专利名称：一种<sup>13</sup>C稳定性同位素标记纤维素的制备方法
技术领域：
本发明涉及稳定性同位素标记化合物生产领域，尤其涉及采用微生物发酵制备13c 稳定性同位素标记纤维素高分子聚合物的方法。
背景技术：
自然界的纤维素绝大部分是由植物产生的，少数微生物也能合成纤维素，微生物 合成的纤维素与天然纤维素结构非常相似，都是由葡萄糖以0-1，4_糖苷键连接而成的 高分子化合物。能够合成纤维素的微生物种类很多，主要有醋酸杆菌属(AcetobacteR)、 产碱菌属(Alcaligenes)、八叠球菌属(Sarcina)、根瘤菌属(Rhizobium)、假单胞菌属 (Pseudomonas)、固氮菌属(Azotobacter)和气杆菌属(Aerobacter)。其中比较典型的是醋 酸杆菌属中的木醋杆菌(Acetobacter xylinus)，它具有很高的纤维素生产能力。通常采用化学方法合成稳定性同位素标记的化合物，利用生物法合成稳定性同位 素标记化合物的报道较少，中国专利公开了一种利用生物发酵法合成15N稳定性同位素标 记精氨酸(CN 1869244A)、15N标记亮氨酸(CN 101235402A)的方法等。但是，还未见有利用 微生物发酵合成并有效制备13C稳定性同位素标记纤维素的专利报道。利用微生物合成13C 稳定性同位素标记纤维素，13c容易标记且丰度高，工艺简单，制备方便。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用微生物发酵合成并制备13C稳定性同位素标记纤维 素的方法。本发明所述的13C稳定性同位素标记纤维素的生产制备方法如下(1)选用菌株选取适用发酵生产细菌纤维素的醋酸杆菌属，以木醋杆菌(Acetobacter xylinus)为代表。(2)发酵培养基以13C6葡萄糖为唯一碳源的M9基本培养基，其配方为磷酸氢二钠5.0 7.0g/l， 磷酸二氢钾 2. 0 4. 0g/l，氯化钠 0. 5 1. 0g/l，氯化铵 1. 0 2. 0g/l，MgS04 '7H20 0. 4 0. 5g/l, CaCl2 2H2010 15mg/l，13C6 葡萄糖 10 30g/l。⑶静置培养取1环活化好的斜面种子接入液体活化培养基，30°C振荡培养24 36h，摇床转速 为160rpm，作为预培养的种子。静置培养前的预培养将上述种子接种13C6葡萄糖-M9液体培养基，接种量6 8%，28°C 30°C振荡培养24 36h，摇床转速为160 180rpm，作为静置培养的种子。静置培养将13C6葡萄糖-M9液体培养基活化的种子，接种13C6葡萄糖-M9液体培 养基，接种量6 8%，28°C 30°C静置培养30d左右。静置培养采用浅层培养的方法，95mm 直径的灭菌扁烧杯盛有50 80ml 13C6葡萄糖-M9液体培养基，可换气的培养用膜封口。
⑷分离提纯将静置培养获得的13C稳定性同位素标记纤维素置于已预热至60°C 80°C的蒸馏 水中，60°C 80°C振荡洗涤20min 30min，摇床转速为150 250rpm ；取出13C稳定性同 位素标记纤维素并置于已预热至60°C 80°C的lmol/1的NaOH溶液中，60°C 80°C振荡洗 涤20min 30min，摇床转速为150 250rpm ；取出13C稳定性同位素标记纤维素并置于已 预热至60°C 80°C的lmol/1的HAC溶液中，60°C 80V振荡洗洚20min 30min，摇床转 速为150 250rpm，重复三次；最后用双蒸水冲洗13C稳定性同位素标记纤维素，冷冻真空 干燥获得产品。所述步骤(3)斜面培养基的配方为蛋白胨10g/l，酵母抽提物7. 5g/l，磷酸氢二 钠 10g/l，葡萄糖 20g/l，琼脂粉 15g/l，HAC 调 pH 6.0。所述液体活化培养基的配方为蛋白胨10g/l，酵母抽提物7.5g/l，磷酸氢二钠 10g/l，葡萄糖 20g/l，HAC 调 pH 6.0。
具体实施例方式以下将结合具体实施例，对本发明作进一步说明，目的在于帮助读者更好地理解 本发明的精神实质，但不作为对本发明实施范围的限定。实施例1 使用木醋杆菌(Acetobacter xylinus)为出发菌株，使用的培养基包括斜面培养 基、液体活化培养基、13C6葡萄糖-M9液体培养基。各培养基的配方如下 斜面培养基蛋白胨10g/l，酵母抽提物7. 5g/l，磷酸氢二钠10g/l，葡萄糖20g/l， 琼脂粉 15g/l，HAC 调 pH 6.0。液体活化培养基蛋白胨10g/l，酵母抽提物7. 5g/l，磷酸氢二钠10g/l，葡萄糖 20g/l，HAC 调 pH 6.0。13C6葡萄糖-M9培养基磷酸氢二钠6. 8g/l，磷酸二氢钾3. Og/1，氯化钠0. 5g/l， 氯化铵 1. Og/1, MgS04 7H20 0. 4 0. 5g/l，CaCl2 2H20 10 15mg/l，13C6 葡萄糖 20g/l。取1环活化好的斜面种子接入液体活化培养基，30°C振荡培养24 36h，摇床转速 为160rpm，作为预培养的种子。将上述种子接种13C6葡萄糖-M9液体培养基，接种量6%， 30°C振荡培养24 36h，摇床转速为160rpm，作为静置培养的种子。将13C6葡萄糖-M9液 体培养基活化的种子，接种13C6葡萄糖-M9液体培养基，接种量6%，30°C静置培养30d。静 置培养采用浅层培养的方法，95mm直径的灭菌扁烧杯盛有80ml 13C6葡萄糖-M9液体培养 基，可换气的培养用膜封口。培养过程中，当细菌纤维素膜厚度达5mm左右时，适度摇动培 养基，使细菌纤维素膜微浸入液体培养基中，继续静置培养。将静置培养获得的13C稳定性同位素标记纤维素置于已预热至70°C的蒸馏水中， 70°C振荡洗涤20min，摇床转速为160rpm ；取出13C稳定性同位素标记纤维素并置于已预热 至70°C的lmol/1的NaOH溶液中，70°C振荡洗涤20min，摇床转速为160rpm ；取出13C稳定 性同位素标记纤维素并置于已预热至70°C的lmol/1的HAC溶液中，70°C振荡洗涤20min， 摇床转速为160rpm，重复三次；最后用双蒸水冲洗13C稳定性同位素标记纤维素，冷冻真空 干燥获得产品。经同位素比率质谱仪分析得到的13C稳定性同位素标记纤维素产品，13C的 丰度达99%。
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实施例2 使用的菌种、培养基培养方式基本同实施例1。静置培养采用浅层培养的方法， 95mm直径的灭菌扁烧杯盛有50ml13C6葡萄糖-M9液体培养基，可换气的培养用膜封口。培 养过程中保持静置培养状态不变。将静置培养获得的13C稳定性同位素标记纤维素置于已 预热至80°C的蒸馏水中，80°C振荡洗涤30min，摇床转速为220rpm ；取出13C稳定性同位素 标记纤维素并置于已预热至80°C的lmol/1的NaOH溶液中，80°C振荡洗涤30min，摇床转速 为220rpm ；取出13C稳定性同位素标记纤维素并置于已预热至80°C的lmol/1的HAC溶液 中，80°C振荡洗涤30min，摇床转速为220rpm，重复三次；最后用双蒸水冲洗13C稳定性同位 素标记纤维素，冷冻真空干燥获得产品。经同位素比率质谱仪分析得到的13C稳定性同位素 标记纤维素产品，13C的丰度达99%。
权利要求
一种13C稳定性同位素标记纤维素的制备方法，其特征在于，利用微生物发酵合成并制备13C稳定性同位素标记纤维素的方法。
2.权利要求1所述的13C稳定性同位素标记纤维素的制备方法，其特征在于，使用的微 生物为醋酸杆菌属，木醋杆菌(Acetobacter xylinus)及突变菌株，使用菌株为常规菌种， 各菌种保藏中心均有保藏。
3.权利要求1所述的13C稳定性同位素标记纤维素的制备方法，其特征在于，发酵培养 基配方，13C6葡萄糖-M9培养基磷酸氢二钠5. 0 7. Og/1，磷酸二氢钾2. 0 4. Og/1，氯 化钠 0. 5 1. Og/1，氯化铵 1. 0 2. Og/1, MgS04 7H20 0. 4 0. 5g/l, CaCl2 2H20 10 15mg/l，13C6 葡萄糖 10 30g/l。
4.权利要求1所述的13C稳定性同位素标记纤维素的制备方法，其特征在于，28°C 30°C条件下静置培养30d，培养过程中，当细菌纤维素膜5mm左右厚时，适度摇动培养基，使 细菌纤维素膜微浸入液体培养基。静置培养的种子需要经过13C6葡萄糖-M9液体培养基活 化预培养，培养温度28°C 30°C。
5.权利要求1所述的13C稳定性同位素标记纤维素的制备方法，其特征在于，60°C 80°C酸碱交替洗涤，每次作用20min 30min，摇床转速为150 250rpm。提纯的13C稳定 性同位素标记纤维素经冷冻干燥得到最终产品。
全文摘要
本发明公开一种13C稳定性同位素标记纤维素的制备方法，该方法包括以下步骤(1)选用细菌纤维素高产木醋杆菌为出发菌株；(2)13C6葡萄糖-M9培养基用作发酵培养基；(3)30℃左右静置培养30d；(4)80℃左右酸碱交替洗涤、分离提纯细菌纤维素，最后经冷冻干燥得到13C稳定性同位素标记纤维素。本发明工艺简单，设备要求不高，方便在实验室条件下制备13C高丰度的13C稳定性同位素标记纤维素产品。
文档编号C12P19/04GK101824445SQ20091007930
公开日2010年9月8日 申请日期2009年3月6日 优先权日2009年3月6日
发明者吕迪, 呼庆, 庄国强, 白志辉, 马安周 申请人:中国科学院生态环境研究中心