用于猪圆环病毒与猪流感的疫苗组合物及制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于同时治疗和/或预防猪圆环病毒病和/或猪流感的疫苗组合 物及其制备方法。本发明还涉及用于同时治疗和/或预防两种猪类疾病的核酸分子、重组 质粒和宿主细胞。本发明进一步涉及所述疫苗组合物在制备药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒病主要是由猪圆环病毒（Porcine circovirus, PCV)导致，该 病除表现为猪断乳后多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMffS)外，还与猪皮炎肾病综合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome, F1DNS)、猪呼吸道疾病综合征（Porcine respiratory disease complex, PRDC)、 增生性坏死性肺炎（Proliferative and necrotizing pneumonia, PNP)、先天性震颤 (C〇ngenitaltem〇rAll，CT-All)等相关疾病（PCVD)有关。另外，猪圆环病毒病、猪流感的混 合感染对养猪业危害也十分严重。
[0003] PCV于1974年首次在猪肾（porcine kidney, PK)细胞系中被发现，为圆环病毒科 的成员，其基因组由一环状单链DNA组成，直径仅为17nm，无囊膜，是动物病毒中最小的病 毒，能够在哺乳动物细胞中自主复制。该病毒有猪圆环病毒1型（PCVl)和猪圆环病毒2型 (PCV2)两种基因型，其中，PCVl无致病性，感染猪后不出现临床症状；PCV2具有致病性，含 有两个主要的开放阅读框ORFl和0RF2。
[0004] 猪流感（swine influenza, SI)是由猪流感病毒（swine influenza virus, SIV) 引起的不同日龄、性别和品种猪的一种急性、高传播性呼吸系统传染病，临床上以突发、高 热、精神沉郁、食欲废绝、咳嗽、呼吸困难、反复发作、衰竭、高发病率、死亡为特征。目前， 在世界范围内SIV只有H1N1、H3N2和H1N2这三种亚型被持续分离到（Kothalawala，et al.，2006)。单独感染猪流感病毒可导致猪只生产性能下降，料肉比升高，增重减缓，给猪场 造成一定的经济损失，但临床上，猪流感病毒常与猪圆环病毒、猪蓝耳病毒、猪伪狂犬病病 毒、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体等并发或继发感染，造成严重的呼吸道疾病，给养猪业带 来巨大的危害。特别地，猪流感还能引起人类流感的大爆发，造成严重的公共卫生危害。目 前甲型HlNl流感病毒从美洲几乎蔓延到全世界，传播途径可以是人传人，也可以是动物传 人。良好的药物和疫苗是预防和控制流感的有效措施，但许多地区和国家出现了耐药的流 感毒株，只有高效的疫苗才能控制流感的传播。
[0005] 猪流感病毒粒子呈球形或椭圆形，主要结构蛋白包括：红细胞凝集素 HA，病毒 外壳表面膜上的主要糖蛋白；神经氨酸苷酶NA，也是病毒外壳表面膜上的一种糖蛋白； 基质蛋白M1，形成病毒外壳的主体蛋白；核蛋白NP，形成病毒粒子核衣壳，参与病毒粒子 的形成。其中，红细胞凝集素 HA也是感染-中和抗体的结合革El标（Laver WG, Webster RG. Preparation and immunogenicity of an influenza virus hemaglutinin and neuraminidase subunit vaccine. Virology，1976, 69 (2) : 511-522)，使得病毒与宿主细 胞表面含若干的受体贴附，并发生低pH诱导的构象转变，引发病毒外壳与内体膜融合， 这一构象的转变过程为蛋白酶将血凝素的前体蛋白HAO切割为两个二硫键连接的HAl 和 HA2(Lazarowitz SG, Choppin Pff. Enhancement of the infectivity of influenza A and B viruses by proteolytic cleavage of the hemagglutinin polypeptide. Virology，1975, 68 (2) : 440-454)，但HA2亚基N端有一段高度疏水的区域，使得其在杆状病 毒/昆虫细胞表达系统中很难获得可溶性的HA2蛋白（谢良志，孙春昀，张延静.一种可溶 表达的流感病毒血凝素 HA2融合蛋白.中国专利CN101921339A)。
[0006] 目前，已经有利用PCV的Cap蛋白的免疫原性来研制预防或治疗猪圆环病毒病的 疫苗的报导，也有利用SIV的HA的免疫原性来研制预防或治疗猪流感的报导。然而，目前 并没有将预防和/或治疗猪圆环病毒病与猪流感结合起来的疫苗的报导。本领域亟需一种 能够通过打一针疫苗就能够同时治疗和/或预防这样两种疾病并能够产生良好甚至比常 规疫苗更好的效果的疫苗。
【发明内容】
[0007] 为了解决现有技术中存在的不足，本发明提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物 能够有效预防和/或治疗猪圆环病病毒和/或猪流感病毒引起的疾病。
[0008] 所述疫苗组合物包括i)猪圆环病毒亚单位抗原或者编码猪圆环病毒亚单位抗原 并且能够在猪体内表达的核酸，
[0009] 以及ii)猪流感病毒亚单位抗原或者编码猪流感病毒亚单位抗原并且能够在猪 体内表达的核酸。
[0010] 在本发明的一个优选的实施方式中，所述猪圆环病毒亚单位抗原为一个或多个猪 圆环病毒2型的多肽或蛋白质，和/或所述多肽或蛋白质的免疫原性片段。在本发明的一 个优选的实施方式中，所述编码猪圆环病毒亚单位抗原并且能够在猪体内表达的核酸为编 码一个或多个猪圆环病毒2型多肽或蛋白质，和/或所述多肽或蛋白质的免疫原性片段的 核酸，且所述核酸能在猪体内表达。猪圆环病毒多肽、蛋白质以及所述多肽和蛋白质的免疫 原性片段均可用本领域公知技术合成或重组制备。
[0011] 在本发明的一个优选的实施方式中，所述猪圆环病毒亚单位抗原包括一个或多个 猪圆环病毒2型Cap蛋白。在本发明的一个优选的实施方式中，所述编码猪圆环病毒亚单 位抗原并且能够在猪体内表达的核酸为编码一个或多个猪圆环病毒2型Cap蛋白，和/或 所述猪圆环病毒2型Cap蛋白的免疫原性片段的核酸，且所述核酸能在猪体内表达。术语 "猪圆环病毒2型Cap蛋白"是指病毒的结构蛋白，即核衣壳蛋白，是PCV2的主要免疫原 性蛋白，由 234 个氨基酸组成（LiuQ, TikooSK, Babiuk LA. Nuclear localization of the 0RF2protein encoded by porcine circovirus type 2. Virology, 2001，285(I):91-99)〇
[0012] 在本发明的一个优选的实施方式中，所述猪流感病毒亚单位抗原为一个或多个猪 流感病毒的多肽或蛋白质，和/或所述多肽或蛋白质的免疫原性片段。在本发明的一个优 选的实施方式中，所述编码猪流感病毒亚单位抗原并且能够在猪体内表达的核酸为编码一 个或多个猪流感病毒多肽或蛋白质，和/或所述多肽或蛋白质的免疫原性片段的核酸，且 所述核酸能在猪体内表达。猪流感病毒多肽、蛋白质以及所述多肽和蛋白质的免疫原性片 段均可用本领域公知技术合成或重组制备。
[0013] 在本发明的一个优选的实施方式中，所述猪流感病毒亚单位抗原包括一个或多个 猪流感病毒HA2蛋白，在本发明的一个优选的实施方式中，所述编码猪流感病毒亚单位抗 原并且能够在猪体内表达的核酸为编码一个或多个猪流感病毒HA2蛋白，和/或所述猪流 感病毒HA2蛋白的免疫原性片段的核酸，且所述核酸能在猪体内表达。
[0014] 术语"猪流感病毒"是指来自引起猪流感的正黏病毒科的A型或C型流感病毒。 在本发明的一个优选的实施方式中，所述猪流感病毒为包括但不仅限于H1N1、H1N2、H3N2、 H3N1、H9N2和/或H5N1亚型等，优选为HlNl亚型和/或H3N2亚型。
[0015] 在本发明的一个优选的实施方式中，所述猪圆环病毒亚单位抗原含有猪圆环病毒 2型Cap蛋白，并且所述猪流感病毒亚单位抗原含有猪流感病毒HA2蛋白。由于猪流感病毒 的HA2亚基N端有一段高度疏水的区域，其在杆状病毒/昆虫病毒表达系统中很难获得可 溶性的HA2蛋白，影响了其在制备疫苗的应用中的效果。然而，本发明通过基因工程手段将 猪圆环病毒的免疫原性多肽、蛋白或其片段与猪流感病毒HA2相融合而制成融合蛋白，利 用猪圆环病毒2型Cap蛋白的亲水区域，解决了在杆状病毒表达系统中难获得可溶性HA2 蛋白的问题，从而不仅获得能够有效治疗和/或预防猪圆环病毒病和/或猪流感的疫苗，还 能够相对于单一的猪圆环病毒病疫苗和/或单一的猪流感病毒，改善了疫苗的效果，尤其 是疫苗在预防和/或治疗猪流感方面的效果。具体地说，本发明的疫苗组合物相对于目前 常规单一猪流感疫苗，在预防和/或治疗猪流感方面，具有更好的效果。
[0016] 在本发明的一个优选的实施方式中，所述猪流感病毒为从猪分离的流感病毒，优 选地猪流感病毒为野生型猪流感病毒，和/或来源于野生型猪流感病毒的重组和/或嵌合 型流感病毒。
[0017] 术语"野生型猪流感病毒"是指流行的、天然传播的并引起典型的疾病暴发的猪病 毒类型。在本发明的一个优选的实施方式中，示例性的所述野生型猪流感病毒的多核苷酸 序列和/或氨基酸序列为一个或多个具有下列GenBank登录号（NCBI的GenBank数据库， http://www. ncbi. nlm. nih. Rov/genbank, ΤΓη| )的多核苷酉爱序列和/或氨基酉爱序列：
[0018] A/swine/Saskatchewan/18789/02、 A/Swine/Colorado/1/77、 A/Swine/ Colorado/23619/99、A/Swine/Coted'Armor/3633/84、A/Swine/Coted'Armor/3633/84、A/ Swine/England/195852/92、A/Swine/Finistere/2899/82、A/Swine/Hong Kong/10/98、A/ Swine/Hong Kong/9/98、A/Swine/Hong Kong/81/78、A/Swine/Illinois/100084/01、A/ Swine/Illinois/100085A/01、A/Swine/Illinois/21587/99、A/Swine/Indiana/1726/88、 A/Swine/Indiana/9K035/99、A/Swine/Indiana/P12439/00、A/Swine/Iowa/30、A/Swine/ Iowa/15/30、A/Swine/Iowa/533/99、A/Swine/Iowa/569/99、A/Swine/Iowa/3421/90、 A/Swine/Iowa/8548-1/98、A/Swine/Iowa/930/01、A/Swine/Iowa/17672/88、A/Swine/ Italy/1513-1/98、A/Swine/Italy/1523/98、A/Swine/Korea/CY02/02、A/Swine/ Minnesota/55551/00、A/Swine/Minnesota/593/99、A/Swine/Minnesota/9088-2/98、A/ Swine/Nebraska/1/92、A/Swine/Nebraska/209/98、A/Swine/Netherlands/12/85、A/ Swine/North Carolina/16497/99、A/Swine/North Carolina/35922/98、A/Swine/North Carolina/93523/01、A/Swine/North Carolina/98225/01、A/Swine/0edenrode/7C/96、 A/Swine/0hio/891/01、A/Swine/0klahoma/18717/99、A/Swine/0klahoma/18089/99、A/ Swine/0ntario/01911-l/99、A/Swine/0ntario/01911-2/99、A/Swine/0ntario/41848/97、 A/Swine/0ntario/97、A/Swine/Quebec/192/81、A/Swine/Quebec/192/91、A/Swine/ Quebec/5393/91、A/Swine/Taiwan/7310/70、A/Swine/Tennessee/24/77、A/Swine/ Texas/4199-2/98、A/Swine/Wisconsin/125/97、A/Swine/Wisconsin/136/97、A/Swine/ Wisconsin/163/97、A/Swine/Wisconsin/164/97、A/Swine/Wisconsin/166/97、A/Swine/ Wisconsin/168/97、A/Swine/Wisconsin/235/97、A/Swine/Wisconsin/238/97、A/Swine/ Wisconsin/457/98、A/Swine/Wisconsin/458/98、A/Swine/Wisconsin/464/98 和 / 或 A/ Swine/ffisconsin/14094/99〇
[0019] 术语"猪流感病毒HA2蛋白"是指猪流感病毒的免疫原性蛋白，感染宿主后可诱导 产生中和抗体，也是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分之一，由222个氨基酸组成（Suarez DL, Schultz-Cherry S. Immunology of avian influenza virus:areview. Development and Comparative Immunology, 2000, 24(2-3) :269-283)。所述猪流感病毒 HA2 蛋白的基因 为从猪流感病毒分离出的HA基因的免疫原性片段，如来自任何上述病毒株HA2蛋白的基 因。在本发明的一个优选的实施方式中，示例性的所述来自HlNl的猪流感病毒HA2蛋白的 多核苷酸序列和/或氨基酸序列为一个或多个具有下列GenBank登录号的多核苷酸序列和 /或氨基酸序列：
[0020] AY619961. I ；CY089867. I ；GQ457549. I ；GQ457548. I ；GQ457547. I ；CY091769. I ； CY091745. I ；CY091737. I ；CY091729. I ；GU721143. 3 ；JF820285. I ；JF820277. I ； JF707784. I ；CY087136. I ；CY087104. I ；CY087096. I ；CY087080.1 ；CY087072. I ； CY087064. I ；CY087056. I ；CY087048. I ；CY086863. I ；CY086839. I ；CY086353. I ； CY086006. I ；CY085990.1 ；CY085982. I ；CY085974. I ；CY085966. I ；CY085958. I ； CY085950.1 ；CY085942. I ；CY085934. I ；CY085926. I ；CY085918. I ；CY085910.1