靶向修饰的纳米金棒靶向药物递释复合物及其抗肿瘤光热治疗应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及靶向修饰的纳米金棒靶向药物递释复合物及其抗肿瘤光热治疗应用，所述的递释复合物以温敏高分子K3、温敏高分子09JA、卵磷脂、Mal-PEG-DSPE形成类似细胞膜结构的双层脂质体结构，将药物和纳米金棒包裹进脂质体中，并在脂质体表面修饰靶向分子。本发明还提供该递释复合物的制备方法和应用。其优点表现在：利用纳米金棒光热特性、温敏脂质体独特的理化性质，能有效控制释放阿霉素等药物；借助抗原抗体特异结合效应，使载药纳米粒子靶向肿瘤(如乳腺癌)细胞；所述的纳米载药体系与游离药物相比具有更长的半衰期，具有明显的光热抑瘤作用，能显著提高药物的生物利用率。
【专利说明】靶向修饰的纳米金棒靶向药物递释复合物及其抗肿瘤光热治疗应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物【技术领域】，具体地说，是靶向修饰的纳米金棒靶向药物递释复合物及其抗肿瘤光热治疗应用。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤(癌症)是严重威胁人类健康的第二大疾病，其治愈率低并且死亡率高，据世界卫生组织全球癌症报告显示，在2008年近1200万癌症患者中有760万死亡，癌症导致的死亡在全球占总死亡人数的13%左右。我国癌症发生率目前正处于快速上升期，在我国，每年癌症发病人数约260万，死亡近180万人。病毒感染(EB病毒，乙肝病毒和人乳头状瘤病毒)、细菌感染(幽门螺杆菌)、致癌物质、紫外线辐射(UV)和基因突变等原因都可能会引发癌症。在中国，乳腺癌作为目前的高发癌症，是发生在乳房腺上皮组织并且严重影响甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。目前临床上多采用的常规治疗方法如放疗、化疗和手术治疗虽然在很大程度上缓解了病痛，但这些方法均存在很大的局限性，并且晚期转移率闻，愈后多不佳，其疗效难以进一步提闻。因此，新的治疗方法成为了临床癌症防治面临的重要课题。
[0003]近十几年，利用功能纳米载体负载化疗药物，在减少药物对非靶点部位毒副作用的同时，尽可能降低药物治疗剂量以及减少给药次数，从而提高药物疗效，为肿瘤临床治疗带来新的希望。与传统的药物载体相比，纳米药物载体具有以下几个优点:体内稳定，无免疫原性，可以实现药物或基因的可控释放，有效延长作用时间，提高、维持药物浓度，提高生物利用度。
[0004]纳米金棒(Gold nanorods, GNRs)具有良好的光学特性,在很窄的光谱带宽下具有更高的等离子体共振强度，在肿瘤光热治疗方面比其他金属材料有着更强的光热转化优势。
[0005]研究结果显示，纳米金棒自身具有很强的光热转化效应(在特定激光波长刺激下温度在较短的时间内可以迅速升高5-10°C )，并且不同长径比的纳米金棒其光热效应也有不同(光热效应的主要原因是纳米金棒在特定波长的激光照射下会因为偏振作用把光能转化为热能)，同时本研究还发现纳米金棒自身具有对肿瘤细胞的选择性杀伤作用(对肿瘤细胞的杀伤强度相比较对普通细胞杀伤强度高约15% )。在传统的临床药物化疗中，如何降低药物的毒副作用并提高载体的载药量及瘤内富集是我们现在急需解决的难题，因此我们合成并制备纳米金棒与化疗药物结合的复合载体。运用我们合成的温敏高分子将纳米金棒和化疗药物进行包裹，在特定的激发波长刺激下纳米金棒将光能转化为热能，温度的升高使温敏高分子从亲水性向疏水性转变，其形态逐渐塌缩，从而将包裹金纳米棒温敏脂质体内的阿霉素释放。在此基础之上我们还对纳米金棒联合药物的复合载体进行了表面修饰，在其表面连接巯基化修饰的HER-2抗体用来针对性的靶向具有高表达HER-2抗原的肿瘤细胞，从而增强了纳米金棒药物复合载体的肿瘤细胞的针对靶向性进一步的减少药物对正常组织的毒副作用。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种光热抑瘤靶向药物递释复合物。
[0007]本发明的再一的目的是，提供一种光热抑瘤靶向药物递释复合物的制备方法。
[0008]本发明的另一的目的是，提供一种光热抑瘤靶向药物递释复合物的应用。
[0009]为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:一种光热抑瘤靶向药物递释复合物，所述的递释复合物由温敏高分子、卵磷脂和桥联剂形成类似细胞膜结构的双层脂质体结构，将药物和纳米金棒包裹进所述的脂质体中，并在所述的脂质体表面修饰靶向分子。
[0010]所述的脂质体是以温敏高分子K3、温敏高分子09JA、卵磷脂、Mal-PEG-DSPE形成类似细胞膜结构的双层脂质体。所述的卵磷脂是卵磷脂PC。
[0011]所述的革巴向分子是单克隆抗体ant1-Her2-Fab。
[0012]所述的递释复合物是如下方法制备的:温敏高分子K3、温敏高分子09JA、卵磷脂和Mal-PEG-DSPE通过旋蒸的方法制成膜，将纳米金棒与阿霉素的共混液对旋蒸成膜的脂质高分子结合膜进行重悬，形成包裹纳米金棒和阿霉素的载体复合物；通过脂质体表面的马来酸酐基团链接巯基化的靶向分子。
[0013]所述的递释复合物是如下方法制备得到的:取温敏高分子K3、高分子09JA、卵磷脂和Mal-PEG-DSPE分别溶于体积比为1:1的甲醇:氯仿溶液中，溶液共混并放入旋蒸瓶中充入队进行旋蒸，转速为50r/min，旋转蒸发成膜；利用阿霉素与纳米金棒共混的水溶液对薄膜进行洗脱，洗脱物利用3500单位的透析膜进行透析；透析后的溶液与巯基化好的ant1-Her-Fab 进行连接，ant1-Her2-Fab:Mal-PEG-DSPE 摩尔比为 1:10。
[0014]为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是:一种光热抑瘤靶向药物递释复合物的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤:取温敏高分子K3、高分子09JA、卵磷脂和Mal-PEG-DSPE分别溶于体积比为1:1的甲醇:氯仿溶液中，溶液共混并放入旋蒸瓶中充入队进行旋蒸，转速为50r/min，旋转蒸发成膜；利用阿霉素与纳米金棒共混的水溶液对薄膜进行洗脱，洗脱物利用3500单位的透析膜进行透析；透析后的溶液与巯基化好的ant1-Her-Fab 进行连接，ant1-Her2-Fab:Mal-PEG-DSPE 摩尔比为 1:10。
[0015]为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是:所述的递释复合物在制备治疗癌症的药物中的应用。
[0016]所述的癌症是乳腺癌。
[0017]本发明优点在于:
[0018]本发明利用纳米金棒(Gold nanorods, GNRs)的光学快速温度响应这独特的物理和化学性质，将纳米金棒和疏水化疗药物阿霉素等(DOX)包裹进温敏脂质体内，在特定的激发波长刺激下纳米金棒将光能转化为热能，温度的升高使温敏高分子从亲水性向疏水性转变，其形态逐渐塌缩，从而将包裹金纳米棒温敏脂质体内的阿霉素释放，在其表面连接巯基化修饰的抗体等靶向分子用来针对性的靶向具有高表达抗原的肿瘤细胞，从而增强了纳米金棒药物复合载体的肿瘤细胞针对靶向性，进一步的减少药物对正常组织的毒副作用。结果发现双靶向纳米金棒药物复合载体具有明显光热抑瘤作用，对临床抗肿瘤治疗提供有益的参考。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]附图1是动态激光散射仪测纳米金棒的粒径。
[0020]附图2是透射电子显微镜下观察纳米金棒的表观性状。
[0021]附图3是双靶向纳米金棒复合载体的构建示意图。
[0022]附图4是双靶向纳米金棒复合载体的粒径检测。
[0023]附图5是双靶向纳米金棒复合载体TEM形态测定。
[0024]附图6是双靶向纳米金棒复合载体的细胞毒性检测。
[0025]附图7是倒置荧光显微镜观察双靶向纳米金棒载体细胞内吞。
[0026]附图8是MCF-7人乳腺癌细胞荷瘤裸鼠药物注射肿瘤体积测量结果。
【具体实施方式】
[0027]下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0028]本发明的目的在于提供一种抗体靶向修饰的乳腺癌靶向药物递释复合物以及其制备方法，并对其抑制肿瘤效果进行了研究。
[0029]本发明以温敏高分子K3与09JA，卵磷脂，Mal-PEG-DSPE为基本材料，制备出一种能够携带水溶性药物阿霉素和纳米金棒的靶向载药体系。
[0030]本发明制备的靶向纳米载体体系具有如下特点:
[0031](I)该载体以温敏高分子K3与09JA，卵磷脂，Mal-PEG-DSPE为基本材料形成类似细胞膜结构的双层脂质体结构，借助脂质体中亲水成分与水溶性药物之间的相互作用，将药物、纳米金棒包裹进脂质体中，形成纳米尺寸的载药体系；
[0032](2)通过纳米载体表面的活性基团,将单克隆抗体ant1-Her2_Fab连接到纳米载体表面，借助抗原抗体特异结合效应，使载药纳米粒子祀向乳腺癌细胞；所述的纳米载药体系与游离药物相比具有更长的半衰期，能显著提高药物的生物利用率。
[0033]温敏高分子K3、温敏高分子09JA的制备方法请参照:Li W，Zhao H., Qian W，etal.Chemotherapy for gastric cancer by finely tailoring ant1-Her2 anchored dualtargeting immunomi cel I es B1materials, 2012, 33:5349.Mal-PEG-DSPE 即桥联剂马来酸亚胺化聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。
[0034]实施例1
[0035]种子液的配置:用MilliQ-water配制0.2M的CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)溶液5ml，配制0.0005M的HAuCl4溶液5ml。将上述的CTAB溶液加入HAuCl4溶液中，并缓慢搅拌。配制0.0lM冰的NaBH4溶液0.6ml,MilliQ-water配制。将配置好的NaBH4溶液缓慢加入HAuCl4溶液中，发现HAuCl4溶液逐渐变色。在室温的条件下放置于磁力搅拌器剧烈搅拌2min，搅拌完成后于25°C保存，种子液的颜色变为茶色。生长液的配置:配制好的5ml的0.2M的CTAB，将其加入0.15ml的0.004M AgNO3溶液中(25°C条件之下)。配制0.001M的HAuCl4溶液5ml，在配制好的生长液中加入上述配制好的HAuCl4溶液。缓慢搅拌后加入75μ L的0.0788Μ的抗坏血酸(MilliQ-water配制)。再向上述溶液中加入12 μ L的金种子液(在27-30°C )并缓慢搅拌。溶液颜色逐渐改变，无色变为紫红色为正常，在室温下缓慢搅拌10-20h后对其进行测定，得到纳米金棒。取出制备好的纳米金棒样品离心机SOOOr/min离心5min后用MilliQ-water通过润旋仪润旋对其进行重悬,重悬过后的纳米金棒溶液用液氮进行冷冻结冰。冻干机进行设定，冻干温度为_50°C，提前对冻干机进行预冷。对冷冻结冰后的纳米金棒溶液放入事先预冷过的冻干机内进行冻干，取出冻干瓶内的冻干过后的纳米金棒粉末进行称量。用MilliQ-water对纳米金棒粉末进行重新进行定容,标定其浓度为0.6mg/ml。对定容好的纳米金棒溶液用0.45 μ m的Millipore滤器进行过滤,对过滤好的纳米金棒样品进行测量，测量条件为:90°散射角，25°C。
[0036]实施例2
[0037]取对原溶液稀释20倍后的纳米金棒样品溶液在铜网上进行滴加(漫过铜网并形成小液滴)，将已经滴加样品过后的铜网放入通风橱中进行干燥，对处理过后的样品进行观测分析。
[0038]实施例3
[0039]称取高分子K3与高分子09JA各0.5mg并溶于甲醇:氯仿=1:1的溶液中，使其总体积为2ml。称取Mal-PEG-DSPE 0.25mg并溶于甲醇:氯仿=1:1的溶液中，使其体积为
0.5ml。称取卵磷脂PC 2mg并溶于甲醇:氯仿=1:1的溶液中，使其总体积为2ml。将此三种配制好的溶液共混并放入50ml旋蒸瓶中充入N2进行旋蒸(转速为50r/min),旋转蒸发待溶液在旋蒸瓶底部形成薄膜后取出。配制2mg/ml DOX溶液(溶剂为pbs溶液)与Img/ml的纳米金棒(编号150)溶液进行共混。取DOX与纳米金棒共混液3ml对旋蒸成膜后的旋蒸瓶进行洗脱(注意避光)。洗脱后的的溶液避光进行透析，透析膜为美国SPECTRUM公司3500单位的透析膜,析液为MilliQ-water。取透析后的溶液与巯基化好的ant1-Her_Fab进行连接(ant1-Her2-Fab = Mal-PEG-DSPE摩尔比为1:10)，此组作为靶向组；另外将一部分透析后的溶液与巯基化的BSA进行连接，设置为非靶向组。室温下孵育2h(摇床轻微摇晃)。将联接好的溶液进行透析，透析膜为100KD，在pbs溶液中于4°C。
[0040]实施例4
[0041]取出已经制备好的双靶向纳米金棒复合载体样品用液氮进行冷冻结冰。冻干机进行设定，冻干温度为_50°C，提前对冻干机进行预冷。把冷冻结冰后的双靶向纳米金棒复合载体样品放入事先预冷过的冻干机内进行冻干。取出冻干瓶内的冻干过后的双靶向纳米金棒复合载体样品的粉末进行称量。用MilliQ-water对双祀向纳米金棒复合载体样品的粉末进行重新进行定容，标定其浓度为0.5mg/mL.对定容好的纳米金棒溶液用0.45 μ m的Millipore滤器进行过滤。对过滤好的纳米金棒样品进行测量，测量条件为:90°散射角，25。。。
[0042]实施例5
[0043]取对双靶向纳米金棒复合载体的溶液稀释20倍后的放于铜网上进行滴加(溶液在铜网之上形成小液滴)。对滴加过后样品的铜网进行染色，染色剂为磷钨酸(Sodiumphosphotungstate)。将已经滴加样品过后的铜网放入通风橱中进行干燥。对处理过后的样品进行观测分析。
[0044]实施例6
[0045]细胞铺板:将处于对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7细胞用胰酶进行消化、离心后再进行计数，在24孔板中每孔用移液枪接种1.0X 15细胞,细胞悬液的体积为200 μ L用10% FCS的细胞培养液配制，放置于7%的C02，37°C的细胞培养箱中，过夜培养12h。分别取包裹阿霉素的祀向纳米金棒载体(d-AuNR-Fab)、包裹阿霉素的单祀向纳米金棒载体(d-AuNR-BSA)加入细胞孔中(其中低浓度组纳米金棒浓度0.5mg/ml阿霉素浓度5 μ g/ml高浓度组纳米金棒浓度lmg/ml阿霉素浓度10 μ g/ml)，与MCF-7细胞进行孵育，每个组分别在37°C和42°C孵育12h。将上述已经加入的24孔板分别用法国Venus公司的固定波段激光发射器进行激光照射(每孔照射时间为5min激光光斑为Icm2的激光光源与细胞平板间的距离为1cm,激光光源功率设定为500mW波长设定为808nm)。进行激光照射过后放入7%的C02，37°C的细胞培养箱中，进行12h过夜培养。对过夜培养的细胞板先用pbs溶液进行清洗I遍然后再用用培养基轻轻洗2遍过后,用Cell Counting Kit-8试剂盒来进行检测细胞生存率，检测条件为:CCK-8试剂每孔20 μ 1，37°C孵育2h。检测仪器条件为:450nm处用B1-TEK ELx800全自动酶标仪读出吸光度值。
[0046]实施例7
[0047]细胞铺板:取对数生长期的MCF-7细胞消化、离心后计数，在24孔板中铺细胞密度为2 X 15/孔，每孔加入500 μ I含血清培养液，周围一圈空白细胞孔每个均用500 μ I的PBS补足，放置在7% C02，37°C的细胞培养箱中过夜。分别取阿霉素、包裹阿霉素的靶向纳米金棒载体(d-AuNR-Fab)、包裹阿霉素的单祀向纳米金棒载体(d_AuNR-BSA)和载体阿霉素组(d-adr)加入细胞孔中，与N87细胞进行孵育，每个组分别在37°C和42°C孵育6h。孵育12h后，d-AuNR-Fab组和d-AuNR-BSA组分别用培养基轻轻洗2遍(注意细胞保持贴壁)，然后于倒置荧光显微镜下观察细胞内吞的情况。
[0048]实施例8
[0049]将接种了 MCF-7人乳腺癌细胞的Balb/c裸鼠进行随机分组，分组为5组，包括阿霉素对照组、Pbs溶液注射对照组、包裹阿霉素后的双靶向纳米金棒复合载体注射组、包裹阿霉素后的单靶向纳米金棒复合载体注射组、纳米金棒注射组。每组Balb/c裸鼠为5只，平均每只荷瘤的Balb/c裸鼠米次注射按照阿霉素的剂量为5mg/kg(包裹阿霉素后的双靶向纳米金棒复合载体注射组和包裹阿霉素后的单靶向纳米金棒复合载体注射组为乙腈打破后标定的量)，纳米金棒注射组浓度与包裹阿霉素后的双靶向纳米金棒复合载体注射组和包裹阿霉素后的单靶向纳米金棒复合载体注射组两组中所含纳米金棒浓度为统一标准，每次纳米金棒的注射剂量为2mg/kg。注射5次，平均每3天注射一次(防止单纯阿霉素注射组荷瘤裸鼠副作用导致裸鼠在未完成实验前死亡)。在第一天药物注射时开始记录并随时观察并记录每组接种了 MCF-7人乳腺癌细胞的荷瘤Balb/c裸鼠的生存情况，每2天测量器肿瘤大小并对其进行体重称量。
[0050]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种光热抑瘤靶向药物递释复合物，其特征在于，所述的递释复合物由温敏高分子、卵磷脂和桥联剂形成类似细胞膜结构的双层脂质体结构，将药物和纳米金棒包裹进所述的脂质体中，并在所述的脂质体表面修饰靶向分子。
2.根据权利要求1所述的递释复合物，其特征在于，所述的脂质体是以温敏高分子K3、温敏高分子09JA、卵磷脂、Mal-PEG-DSPE形成类似细胞膜结构的双层脂质体。
3.根据权利要求1所述的递释复合物，其特征在于，所述的药物是阿霉素。
4.根据权利要求1所述的递释复合物，其特征在于，所述的卵磷脂是卵磷脂PC。
5.根据权利要求1所述的递释复合物，其特征在于，所述的靶向分子是单克隆抗体ant1-Her2_Fab0
6.根据权利要求1所述的递释复合物，其特征在于，所述的递释复合物是如下方法制备得到的:温敏高分子K3、温敏高分子09JA、卵磷脂和Mal-PEG-DSPE通过旋蒸的方法制成膜，将纳米金棒与阿霉素的共混液对旋蒸成膜的脂质高分子结合膜进行重悬，形成包裹纳米金棒和阿霉素的载体复合物；通过脂质体表面的马来酸酐基团链接巯基化的靶向分子。
7.根据权利要求1所述的递释复合物，其特征在于，所述的递释复合物是如下方法制备得到的:取温敏高分子K3、高分子09JA、卵磷脂和Mal-PEG-DSPE分别溶于体积比为1:1的甲醇:氯仿溶液中，溶液共混并放入旋蒸瓶中充入队进行旋蒸，转速为50r/min，旋转蒸发成膜；利用阿霉素与纳米金棒共混的水溶液对薄膜进行洗脱，洗脱物利用3500单位的透析膜进行透析；透析后的溶液与巯基化好的ant1-Her-Fab进行连接，ant1-Her2-Fab:Mal-PEG-DSPE 摩尔比为 1:10。
8.根据权利要求1所述的递释复合物的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤:取温敏高分子K3、高分子09JA、卵磷脂和Mal-PEG-DSPE分别溶于体积比为1:1的甲醇:氯仿溶液中，溶液共混并放入旋蒸瓶中充入队进行旋蒸，转速为50r/min，旋转蒸发成膜；利用阿霉素与纳米金棒共混的水溶液对薄膜进行洗脱，洗脱物利用3500单位的透析膜进行透析；透析后的溶液与巯基化好的ant1-Her-Fab进行连接，ant1-Her2-Fab:Mal-PEG-DSPE 摩尔比为 1:10。
9.根据权利要求1-7任一所述的药物递释复合物在制备治疗癌症的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的癌症是乳腺癌。
【文档编号】A61K31/704GK104368000SQ201410696584
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月26日 优先权日:2014年11月26日
【发明者】李威, 顾申, 孙赟 申请人:中国人民解放军第二军医大学