一种两性亲水复合纳米材料的糖肽富集与检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种两性亲水复合纳米材料的糖肽富集与检测方法，将两性亲水复合纳米材料与含有目标糖肽的溶液加入体积比为85：14.9：0.1的乙腈：水：三氟乙酸的溶液中，置于酶解仪中37 ℃下孵育0.5小时后，外加磁场进行磁性分离，用体积比为85：14.9：0.1的乙腈：水：三氟乙酸的溶液洗涤；加入体积比为30：69.9：0.1的乙腈：水：三氟乙酸的溶液进行洗脱，置于酶解仪中37 ℃下孵育0.5小时，外加磁场进行磁性分离；将洗脱液进行质谱分析。本发明方法实现了对糖肽的高灵敏、高选择性和高重复性的富集，并可应用于人血清中糖肽的富集，本发明方法简单、成本低廉、重复性好，具有实际应用价值和广阔的研究前景。
【专利说明】
一种两性亲水复合纳米材料的糖肽富集与检测方法
技术领域
[0001 ]本发明属于纳米材料及其相关的生物分析领域，具体涉及一种两性亲水复合纳米材料的糖肽富集与检测方法，该两性亲水复合纳米材料为磁性石墨稀表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料。
【背景技术】
[0002]作为最复杂的蛋白质翻译后修饰之一，糖基化修饰广泛存在于生物体内的蛋白质中，据估计，有50%的蛋白质会发生糖基化。蛋白质糖基化参与生命活动的许多过程，包括细胞间的相互作用、细胞粘附和分裂过程、分子识别、免疫防御、信号转导等。蛋白质糖基化与癌症和神经退行性疾病的发生密切相关，因此可以利用糖蛋白作为疾病诊断的生物标记物。因此建立一种方便的方法来探索蛋白质糖基化具有重要的意义。生物质谱以其软电离、快速高效、高灵敏度和高分辨率等特点，成为蛋白质研究中最重要的分析手段之一，有力促进了蛋白质组学的研究进展。但是由于糖肽本身丰度低、糖链结构复杂、糖基化位点的微观不均一性、糖肽的离子化效率很差以及非糖肽的信号压制效应导致直接利用质谱分析糖基化蛋白面临许多挑战。因此在质谱分析前对于复杂生物样品中的糖蛋白/糖肽进行选择性分离富集是成功鉴定糖蛋白/糖肽的前提。
[0003]近年来，许多方法被应用于在复杂的生物体系中选择性的分离和富集糖蛋白/糖肽，主要有凝集素亲和色谱法、硼酸化学法、肼化学法、亲水相互作用色谱法等。其中，亲水相互作用色谱法(HILIC)具有高选择性、高灵敏度、温和的反应条件、富集效率高、操作简单和成本低廉等特点，被广泛的应用于糖蛋白/糖肽中。HILIC法使用高浓度的有机相作为流动相，低浓度的有机相进行洗脱，通过和糖蛋白/糖肽的亲水相互作用对糖蛋白/糖肽进行分离和富集。许多HILIC法的固定相已经被应用于糖蛋白/糖肽的富集中，包括琼脂糖、麦芽糖、金属有机骨架和两性聚合物等。在众多HILIC法中，由于两性亲水相互作用色谱法(ZIC-HILIC)同时含有阳离子和阴离子的亲水基团，大大提高了亲水性，相比其他的固定相显示出了优越性。传统的两性亲水相互作用色谱法在样品处理时需要离心，耗时较长且易损失样品。相比离心过程，磁性纳米材料具备的超顺磁性可以达到快速分离、减小损失的效果，得到了越来越多的重视，被应用于糖蛋白/糖肽的富集。
[0004]结合两性亲水相互作用色谱和功能化磁性纳米材料的优点，本发明设计了一种两性亲水复合纳米材料的糖肽富集与检测方法，具体是基于磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料，并成功的应用于糖肽的富集和检测中。本方法具备众多优点，石墨稀提高了材料的比表面积，磁球负载在石墨稀表面达到快速的磁响应分离，聚多巴胺的存在使得纳米金球能够原位还原生成，半胱氨酸作为两性亲水物质大大提尚了未水性，从而实现对糖妝的尚灵敏和尚选择性富集。
【发明内容】
[0005]本发明目的在于提供一种两性亲水复合纳米材料的糖肽富集与检测方法。
[0006]本发明提出的一种两性亲水复合纳米材料的糖肽富集与检测方法，具体步骤为:将两性亲水复合纳米材料与含有目标糖肽的溶液加入体积比为85:14.9:0.1的乙腈:水:三氟乙酸的溶液中，置于酶解仪中37 °C下孵育0.5小时后，外加磁场进行磁性分离，用体积比为85:14.9:0.1的乙腈:水:三氟乙酸的溶液洗涤;加入体积比为30:69.9:0.1的乙腈:水:三氟乙酸的溶液进行洗脱，置于酶解仪中37 °C下孵育0.5小时，外加磁场进行磁性分离;将洗脱液进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析或者液相色谱质谱分析。
[0007]其中，所述的两性亲水复合纳米材料为磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料。
[0008]本发明中，进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析前进行前处理，具体步骤是取I yL洗脱液点在MALD1-TOF MS靶板上，干燥后在分析物上滴加I yL 25 mg/mL的2，5-二羟基苯甲酸(DHB)溶液，并干燥。
[0009]本发明中，液相色谱质谱分析前进行前处理，具体步骤是洗脱液送入冻干机中冻干后，加入浓度为25 mmol/L的碳酸氢铵溶液和I yL PNGase F酶，置于酶解仪中37 °(3下孵育12小时后，得到的酶解液送入冻干机中冻干。
[0010]本发明中，两性亲水复合纳米材料的具体制备步骤如下:
(1)将石墨烯加入浓硝酸溶液中，60°C下磁力搅拌7小时，超声分离，用水和乙醇充分洗涤至中性，50 °C下真空干燥，得到酸化石墨烯；
(2)六水合氯化铁溶于乙二醇中，加入步骤(I)所得的酸化石墨烯，超声I小时，加入柠檬酸三钠、醋酸钠和聚乙二醇，磁力搅拌0.5小时后，超声3分钟，移入反应釜中，200 °C下加热8-12小时，用磁铁分离，水和乙醇充分洗涤，50 1真空干燥，得到磁性石墨烯；
(3)以水为溶剂配置pH值8.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液，加入乙醇、去离子水和多巴胺盐酸盐形成混合溶液，将步骤(2)所得的磁性石墨烯加入混合溶液中，超声数分钟，室温下机械搅拌6小时，用磁铁分离，水和乙醇充分洗涤，50 °C下真空干燥，得到表面包覆多巴胺的磁性石墨烯；
(4)将步骤(3)所得的表面包覆多巴胺的磁性石墨烯分散在去离子水中，加入配置好的158.3mM的氯金酸溶液中，超声数秒钟，85 °C下机械搅拌0.5小时，加入I mol/L的柠檬酸三钠溶液，继续反应I小时，用磁铁分离，水和乙醇充分洗涤，50 1真空干燥，得到表面包覆多巴胺和纳米金球的磁性石墨烯；
(5)以去离子水为溶剂配置20mg/mL的半胱氨酸溶液，加入步骤(4)所得的表面包覆多巴胺和纳米金的磁性石墨烯，超声数秒，室温下振荡10-12小时，用磁铁分离，水和乙醇充分洗涤，50 1真空干燥，即得所述的两性亲水复合纳米材料。
[0011]本发明中，具体步骤(2)中柠檬酸三钠、醋酸钠和聚乙二醇的重量比为3:36:20。
[0012]本发明中，具体步骤(2)中六水合氯化铁和酸化石墨烯的重量比为8:3。
[0013]本发明中，具体步骤(3)中中磁性石墨烯和多巴胺盐酸盐的重量比为1:4。
[0014]本发明中，基于磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料可以应用于标准糖肽的富集，利用mald1-tof MS进行分析，也可应用于实际生物样品血清中糖肽富集和LC-MS鉴定。
[0015]本发明的有益效果在于:通过本发明制备的一种基于磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料具有大比表面积、快速的磁响应分离性质和很强的亲水性，对糖肽的富集展示了极好的亲水富集效果，可作为糖肽富集分离的亲水相互作用色谱材料。通过本发明制备的复合纳米材料对糖肽的富集具有优越的灵敏度、选择性和重复性，检测限可以达到0.1 fmol、对于非糖肽选择性可以达到1:100的质量比并且材料可以重复用于富集10次以上。同时，在应用于实际复杂生物体系中，本发明制备的材料可成功应用于人血清中糖肽的富集，鉴定得到31个糖蛋白中的40条糖肽。本发明制备的一种基于磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料合成方法简单、成本低廉，可以成功的应用于高灵敏和高选择性的富集标准糖蛋白中的糖肽，并成功的应用于鉴定复杂生物体系中的糖肽，具有实际应用价值和广阔的研究前景。
【附图说明】
[0016]图1实施例1中磁性石墨烯材料的电镜照片，其中，(a)磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球的复合纳米材料的扫描电子显微镜照片；(b)磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料的扫描电子显微镜照片；(C)磁性石墨烯表面包覆多巴胺的复合纳米材料的透射电子显微镜照片；(d)磁性石墨烯表面包覆纳米金球的复合纳米材料的透射电子显微镜照片；
图2实施例2中两性亲水复合纳米材料富集前后的质谱图，其中，(a)为125 fmol/yLHRP酶解液经磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料富集前的MALD1-TOF MS质谱图；(b)为125 fmol/yL HRP酶解液经磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料富集后的MALD1-TOF MS质谱图；(C)Ifmol/yL HRP酶解液经磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料的MALD1-TOF MS质谱图；(d)0.1 fmol/yL HRP酶解液经磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料的MALD1-TOF MS质谱图；
图3实施例3中两性亲水复合纳米材料富集前后的质谱图，其中(a)为质量比1:50的HRP和BSA混合酶解经磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料富集前的MALD1-TOF MS质谱图；(b)为质量比1:50的HRP和BSA混合酶解经磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料富集后的MALD1-TOF MS质谱图；(c)为质量比1:100的HRP和BSA混合酶解经磁性石墨稀表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料富集前的MALD1-TOF MS质谱图；(d)为质量比1:100的HRP和BSA混合酶解经磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料富集后的MALD1-TOF MS质谱图；
图4实施例4中两性亲水复合纳米材料富集125 fmol/yL HRP酶解液得到的MALD1-TOFMS质谱图；(a)第一次两性亲水复合纳米材料富集125 fmol/yL HRP酶解液得到的MALD1-TOF MS质谱图；(b)第五次两性亲水复合纳米材料富集125 fmol/yL HRP酶解液得到的MALD1-TOF MS质谱图；和(c)第十次用同一份磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料富集125 fmol/yL HRP酶解液得到的MALD1-TOF MS质谱图。
【具体实施方式】
[0017]下面的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
[0018]实施例1:磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料的合成
(1)将400mg石墨烯加入50 mL浓硝酸溶液中，60 °C下磁力搅拌7小时。反应完毕，超声分离，用水和乙醇反复洗涤直至变为中性。50 1真空干燥；
(2)400mg六水合氯化铁溶于40 mL乙二醇中，加入150 mg步骤(I)所得酸化后的石墨烯，超声I小时。上述溶液中加入0.15 g柠檬酸三钠、1.8 g醋酸钠和1.0 g聚乙二醇，磁力搅拌0.5小时。超声3分钟，移入反应釜中，200 °C下加热8-12小时，得到磁性石墨烯。反应完毕，用磁铁分离，水和乙醇反复洗涤，50 1真空干燥；
(3)配置50mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液(溶剂为去离子水，pH=8.5)，加入100 mL乙醇和75 mL去离子水和200 mg多巴胺盐酸盐形成混合溶液，将50 mg步骤(2)所得的磁性石墨烯加入混合溶液中，超声数分钟，室温下机械搅拌6小时，得到磁性石墨烯表面包覆多巴胺。反应完毕，用磁铁分离，水和乙醇反复洗涤，50 1真空干燥；
(4)将步骤(3)所得的12mg磁性石墨烯表面包覆多巴胺材料分散在150 mL去离子水中，加入配置好的240 yL氯金酸溶液(158.3 mmol/L)，超声数秒钟，85 °C下机械搅拌0.5小时，加入1.5 mL柠檬酸三钠溶液(I mol/L)，继续反应I小时。反应完毕，用磁铁分离，水和乙醇反复洗涤，50 °C真空干燥；
(5)1mL去离子水作为溶剂配置半胱氨酸溶液(20 mg/mL)，加入2 mg步骤(4)所得的磁性石墨烯表面包覆多巴胺和纳米金的材料，超声数秒，室温下振荡10-12小时。反应完毕，用磁铁分离，水和乙醇反复洗涤，50 °C真空干燥。
[0019]图1(a)为磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球的纳米材料的扫描电子显微镜照片；(b)为磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料的扫描电子显微镜照片；扫描电镜型号为Philips XL30，将纯化后的样品均匀涂布在导电胶上，SEM表征前表面喷涂一层金。
[°02°]图1 (C)和(d)为磁性石墨稀表面包覆多巴胺、纳米金球纳米材料的透射电子显微镜照片;透射电镜型号为JEM-2100F( JOEL)，将纯化后的磁性微球的乙醇分散液滴在覆有碳膜的铜网上，自然干燥后用透射电子显微镜观察并拍照。
[0021]实施例2:将实施例1得到的一种基于磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料的合成富集标准糖蛋白辣根过氧化酶HRP，使用MALD1-TOFMS检测。
[0022](I)制备标准糖蛋白酶解液:准确称取I mg标准糖蛋白HRP，溶于I mL 25 mmol/L碳酸氢铵缓冲液中，煮沸5 -10分钟，然后按照与蛋白质量比1: 4 O加入适量的胰蛋白酶(trypsin) ,37 °C下酶解 12-16小时。
[0023](2)标准糖蛋白酶解液的富集:用25 mmolAxL碳酸氢铵缓冲液稀释标准蛋白酶解液至浓度为12.5 nmol/yLU00 fmol/yL和10 fmol/yL，取I yL酶解液的稀释液分别加到99yL体积比为85:14.9:0.1的乙腈:水:三氟乙酸的缓冲液中，分别稀释为125 fmol/yL、lfmol/yL和0.1 fmol/yL。加入100 yg磁性石墨稀表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料，置于酶解仪中37 °C下孵育0.5小时。外加磁场进行磁性分离，并用100 yL体积比为85:14.9:0.1的乙腈:水:三氟乙酸的溶液洗涤3次，除去非糖肽。加入10 yL体积比为30:69.9:0.1的乙腈:水:三氟乙酸的溶液进行洗脱，置于酶解仪中孵育0.5小时。外加磁场进行磁性分离。
[0024](3)点靶:取I yL步骤(2)所述洗脱液点到MALD1-TOF MS靶板上，干燥后，再取I yL浓度为25 mg/mL的2，5_二羟基苯甲酸(DHB)溶液作为基质滴于被分析物上，干燥后，进行质谱分析。
[0025](4)质谱分析以磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料富集到的糖肽。如图2所示，浓度为125 fmol/yL的HRP酶解液通过本复合纳米材料富集后，MALD1-TOF MS质谱鉴定得到14条信号很强的糖肽，并且非糖肽的信号几乎消失。浓度为I fmol/yL和0.1 fmol/yL的HRP酶解液通过本复合纳米材料富集后，MALD1-TOFMS质谱鉴定得到3条和2条糖肽峰。
[0026]实施例3:将实施例1得到的磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料用于HRP酶解液和牛血清白蛋白(BSA)酶解液混合溶液的富集与MALD1-TOF MS检测。
[0027](I)制备蛋白酶解液:分别准确的称取I mg标准糖蛋白HRP和5 mg牛血清白蛋白BSA，溶于I mL 25 mmol/L碳酸氢铵缓冲液中，煮沸5-10分钟，然后按照与蛋白质量比1:40加入适量的胰蛋白酶(trypsin)，37 °C下酶解12-16小时。
[0028](2)混合蛋白酶解液的富集:分别按蛋白质量比1:50和1:100将HRP酶解液与BSA酶解液混合，取I yL酶解液的稀释液分别加到99 yL体积比为85:14.9:0.1的乙腈:水:三氟乙酸缓冲液中混合。再加入100 yg磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料，置于酶解仪中孵育0.5小时。外加磁场进行磁性分离，并用100 yL体积比为85:14.9:0.1的乙腈:水:三氟乙酸的溶液洗涤3次，除去非糖肽。加入10此体积比为30:69.9:0.1的乙腈:水:三氟乙酸的溶液进行洗脱，置于酶解仪中孵育0.5小时。外加磁场进行磁性分离。
[0029](3)点靶:取I yL步骤(2)所述洗脱液点到MALD1-TOF MS靶板上，干燥后，再取I yL浓度为25 mg/mL的2，5_二羟基苯甲酸(DHB)溶液作为基质滴于被分析物上，干燥后，进行质谱分析。
[0030](4)质谱分析以磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料从标准蛋白酶解液混合溶液中富集到的肽段峰，与富集之前酶解液混合溶液肽段的质谱图进行对比。如图3所示，质量比为1:50(HRP:BSA)的蛋白酶解液混合溶液经过磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料富集后，质谱中清楚的呈现了8条糖肽的信号峰，非糖肽的峰几乎消失。质量比为I: 100(HRP:BSA)的蛋白酶解液混合溶液经过磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料富集后，质谱中清楚的呈现了 7条糖肽的信号峰。
[0031]实施例4:将实施例1得到的磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料用于HRP酶解液中糖肽的多次富集。
[0032](I)制备标准糖蛋白酶解液:准确称取I mg标准糖蛋白HRP，溶于I mL 25 mmol/L碳酸氢铵缓冲液中，煮沸5 -10分钟，然后按照与蛋白质量比1: 4 O加入适量的胰蛋白酶(trypsin) ,37 °C下酶解 12-16小时。
[0033](2)标准糖蛋白酶解液的富集:用25 mmolAxL碳酸氢铵缓冲液稀释标准蛋白酶解液至浓度为12.5 nmol/yL，取I yL酶解液的稀释液加到99 yL体积比为85:14.9:0.1的乙腈:水:三氟乙酸缓冲液中，稀释为125 fmol/yL。加入100 yg磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料，置于酶解仪中孵育0.5小时。外加磁场进行磁性分离，并用100此体积比为85:14.9:0.1的乙腈:水:三氟乙酸的溶液洗涤3次，除去非糖肽。加入10此体积比为30:69.9:0.1的乙腈:水:三氟乙酸的溶液进行洗脱，置于酶解仪中孵育0.5小时。外加磁场进行磁性分离。
[0034](3)磁性复合纳米材料经100 yLlOO yL体积比为85:14.9:0.1的乙腈:水:三氟乙酸的溶液反复洗涤后，重复步骤(2)富集125 fmol/yL的HRP酶解液，重复富集10次。
[0035](3)点靶:取I yL步骤(3)所述洗脱液点到MALD1-TOF MS靶板上，干燥后，再取I yL浓度为25 mg/mL的2，5_二羟基苯甲酸(DHB)溶液作为基质滴于被分析物上，干燥后，进行质谱分析。
[0036](4)质谱分析以磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料富集到的糖肽。如图4所示，浓度为125 fmol/yL的HRP酶解液通过本复合纳米材料富集后，MALD1-TOF MS质谱鉴定得到14条信号很强的糖肽，并且非糖肽的信号几乎消失。重复富集5次和10次后的质谱图几乎没有区别，得到了 14条很强的糖肽，并且非糖肽的信号很弱。
[0037]实施例5:将实施例1得到的磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料用于人血清中糖肽的富集，并通过LC-MS进行分析鉴定。
[0038](I)制备血清酶解液:人血清离心除去沉淀，取2 yL上清液加入100 yL 25 mmol/L碳酸氢铵缓冲液中，煮沸5 -10分钟，然后按照与蛋白质量比1: 4 O加入适量的胰蛋白酶(trypsin) ,37 °C下酶解 12-16小时。
[0039](2)人血清酶解液的富集:在步骤(I)得到的血清酶解液中加入I mg磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料，置于酶解仪中37 °C下孵育
0.5小时。外加磁场进行磁性分离，并用100 yL体积比为85:14.9:0.1的乙腈:水:三氟乙酸的溶液洗涤3次，除去非糖肽。加入70此体积比为30:69.9:0.1的乙腈:水:三氟乙酸的溶液进行洗脱，置于酶解仪中37 °C下孵育0.5小时。外加磁场进行磁性分离，洗脱液冻干。
[0040](3)步骤(2)得到的冻干的洗脱液中加入50 mL浓度为25 mmol/L的碳酸氢铵溶液和I yL PNGase F酶，置于酶解仪中37 °C下孵育12小时。送入冻干机中冻干，LC-MS进行分析鉴定。
[0041 ] (4)LC_MS分析以磁性石墨烯表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料富集到的糖肽。通过本复合纳米材料富集人血清中的糖肽经过LC-MS分析鉴定得到31个糖蛋白中的40条糖肽。
【主权项】
1.一种两性亲水复合纳米材料的糖肽富集与检测方法，其特征在于具体步骤为:将两性亲水复合纳米材料与含有目标糖肽的溶液加入体积比为85:14.9:0.1的乙腈:水:三氟乙酸的溶液中，置于酶解仪中37 °C下孵育0.5小时后，外加磁场进行磁性分离，用体积比为85:14.9:0.1的乙腈:水:三氟乙酸的溶液洗涤;加入体积比为30:69.9:0.1的乙腈:水:三氟乙酸的溶液进行洗脱，置于酶解仪中37 °C下孵育0.5小时，外加磁场进行磁性分离;将洗脱液进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析或者液相色谱质谱分析； 其中，所述的两性亲水复合纳米材料为磁性石墨稀表面包覆多巴胺、纳米金球和半胱氨酸的两性亲水复合纳米材料。2.根据权利要求1所述的两性亲水复合纳米材料的糖肽富集与检测方法，其特征在于，进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析前进行前处理，具体步骤是取I yL洗脱液点在MALD1-TOF MS靶板上，干燥后在分析物上滴加I yL 25 mg/mL的2，5-二羟基苯甲酸溶液，并干燥。3.根据权利要求1所述的两性亲水复合纳米材料的糖肽富集与检测方法，其特征在于，液相色谱质谱分析前进行前处理，具体步骤是洗脱液送入冻干机中冻干后，加入浓度为25mmol/L的碳酸氢铵溶液和I yL PNGase F酶，置于酶解仪中37 °C下孵育12小时后，得到的酶解液送入冻干机中冻干。4.根据权利要求1所述的两性亲水复合纳米材料的糖肽富集与检测方法，其特征在于所述的两性亲水复合纳米材料的具体制备步骤如下: (1)将石墨烯加入浓硝酸溶液中，60°C下磁力搅拌7小时，超声分离，用水和乙醇充分洗涤至中性，50 °C下真空干燥，得到酸化石墨烯； (2)六水合氯化铁溶于乙二醇中，加入步骤(I)所得的酸化石墨烯，超声I小时，加入柠檬酸三钠、醋酸钠和聚乙二醇，磁力搅拌0.5小时后，超声3分钟，移入反应釜中，200 °C下加热8-12小时，用磁铁分离，水和乙醇充分洗涤，50°C真空干燥，得到磁性石墨烯； (3)以水为溶剂配置pH值8.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，加入乙醇、去离子水和多巴胺盐酸盐形成混合溶液，将步骤(2)所得的磁性石墨烯加入混合溶液中，超声数分钟，室温下机械搅拌6小时，用磁铁分离，水和乙醇充分洗涤，50 °C下真空干燥，得到表面包覆多巴胺的磁性石墨烯； (4)将步骤(3)所得的表面包覆多巴胺的磁性石墨烯分散在去离子水中，加入配置好的158.3 mM的氯金酸溶液中，超声数秒钟，85 °C下机械搅拌0.5小时，加入I mol/L的柠檬酸三钠溶液，继续反应I小时，用磁铁分离，水和乙醇充分洗涤，50 1真空干燥，得到表面包覆多巴胺和纳米金球的磁性石墨烯； (5)以去离子水为溶剂配置20mg/mL的半胱氨酸溶液，加入步骤(4)所得的表面包覆多巴胺和纳米金的磁性石墨烯，超声数秒，室温下振荡10-12小时，用磁铁分离，水和乙醇充分洗涤，50 1真空干燥，即得所述的两性亲水复合纳米材料。5.根据权利要求4所述的两性亲水复合纳米材料的糖肽富集与检测方法，其特征在于具体步骤(2)中柠檬酸三钠、醋酸钠和聚乙二醇的重量比为3:36:20。6.根据权利要求4所述的两性亲水复合纳米材料的糖肽富集与检测方法，其特征在于具体步骤(2)中六水合氯化铁和酸化石墨稀的重量比为8:3。7.根据权利要求4所述的两性亲水复合纳米材料的糖肽富集与检测方法，其特征在于具体步骤(3)中磁性石墨烯和多巴胺盐酸盐的重量比为1:4。
【文档编号】B01J20/30GK105823847SQ201610148627
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年3月16日
【发明人】邓春晖, 吴润青
【申请人】复旦大学