附载蟾毒灵的多肽修饰的聚甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯-聚己内酯纳米制剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤靶向递送与缓释给药系统技术领域。涉及一种附载蟾毒灵的缬 氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸环肽（CRGD)修饰的聚甲基丙烯酸寡聚乙二醇 酯-聚己内酯纳米粒，简称Ph-PCL-M 3(OEGMA-ctR⑶)-bufalin，及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 现有技术公开了蟾毒灵（bufalin)是蟾蜍毒素中的主要有效成分，对多种恶性肿 瘤具有良好的治疗效果。但是，其较强的毒副作用和不溶于水的缺陷极大地限制了其在临 床上的广泛应用。近年来，以生物可降解的聚合物为载体的递送系统由于其独特的优势而 备受国内外关注。研究显示，将药物包裹在靶向递送载体可以有效地降低药物的毒副作用， 提高药物的溶解性，增强药物的靶向性，改善治疗效果。许多生物降解材料如聚乳酸、聚乳 酸-羟基乙酸、聚己内酯、聚乙二醇等已经广泛的被用做药物的递送载体，取得了一定的治 疗效果。
[0003] 刘涛等人报道了嵌段共聚物PCL-FP0EGMA的制备并采用大分子改性的方式将 具有磁共振成像功能的造影剂DOTA-Gd和肿瘤靶向功能的叶酸分子共价改性到亲水链 POEGMA嵌段中。在此基础上，进一步利用PCL嵌段的疏水性将抗癌药紫杉醇附载到胶束 的疏水核中，得到同时具有磁共振成像、肿瘤靶向和药物运输功能的复合型纳米制剂（Tao Liu j Yinfeng Qian, Xianglong Huj Zhishen Ge and Shiyong Liuj Mixed polymeric micelles as multifunctional scaffold for combined magnetic resonance imaging contrast enhancement and targeted chemotherapeutic drug delivery, Journal of Materials Chemistry，2012，22:5020-5030)。然而，其中尚未公开有关PCL-FP0EGMA 嵌 段共聚物中的可方便用于计算高分子分子量的官能团，导致所制备高分子的分子量计算不 能采用常规表征仪器精确测定，为进一步探索纳米材料的结构与其药用性质之间的规律带 来诸多不便。
[0004] 缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸环肽，简称cRGD，是一种有效的靶 向分子，众多实验己经证实其对肿瘤血管具有很好的革G向效果（James D. Byme, Tania Betancourt, Lisa Brarmon-Peppas， Active targeting schemes for nanoparticle systems in cancer therapeutics. Advanced Drug Delivery Reviews, 2008， 60: 1615-1626.)〇
[0005] 研究显示，纳米给药系统的靶向能力是将药物准确递送至靶点并取得良好治疗效 果的关键。因为正常组织周围的血管没有缝隙，而肿瘤组织周围的血管有100 nm左右的缝 隙，所以纳米粒子就会从这些缝隙中渗透出来，并利用增强的渗透保留（EPR)效应聚集 于肿瘤部位，然后攻击癌细胞，但不会损害正常细胞，从而达到被动靶向的效果。
[0006] 基于现状，本申请的发明人拟提供一种新的具有长循环功效，可生物降解有缓控 释功效、能够有效的、主动靶向肿瘤血管的靶向纳米药物。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种新的具有长循环功效，可生物降解有缓控释功效、能够 有效的、主动靶向肿瘤血管的靶向纳米药物给药系统；具体涉及一种附载蟾毒灵的cRGD修 饰的聚甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯-聚己内酯纳米粒(简称Ph-PCL-FP(OEGMA-ctRGD)-buf al in)，其中，POEGM具有长循环功效，PCL可生物降解有缓控释功效，cRGD是能够有效的、 主动祀向肿瘤血管的祀向分子。此给药系统还具有运送不同抗癌药物的功能。
[0008] 本发明中，以Ph-PCL-M3(OEGMA-CtGMA)为基础材料经cR⑶修饰成 Ph-PCL-FP (OEGMA-ctRGD)，然后将 bufalin 包裹在 Ph-PCL-F P (OEGMA-ctRGD)形成的 胶束中，制得附载蟾毒灵的cR⑶修饰的聚甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯-聚己内酯纳米粒(简 称 Ph-PCL-FP (OEGMA-ctRGD) -bufalin)。 本发明的附载蟾毒灵的肿瘤靶向纳米药物能够有效降低蟾毒灵的毒副作用、提高水 溶性和肿瘤靶向性；所引入的Ph基团可以方便地采用1H NMR的方法准确计算高分子的分 子量；POEGM的长链能使纳米载体有效的逃逸网状内皮系统的吞噬，从而达到长循环的目 的，有助于取得较好的治疗效果；疏水可降解聚合物PCL，能将bufalin包裹起来，降低其毒 性；同时；可使bufalin随材料的降解被缓慢释放，达到较长时间的治疗效果。
[0009] 本发明所涉及的PCL作为医用生物材料已获得美国FDA批准。
[0010] 本发明的Ph-PCL-FP (OEGMA-c^R⑶）纳米给药系统中，所制备的纳米药物直径 可保持在10-500 nm之间，纳米粒上的cRGD祀向基团可以与革El点特异性结合，具有受体介 导的靶向给药系统形成的主动靶向效应，使蟾毒灵抗肿瘤药物比较准确送到肿瘤细胞中， 实现恶性肿瘤的靶向治疗。
[0011] 采用本发明提供的Ph-PCL-FP(OEGMA-C^R⑶）为载体，蟾毒灵为模型药制备的 Ph-PCL-M3 (OEGMA-ctRGD) -bufalin将具有良好的靶向能力和治疗效果。
[0012] 本发明提供一种缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸环肽（cRGD)修饰的 聚甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯-聚己内酯(简称Ph-PCL-FP (OEGMA- ctRGD))的制备方法。
[0013] 本发明还提供一种附载蟾毒灵的cR⑶修饰的聚甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯-聚己 内酯的纳米粒的制备方法。
[0014] 本发明所要解决的技术问题在于，有效的将蟾毒灵包裹在聚合物载体中，使之能 够有效地递送到靶点，从而最大限度地发挥药物疗效。
[0015] 本发明所述的 Ph-PCL-FP(OEGMA-ctRGD)-bufalin 纳米粒子，以 Ph-PCL-FP(OEGM-CtRGD)为载体，以蟾毒灵为模型药制备附载蟾毒灵的纳米药物，其粒径为 10-2000 nm D
[0016] 本发明所述的Ph-PCL-b-P(OEGMA-co-RGD)聚合物通过下述方法合成，其包括步 骤：
[0017] (1)制备 Ph-PCL-OH : 抽真空加热干燥耐热玻璃管，加入一定量的己内酯、苯甲醇和催化剂，加热溶解抽真 空，冷却固化抽真空2小时后封管，120-150°C反应2-50h ;所述的催化剂包括辛酸亚锡、 乳酸铮、SnCl2 · H2O和对甲苯磺酸等；所述的苯甲醇、催化剂和的摩尔比为I :0.05-1 : 20-1000 ； (2) 制备 Ph-PCL-Br : 将一定量Ph-PCL-OH和三乙胺溶于有机溶剂中，之后转移至冰水浴中，然后将一定量 2_溴异丁酰溴滴加到溶液中，反应2-5天；所述的Ph-PCL-ΟΗ、三乙胺和2-溴异丁酰溴的摩 尔比为1 :0. 5-10 :1-10 ;反应产物可以进行纯化：过滤，碱洗水洗或透析，浓缩，加冰甲醇或 冰乙醚沉淀出产物，过滤，真空干燥； (3) 制备卩11-?(^-13-?((^6嫩-。〇-6嫩）： 将一定量？1^(^-8^(^6嫩、6嫩、溶剂和铜盐配体加入玻璃管中，真空冻融三次后加入 铜盐，再真空冻融两次，然后封管，室温到80度反应0. 5-20小时；所述溶剂包括DMF、DMS0、 NMP、异丙醇中的一种或两种及以上组合；所述铜盐配体包括联吡啶、PMDETA和Me6TREN 等；所述 Ph-PCL-Br、OEGMA、GMA、铜盐和铜盐配体摩尔比为 I :10-200 :0. 5-20 :0. 1-10 : 0. 1-10 ;反应产物可以进行纯化：过硅胶柱除去铜盐，浓缩，加冰乙醚/正己烷沉淀出产物， 过滤，真空干燥； (4) 制备？11-?(^-13-?((^6嫩-(3〇-1?0): 将一定量Ph-PCL-b-P(OEGMA-co-GMA)和RGD-NH2溶于有机溶剂中室温搅拌1-24小时； 所述Ph-PCL-b-P(OEGMA-co-GMA)中的GMA和RGD-NH2的摩尔比为1 :0· 1-10 ;反应产物可 以进行纯化：加冰乙醚/正己烷沉淀出产物，过滤，真空干燥。
本发明所述的Ph-PCL-b-P(OEGMA-co-RGD)-bufalin纳米制剂可在机械搅拌、超声、高 压均质机作用下制得，其粒径在10~2000nm、表面光滑、均匀度好、颗粒规则无粘连、再分 散性好、载药率和包封率高；可用于制备静脉或肌肉注射或口服给药的缓释纳米粒，作为 肿瘤靶向给药。
[0018]制备的纳米制剂可以分散在固体、半固体或浴液中，优选的是制成注射给药的药 物制剂形式，尤其是供静脉注射用；其中分别采用复乳法，薄膜乳化法，透析法，乳化蒸发 法，界面沉淀法或自组装法制备纳米粒溶液。
[0019] 进一步，本发明提供了所述的Ph-PCL-M3(OEGMA-ctR⑶)-bufalin纳米给药系 统的制备方法，其特征在于，其中所用的材料是Ph-PCL-FP (OEGMA-ctRGD)，其摩尔浓度为 0.001-10000 M ； 本发明所述的Ph-PCL-FP (OEGMA-ctRGD)-bufalin纳米给药系统的制备方法，其特 征在于所包裹的药物是bufalin，其摩尔浓度为0. 001-10000 μ M ; 本发明所述的Ph-PCL-FP (OEGMA-ctRGD)-bufalin纳米给药系统的制备方法，其特 征在于所用的超声强度，其范围为10-1000 W ; 本发明所述的Ph-PCL-FP (OEGMA-ctRGD)-bufalin纳米给药系统的制备方法，其特 征在于所用的透析袋截留分子量，其范围为100-100, 〇〇〇 Da ; 本发明所述的Ph-PCL-FP (OEGMA-ctRGD)-bufalin纳米给药系统的制备方法，其特 征在于所述的水分散介质为右旋糖昔40-70、普朗尼克F68或聚乙烯醇PVA等各种适合于 制备纳米粒的表面活性剂，分散介质浓度为0.01-10% (w/v); 本发明所述的Ph-PCL-FP (OEGMA-ctRGD)-bufalin纳米给药系统的制备方法，其特 征在于所述的有机溶剂包括乙酸乙醋、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙醇和二甲亚砜等各种 适合于制备纳米粒的有机溶剂； 本发明所述的Ph-PCL-FP (OEGMA-ctRGD)-bufalin纳米递送系统的制备方法，其特 征在于可以制备成冻干剂保存和应用，冻干支架剂包括海藻糖、葡萄糖、乳糖、煎糖、右旋糖 苷、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇等，支架剂含量为0. 01-20%