一种基于新型纳米复合材料的蛋白质组样品预处理方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及蛋白质样品预处理方法，具体地说是一种基于聚乙二醇修饰的聚乙烯 亚胺偶联的纳米金修饰氧化石墨烯纳米复合物的制备及其在蛋白质样品预处理中的应用。
【背景技术】
[0002] 生物样品内蛋白质的组成极其复杂，而且动态范围比较宽，浓度差异大(丰度差异 大)，比如血楽样品中如10种_丰度蛋白质含量占到总蛋白质含量的90%，如22种蛋白质占 到99%，余下几千种蛋白却仅占到1%，高丰度蛋白质的存在会掩盖低丰度蛋白质，从而干扰 对低丰度蛋白质的鉴定，而这些低丰度蛋白质往往存在潜在的生物学意义，在疾病标志物 的发现与治疗方面可能会发挥重要生物功能aProteomeRes. ,2011，10, 516)。因此在蛋 白质样品分析过程中需要降低其中高丰度蛋白质的丰度差别，缩小这种差异以方便用现有 的检测技术检测到低丰度蛋白质成为蛋白质样品预处理的核心问题之一。
[0003]目前发展的去除高丰度蛋白质的技术方法主要包括染料配体法、超速离心过滤 法、免疫去除法及预分级技术。染料配体法是将汽巴蓝F3GA及其衍生物固定在聚甲基丙 烯酸缩水甘油酯颗粒表面，通过染料跟白蛋白的相互作用去除人血清白蛋白（Journalof ChromatographyB，2006, 832, 216-223)。该方法样品的处理量大，但特异性较差。超速离 心过滤法主要通过选择具有不同截留分子量的膜实现蛋白质的分离，并去除某些分子量较 大的高丰度蛋白质（Molecular&CellularProteomics, 2003, 2, 10961103)。然而高丰度 蛋白质并非都是大分子量的蛋白质，因此会存在对高丰度蛋白质去除不充分，而且可能会 同时去除高分子量的低丰度蛋白质等问题。与前两种去除方法相比，免疫去除法的特异 性很高（MolCellProteomics2008, 7, 1963-1973;JProteomeRes2010, 9, 4982-4991;J ProteomeRes. ,2007, 6, 947-954)。然而，该方法仍存在很多不足，如，低丰度蛋白质易与 部分高丰度蛋白质非特异性结合，产生共去除现象（Electrophoresis2010, 31，471-482) ;已发现的抗体种类少（20种）；处理样品的体积有限；去除后的样品被稀释；不同蛋白质 去除效率有一定差异性等。近期，人们还通过采用液相等电聚焦和多维液相色谱等方法 进行样品的预分级，有效地降低了样品的复杂程度（J.ProteomeRes.，2009, 8, 11431155; Electrophoresis, 2009, 30:249-261;Electrophoresis, 2010, 31, 35803585;J.Proteome Res. , 2009, 8, 11431155;J.ProteomeRes. , 2010, 9, 1902-1912)。但是液相等电聚焦方法只 能根据已有的等电点膜将样品按照有限的等电点区间进行分级。因此，高丰度蛋白质所在 级分仍存在对低丰度蛋白质的掩盖问题。而多维液相色谱方法不仅操作繁琐、运行时间长， 而且也难以避免去除高丰度蛋白质的同时造成低丰度蛋白质的共洗脱。
【发明内容】
[0004] 针对以上方法目前存在的不足，本发明提供一种简便高效的蛋白质样品处理方法 以降低蛋白质样品的复杂程度。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0006] 在不同pH条件的缓冲溶液中，采用聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺偶联的纳米金修 饰氧化石墨烯纳米复合物颗粒处理蛋白质组样品，以降低蛋白质组样品中高丰度蛋白质的 丰度，并同时实现蛋白质组样品复杂程度的降低。
[0007] 所述聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺偶联的纳米金修饰氧化石墨烯纳米复合物颗粒 的制备与蛋白质样品处理的具体步骤如下，
[0008] (1)样品处理方法中所述的材料聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺偶联的纳米金修饰氧 化石墨烯纳米复合物颗粒的制备：将氧化石墨烯分散于水中，超声使其分散均匀。加入与 氧化石墨烯质量比为10-1000倍的聚亚乙基亚胺（PEI)，室温震荡反应5min-70min后，加 入与聚亚乙基亚胺质量比为1/5-1/100的氯金酸（HAuC143H20)，震荡均匀，30-KKTC反应 5-90min。双蒸水反复洗涤后，离心并分散于lOOiiL水中。向200-500iiL上述颗粒中加入 25-100mgSH-PEG溶液，水溶液体系中反应2-24h，水洗涤即制得聚乙二醇修饰的聚乙烯亚 胺偶联的纳米金修饰氧化石墨烯纳米复合物颗粒。
[0009] (2)体液样品包括血液和尿液样品；组织样品包括动物组织样品如动物大脑、心 脏、肺、胃、肝脏等组织样品；细胞样品如Hela细胞样品、类淋巴母细胞等细胞株样品。
[0010] (3)蛋白质样品的处理：采用（1)制备的纳米复合物颗粒与蛋白质样品在pH值为 3-10的缓冲溶液中孵育0. 5-10h，孵育温度为1-40°C。
[0011] (4)蛋白质洗脱：将颗粒去除上清液后，采用与（2)中孵育溶液相同的缓冲液进行 洗涤，去除上清液，得到纳米复合材料与蛋白质的复合物。
[0012] (5)聚丙烯酰胺凝胶电泳分析（SDS-PAGE)
[0013] 向（3)中所述纳米复合材料与蛋白质的复合物中加入同等体积的SDS-PAGE上样 缓冲溶液，在沸水中煮沸后，将其加于凝胶孔道中。采用5%浓缩胶和12%的分离胶，在120V 恒压条件下进行分离。
[0014] (6)蛋白质酶解：将（3)中得到的纳米复合材料与蛋白质的复合物在50-KKTC的 溶液条件下加热变性，再分别进行胰酶酶解。具体过程如下：向变性后的复合物中加入二硫 苏糖醇反应1. 5h，实现蛋白质的还原过程，再加入碘乙酰胺溶液，避光条件下反应40min对 蛋白质进行烷基化，最后加入与蛋白质质量比为25:1-50:1的膜蛋白酶，37°C进行酶解反 应16h。离心后收集上清。
[0015] (7)二维液质联用分析与数据处理：将上述蛋白质酶解产物进行强阳离子交 换-反相液质联用（SCX-RP-LC-MS/MS)分析。质谱数据采用Mascot检索。
[0016] 本发明具有如下优点：
[0017] (1)本发明所采用的样品处理方法能够有效降低样品中高丰度蛋白质的丰度，降 低复杂样品的复杂程度；（2)制备的颗粒稳定，制备方法与样品处理结果重现