平板单菌落转接于装 有30mL基本培养基的150mL摇瓶中，30°C，200r/min，振荡培养2地，分别制得ΑΡΤΙ、APT10、 APT18、APT17菌株种子液。
[0055]将制得的APTl、APT10、APT18、APT17菌株种子液菌按3-4%接种量分别接种到添加 酒精浓度为〇%、5%、9%、11%、13%、15%的基础培养基中，30°(：，200以111111，摇床培养48}1， 然后用分光光度计在波长为600nm时测定吸光度，WOD值计。
[0化6] 产酸量测定：将4株醋酸杆菌APT1、APT10、APT18、APT17平板单菌落转接于装有 30mL基本培养基的150mL摇瓶中，30°C，200r/min，振荡培养24h，分别制得APTUAPT10、 APT18、APT17菌株种子液。
[0057] 将制得的APTl、APT10、APT18、APT17菌株种子液菌按4-5%接种量分别接种到添加 酒精浓度为5%、9%、11%、13%、15%的基础培养基中，30°C，200-220r/min，摇床培养48h， 测定产酸量。
[0058] 实施例四中的醋酸杆菌筛选实验结果：
[0化9] 结果表明见表1，菌株ΑΡΤΙΟ和APT17在5%的酒精浓度下几乎不能正常生长，菌株 ΑΡΤΙ能耐受5%的酒精，但在酒精度为9%时几乎不能生长。菌株ΑΡΤ18展现出了很强的酒精 耐受力，在15%的酒精中还能生长。
[0060]表1不同菌株的耐酸强度 「00611
[0063] 注：代表该菌株在该酒精浓度下不生长，无 0D值。
[0064] 结果表明见表2，菌株4口1'1、4口1'10、4口1'17在酒精浓度为5%的基础培养基中均具有 合成代谢酸的能力，产酸量分别为1.189邑凡、1.2邑/1、0.058邑/1，当酒精浓度达到5%时，合 成代谢酸的能力受到限制。菌株ΑΡΤ18在合成代谢酸的能力较强，在酒精浓度为 之间合成酸的量显著高于其它酒精浓度，产酸量达到1.94g/L。
[0065] 表2不同菌株的产酸量
[0066]
[0067] 注：代表该菌株在该酒精浓度下不产酸。
[0068] 本发明所保护的醋酸杆菌为最终筛选的到的菌株编号为APT18的醋酸杆菌，其16s DM序列见SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。
[0069] 实施例四步骤二中的筛选出的ΑΡΤΙ 8菌株溫度生长试验：
[0070] 溫度生长试验发现，ΑΡΤ18菌株在8°C和42°C下均能生长，该菌株对溫度具有很好 的适应性。
[0071] W上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可W有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种醋酸杆菌，其特征在于，所述醋酸杆菌分类命名为：Acetobacter pasteurianus，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC Μ 2016036，保藏 日期为2016年1月14。2. -种细菌素，其特征在于，所述细菌素由权利要求1所述的醋酸杆菌发酵制得。3. -种权利要求1所述的醋酸杆菌的培养分离方法，其特征在于，包括以下步骤:取混 合果蔬或粮食中自然发酵醋的醋醅样品，放于盛有基础培养基的容器中，振荡培养后，取稀 释后的增殖液，用涂布法将醋醅样品接种于分离培养基上进行培养，培养结束后挑选有透 明圈的单菌落转接至斜面保藏培养基，保存得到醋酸杆菌。4. 根据权利要求3所述的一种醋酸杆菌的培养分离方法，其特征在于，所述振荡培养的 条件为在转速120r/min，调节温度30°C振荡培养48h;所述增殖液用无菌水分别稀释100000 倍、1000000倍、10000000倍，取各稀释浓度增殖液，采用涂布法将醋醅样品接种于分离培养 基上进行培养上，30°C培养72h后培养结束。5. 根据权利要求3所述的一种醋酸杆菌的培养分离方法，其特征在于，所述的基础培养 基的制备方法包括以下步骤:取相同质量的酵母膏和葡萄糖，加热溶解于水中，调节pH至 4.5，定容11^，分装后121°(：灭菌20分钟； 所述分离培养基的制备方法包括以下步骤：取l〇〇ml所述基础培养基加入琼脂， 0.1 MPa、121°C条件下灭菌，然后加入无菌Ca⑶3和无水乙醇，分别装于无菌培养皿中，制成 分离培养基;所述琼脂占所述分离培养基的体积百分数为2%，所述无菌CaC0 3占所述分离 培养基的体积百分数为2%，所述无水乙醇占所述分离培养基的体积百分数为3% ; 所述斜面保藏培养基的制备方法包括以下步骤:取上述制备的基础培养基加入琼脂， 于0.1 MPa、121°C条件下灭菌，灭菌后加入无菌CaC03和无水乙醇得到斜面保藏培养基。6. -种权利要求1所述的醋酸杆菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤一:醋酸杆菌菌株的培养分离:取混合果蔬或粮食中自然发酵醋的醋醅样品，放于 盛有基础培养基的容器中，振荡培养后，取稀释后的增殖液，用涂布法将醋醅样品接种于分 离培养基上进行培养，培养结束后挑选有透明圈的单菌落转接至斜面保藏培养基，保存得 到醋酸杆菌； 步骤二:醋酸杆菌的筛选:将步骤一得到的醋酸杆菌转接于基本培养基中，振荡培养后 得到醋酸杆菌菌株种子液，将制得的醋酸杆菌菌株种子液分别接种于含有体积百分数为 0 %、5 %、9 %、11 %、13 %、15 %的酒精的基础培养基中，摇床培养，然后测定0D值和产酸量， 根据测定结果筛选醋酸杆菌。7. 根据权利要求6所述的一种醋酸杆菌的筛选方法，其特征在于，所述步骤一中，所述 振荡培养的条件为在转速120r/min，调节温度30°C振荡培养48h;所述增殖液用无菌水分别 稀释100000倍、1000000倍、10000000倍，取各稀释浓度增殖液采用涂布法将醋醅样品接种 于分离培养基上进行培养上，30°C培养72h后培养结束。8. 根据权利要求6所述的一种醋酸杆菌的筛选方法，其特征在于，所述步骤一中，所述 的基础培养基的制备方法包括以下步骤:取相同质量的酵母膏和葡萄糖，加热溶解于水中， 调节pH至4.5,定容1L，分装后121°C灭菌20分钟； 所述分离培养基的制备方法包括以下步骤：取l〇〇ml所述基础培养基加入琼脂， 0.1 MPa、121°C条件下灭菌，然后加入无菌Ca⑶3和无水乙醇，分别装于无菌培养皿中，制成 分离培养基;所述琼脂占所述分离培养基的体积百分数为2%，所述无菌CaC03占所述分离 培养基的体积百分数为2%，所述无水乙醇占所述分离培养基的体积百分数为3% ; 所述斜面保藏培养基的制备方法包括以下步骤:取上述制备的基础培养基加入琼脂， 于0.1 MPa、121°C条件下灭菌，灭菌后加入无菌CaC03和无水乙醇得到斜面保藏培养基。9. 根据权利要求6所述的一种醋酸杆菌的筛选方法，其特征在于，所述步骤二中，所述 振荡培养条件为30°C、200r/min、振荡培养24h;所述摇床培养条件为30°C、200~220r/min、 摇床培养48h;所述测定0D值的方法为，用分光光度计在波长为600nm时测定吸光度，计算0D 值。10. -种权利要求1所述的醋酸杆菌的应用，其特征在于，所述的醋酸杆菌用于果蔬汁、 粮食混合酒精发酵后的醋酸发酵。
【文档编号】C12N1/02GK106010996SQ201610278213
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】周礼红, 岳倩倩, 黄依蓝
【申请人】周礼红