专利名称：促进组织工程皮肤脂质结构形成的培养液及其配制方法
技术领域：
本发明涉及一种组织工程皮肤研究中的生物试剂类，特别是涉及一种促进组织工程皮肤 脂质结构形成的培养液及其配制方法。
背景技术：
皮肤是人体最大的器官，它由三部分即表皮层、真皮层和皮下层构成。表皮层位于皮肤 的最外层，厚度介于0.06 0.8mm之间，其微结构由基底层、棘细胞层、颗粒细胞层和角质 层构成。角质层是角质形成细胞分化的最后产物，其组成中75% 80%为蛋白质，5% 15% 为脂类，由10 15层细胞构成厚度大约10pm的结构。角质层许多重要的生理功能与脂质结 构相关，能够有效阻挡外界毒性化合物对皮肤活性细胞的损伤，特别是对化妆品成分中潜在 可能产生的细胞毒性有着极为重要的屏障作用。
组织工程皮肤经历了从表皮替代物、真皮替代物到双层结构的组织工程皮肤替代物的阶 段，其基础研究和应用研究有了广泛的进步。应用研究涉及体内应用和体外应用，体内应用 集中在各种皮肤创伤的治疗，体外主要运用于化合物的毒性检测，如化合物的腐蚀性、剌激 性、光毒性、生殖毒性等的检测。体外毒性检测方面，欧洲替代方法验证中心(ECVAM)主导 的对各种动物替代方法进行的验证工作是一项系统工程，引起了世界范围的关注。以组织工 程皮肤为例，进行的化合物腐蚀性检测目前只有EpiDerm和EpiSkin两种产品通过验证，刺 激性检测目前有EpiSkin、 SkinEthic RHE和EpiDerm SIT通过了验证。通过验证的组织工程 皮肤产品数量之所以如此少，很大程度上是因为构建的组织工程皮肤的角质层成熟和分化后 脂质结构不完全甚至是缺乏所致。因为角质层成熟和分化的不完全，没有形成具有良好的脂 质结构，造成检测化合物对活性细胞产生的毒性与其本身体内产生毒性的数据不符，导致误 判率偏高，不能达到要求的预测精确度。
目前，市场上还没有商业化的促进组织工程皮肤脂质结构形成的培养液，现有实验室进 行的组织工程皮肤研究所使用的培养液在试剂稳定性、细胞培养效果和促进角质形成细胞分 化能力方面存在不足，而且使用过程操作繁琐。经检索，具有稳定性高、操作简便、细胞培 养效果和促进组织工程皮肤脂质结构形成能力优的培养液，至今尚未见公开资料。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定性高、操作简便、细胞培养效果和促进组织工程皮肤脂质 结构形成能力优的促进组织工程表皮脂质结构形成的培养液，以及其配制方法，和用其培养 角质形成细胞后得到的组织工程皮肤。
一种促进组织工程皮肤脂质结构形成的培养液，其组分及各组分的用量为 (1)基础培养液由以下体积百分比的物质混配而成
DMEM培养液 F12培养液
胎牛血清
(2)营养物质 氢化可的松 表皮细胞生长因子 异丙基肾上腺素 胰岛素 转铁蛋白 三碘甲状腺氨酸 腺嘌呤 维生素C 维甲酸
L-丝氨酸
L-肉毒碱
软脂酸
亚油酸
花生四烯酸
牛脑垂体提取物
牛血清白蛋白
氯化钙
两性霉素B
60 70% 20 25% 5 20%
0.4~0.5 pg/mL 5 15 ng/mL l 3xl(T6mol/L 5 15ng/rtiL 5 10 j^g/mL 2 6xlO-9mol/L 1 3xl0"4 mol/L 50 100 jag/mL 4 10 pg/mL 0.1 1 nmol/L 1 3xi(T2 mol/L 1 5x10-5 mol/L 15 35 (imol/L 5 25 jimol/L 5 10拜ol/L 10 50吗/mL 2 7xl(T5 mol/L 1 3 mmol/L 100 U/mL 100 mg/mL 1 4 mg/mL
5PH值调整为7.2 7.4。
本发明的培养液的配制方法，由以下步骤组成
(1) 将购买的商用DMEM和F12粉剂分别按照说明书的要求配制成溶液；
(2) 取步骤(1)配制的DMEM培养液、F12培养液和胎牛血清充分混合，使其体积百分比 分别为总体积的60 70%、 20 25%和5 20%，三者体积份数和为100%,制成基础培 养液；
(3) 将氢化可的松、表皮细胞生长因子、异丙基肾上腺素、胰岛素、 转铁蛋白、三碘甲状腺氨酸、腺嘌呤、维生素C、维甲酸、霍乱毒素、L-丝氨酸、 L-肉毒碱、软脂酸、亚油酸、花生四烯酸、牛脑垂体提取物、牛血清白蛋白、氯化钙、 青霉素、链霉素、两性霉素B按照所述用量添加到基础培养液中，调节PH值7.2 7.4;
(4) 将步骤(3)得到的溶液用0.2 pm滤器过滤、分装，即得所述培养液。 本发明所述的培养液可以广泛应用在制备组织工程皮肤中。
本发明还提供一种组织工程皮肤，在其制备过程中，采用所述的培养液对角质形成细胞 进行培养。
本发明具有以下优点 一是本发明培养液的稳定性强，保质期长达12个月左右，而现有 实验室配制的培养液一般只能现配现用，可以产业化工业化生产；二是本发明培养液促进组 织工程皮肤脂质结构形成的能力强，1周的培养时间可使角质形成细胞分化为明显的基底层、 棘细胞层、颗粒细胞层和角质层构成，形成约10 15个细胞厚度的层次，角质层也有8 10 个细胞厚度的层次，脂质检测发现胆固醇、神经酰胺和游离脂肪酸成分与天然皮肤在种类和 含量百分比上非常接近；三是本发明培养液配制方法简便，添加物均溶于液体，便于产品的
合成和规模生产。
利用本发明的培养液对角质形成细胞进行培养，制备出的组织工程皮肤，角质层成熟和 分化完全，形成了具有良好的脂质结构，在检测化合物对活性细胞产生的毒性时，可以达到 基本与皮肤本身体内产生毒性的数据相符，可达到要求的预测精确度。
具体实施例方式
为进一歩说明本发明，结合以下实施例具体阐述 一、培养液的配制 其组分及各组分的用量为 (1)基础培养液由以下体积百分比的物质混配而成DMEM培养液 65%
F12培养液 25%
胎牛血清 10% (2)营养物质-
氢化可的松 0.4 0.5 pg/mL
表皮细胞生长因子 5 15ng/mL
异丙基肾上腺素 l 3xl0—6mol/L
胰岛素 5 15pg/mL
转铁蛋白 5 10pg/mL
三碘甲状腺氨酸 2 6xlO—9mol/L
腺嘌呤 1 3xl()4mol/L
维生素C 50 100pg/mL
维甲酸 4 10ng/mL
霍乱毒素 0.1 1 nmol/L
L-丝氨酸 l 3xl(T2mol/L
L-肉毒碱 l 5xl0-5mol/L
软脂酸 15 35pmol/L
亚油酸 5 25 nmol/L
花生四烯酸 5 10pmol/L
牛脑垂体提取物 10 50 pg/mL
牛血清白蛋白 2 7xl(T5mol/L
氯化f丐 l 3mmol/L
青霉素 100U/mL
链霉素 100mg/mL
两性霉素B l 4mg/mL
PH值调整为7.2 7.4。 其配制方法为-
(1) 将购买的商用DMEM和F12粉剂分别按照说明书的要求配制成溶液；
(2) 取歩骤(1)配制的DMEM培养液、F12培养液和胎牛血清充分混合，三者体积份数和 为100%,其中三者的体积百分比分别可在60 70%、 20 25%和5 20%范围内自由选择，制成基础培养液；
(3) 将氢化可的松、表皮细胞生长因子、异丙基肾上腺素、胰岛素、转铁蛋白、三碘甲状腺氨酸、腺嘌呤、维生素C、维甲酸、霍乱毒素、L-丝氨酸、L-肉毒碱、软脂酸、亚油酸、花生四烯酸、牛脑垂体提取物、牛血清白蛋白、氯化钙、青霉素、链霉素、两性霉素B按照所述用量添加到基础培养液中，调节PH值7.2 7.45
(4) 将步骤(3)得到的溶液用0.2 滤器过滤、分装，即得所述培养液。
二、 培养并得到组织工程皮肤角质形成细胞和其他皮肤细胞与生物材料支架复合后，用此培养液进行培养，经历液下和气液面培养一定周期，液下培养3 7d，接着气液面培养7 14d，即得组织工程皮肤。
三、 此组织工程皮肤的脂质检测结果薄层色谱和质谱对组织工程皮肤脂质结构的检测显示胆固醇、神经酰胺和自由脂肪酸种类和含量与天然皮肤非常接近。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
权利要求
1. 一种促进组织工程皮肤脂质结构形成的培养液，其特征在于其组分及各组分的用量为(1)基础培养液由以下体积百分比的物质混配而成DMEM培养液60～70％F12培养液 20～25％胎牛血清 5～20％(2)营养物质氢化可的松0.4～0.5μg/mL表皮细胞生长因子 5～15ng/mL异丙基肾上腺素1～3×10-6mol/L胰岛素5～15μg/mL转铁蛋白 5～10μg/mL三碘甲状腺氨酸2～6×10-9mol/L腺嘌呤1～3×10-4mol/L维生素C 50～100μg/mL维甲酸4～10μg/mL霍乱毒素 0.1～1nmol/LL-丝氨酸 1～3×10-2mol/LL-肉毒碱 1～5×10-5mol/L软脂酸15～35μmol/L亚油酸5～25μmol/L花生四烯酸5～10μmol/L牛脑垂体提取物10～50μg/mL牛血清白蛋白 2～7×10-5mol/L氯化钙1～3mmol/L青霉素100U/mL链霉素100mg/mL两性霉素B 1～4mg/mLPH值调整为7. 2～7.4。
2. 权利要求1所述的培养液的配制方法，其特征在于由以下步骤组成(1) 将购买的商用DMEM和F12粉剂分别按照说明书的要求配制成溶液；(2) 取步骤(1)配制的DMEM培养液、F12培养液和胎牛血清充分混合，使其体积百分比 分别为总体积的60 70%、 20 25%和5 20%，三者体积份数和为100%，制成基础培 养液；(3) 将氢化可的松、表皮细胞生长因子、异丙基肾上腺素、胰岛素、 转铁蛋白、三碘甲状腺氨酸、腺嘌呤、维生素C、维甲酸、霍乱毒素、L-丝氨酸、 L-肉毒碱、软脂酸、亚油酸、花生四烯酸、牛脑垂体提取物、牛血清白蛋白、氯化钙、 青霉素、链霉素、两性霉素B按照所述用量添加到基础培养液中，调节？11值7.2 7.4;(4) 将步骤(3)得到的溶液用0.2 pm滤器过滤、分装，即得所述培养液。
3. 权利要求1所述的培养液在制备组织工程皮肤中的应用。
4. 一种组织工程皮肤，其特征在于所述组织工程皮肤在制备过程中，采用权利要求l所述 的培养液对角质形成细胞进行培养。
全文摘要
一种促进组织工程皮肤脂质结构形成的培养液，其在基础培养液中添加氢化可的松、表皮细胞生长因子、异丙基肾上腺素、胰岛素、转铁蛋白、三碘甲状腺氨酸、腺嘌呤、维生素C、维甲酸、霍乱毒素、L-丝氨酸、L-肉毒碱、软脂酸、亚油酸、花生四烯酸、牛脑垂体提取物、牛血清白蛋白、氯化钙、青霉素、链霉素、两性霉素B等，用此培养液对角质形成细胞进行培养，得到角质层成熟和分化完全、具有良好的脂质结构的组织工程皮肤；此培养液稳定性强，保质期长达12个月左右，配制方法简便，便于产品的合成和规模生产。
文档编号C12N5/071GK101486994SQ20091007830
公开日2009年7月22日 申请日期2009年2月24日 优先权日2009年2月24日
发明者王军兵, 艳 程, 董益阳, 邹运动 申请人:中国检验检疫科学研究院