专利名称：一种用于流感病毒亚单位疫苗研究的合成多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于流感病毒亚单位疫苗研究的合成多肽。
背景技术：
流行性感冒病毒称流感病毒，是一类具有高度传染性的呼吸道病毒，也是被列入 生物恐怖武器的其中一种。。目前，接种流感病毒疫苗被认为是预防流感发生与控制病毒传 播的最佳方法，但由于流感病毒变异速度非常快，致使WHO每年都需要公布当前流行性病 毒疫苗，给疫苗的研制和生产造成诸多不便。因此研制一种具有广泛保护作用的疫苗对于 控制流感病毒流行具有极其重要的意义。而且，目前的流感亚单位疫苗主要是通过PCR的方法扩增基因，再通过质粒转化 大肠该菌，获得工程菌，最终获得重组蛋白。操作过程繁琐，且耗时。本发明多肽采用化学 合成的方法，简单快速，且有良好的抗原性。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于流感病毒亚单位疫苗 研究的合成多肽。为实现上述目的，本发明合成多肽的序列为CVKNGTYDYPQYSEEARLNREEIS。上述合成多肽的筛选方法为(1)从NCBI数据库中检索、收集流感病毒HA亚型的氨基酸序列，利用以知 DNA-STAR进行序列比对和同源性分析比对，筛选出HA分子中信号肽之后到蛋白酶切位点 之间具有良好抗原性、亲水性和易溶性分析的330-350区段和500-520区段作为候选片 段；(2)对候选肽段通过抗体的筛选，最终得到针对新型Hmi、H3N2和Hmi三 种流感病毒具有保护作用的合成多肽，该多肽为498-520AA的氨基酸，其序列为 CVKNGTYDYPQYSEEARLNREEIS。进一步，所述载体蛋白为KLH血蓝蛋白。上述步骤(2)具体为以包被免疫家兔的偶联多肽检测免疫血清，当兔多抗血清滴度已经达到 1 100000，进行终放血，收获血清；利用全病毒(H3N2、H1N1、新型H1N1)作为包被抗原对免疫兔的多克隆血清抗体进 行筛选，其中，包被液称取Na2CO3 0. 15g，NaHCO3 0. 293g，蒸馏水稀释至 100ml，得到 0. 05mol/L PH9.6碳酸缓冲液，4°C，保存；洗涤液(稀释液)称取NaCl 8g，KH2PO4 0. 2g，Na2HPO4. 12H20 2. 9g，量取 Tween-20,0. 5ml，用蒸馏水加至 1000ml,即为 0. 01mol/L ρΗ7· 4PBS-Tween_20 洗涤液，4°C， 保存；
封闭液5%脱脂奶粉或BSA的pH7. 4PBS ；终止液2mol/L的硫酸溶液；然后按已知方式进行ELISA实验，并根据实验结果筛选出对新型Hmi流感病毒具 有特异性的合成多肽，即1)包被抗原用包被液将病毒作1000倍稀释，反应板每孔加100ul，4°C冰箱过 夜；2)洗涤倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置2min，反复三次，最后将反应板倒置 在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽；3)加封闭液 200ul，37°C放置 Ih ；4)洗涤同 2);5)加抗体兔免疫血清用封闭液1 500倍稀释，反应板每孔加IOOul，同时作稀 释液对照，37 °C放置Ih;6)洗涤同 2)；7)加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG(l 1000倍稀释)，反应板每孔IOOul，37°C放置 lh；8)洗涤同 2)；9)加底物加TMBlOOml，室温暗处放置15min ；10)加终止液反应板每孔50ul ；11)观察结果用酶联免疫检测仪记录490nm读数。本发明多肽合成过程简单快速，而且所得到的多肽偶联抗原就有较广泛的保护作 用。对于亚单位疫苗的研制，控制流感病毒的蔓延具有积极的意义。
具体实施例方式下面结合实例对本发明进行详细说明。本发明合成多肽的筛选方法包括如下步骤(1)肽抗原表位的生物信息学选择与合成、修饰从NCBI数据库中搜索流感病毒的HA氨基酸序列，用已知DNA-STAR和anth印rot 5. 0分析显示，330-350之间部分无论在抗原性、亲水性还是易溶性分析都是很好的候选片 段；在400位下游存在大量的α螺旋结果，且主要位于疏水性片段，而且该区段变异度很 低，序列稳定，因此判断为可能的穿膜部分，该区域放弃。但该区域(500-520)之后有较短 的变异较大的区域，且该部分抗原性和亲水性均很强。同时，流感病毒的各亚型的表位线性 肽的序列如表2和表3所示。故在330-350和500-520区域中，选择不同亚型的差异性片 段合成十条备选多肽，见表1。表 1
4 表 2 表 3 (2)抗体的制备以包被免疫家兔的偶联 1 100000，进行终放血，收获血清，
值见表4。
(3)合成多肽免疫血清中抗体的筛选ELISA实验的建立利用全病毒(H3N2、H1N1、新型H1N1)作为包被抗原对免疫兔的多克隆血清抗体进 行筛选。1.实验材料与试剂HlNl、H3N2、新甲型Hmi流感病毒疫苗株来自长春生物制品所。酶标羊抗兔IgG抗体购自Sigma公司96孔酶标板购自欣经科公司牛血清白蛋白(BSA)购自Roch公司Tween20 购自 Sigma 公司。包被液称取Na2CO3O. 15g, NaHCO3O. 293g,蒸馏水稀释至 100ml,即为 0. 05mol/L pH9. 6 (包被液)碳酸缓冲液，40C，保存；洗涤液(稀释液)称取NaCl 8g, KH2PO4O. 2g, Na2HPO4. 12H20 2. 9g，量取 Tween-20， 0. 5ml，用蒸馏水加至 1000ml,即为 0. Olmol/L ρΗ7· 4PBS-Tween_20 洗涤液(稀释液)，4°C，
保存；封闭液5%脱脂奶粉或BSA的pH7. 4PBS ；终止液2mol/L的硫酸溶液。2. ELISA 步骤1)包被抗原用包被液将病毒作1000倍稀释，反应板每孔加100ul，4°C冰箱过 夜；2)洗涤倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置2min，反复三次，最后将反应板倒置 在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽；
3)加封闭液 200ul，37°C放置 Ih ；4)洗涤同 2);5)加抗体兔免疫血清用封闭液1 500倍稀释，反应板每孔IOOul，同时作稀释 液对照，37 °C放置lh；6)洗涤同 2)；7)加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG(l 1000倍稀释)，每孔IOOul，37°C放置Ih ；8)洗涤同 2)；9)加底物加TMBlOOml，室温暗处放置15min ；10)加终止液每孔50ul ；11)观察结果用酶联免疫检测仪记录490nm读数。3. ELISA实验结果见表5表 5 ELISA结果判读屮州值> 2. 1，判为阳性；P/N < 2. 1，判为阴性。从表5的结果可以看出，免疫血清KLH-H5m_2与三种流感病毒(H1N1、新型Hmi 和H3N2)反应，得到的P/N值均大于2.1，可以判读为阳性。进而可以说明由合成多肽ZS-5 偶联KLH得到的抗原刺激产生的免疫血清具有一定范围的保护作用，能够为流感病毒亚单 位疫苗的研究提供一定的佐证。
权利要求
一种用于流感病毒亚单位疫苗研究的合成多肽，其特征在于，所述合成多肽的序列为CVKNGTYDYPQYSEEARLNREEIS。
2.—种权利要求1所述合成多肽的筛选方法，其特征在于，具体如下(1)从NCBI数据库中检索、收集流感病毒HA亚型的氨基酸序列，利用以知DNA-STAR进 行序列比对和同源性分析比对，筛选出HA分子中信号肽之后到蛋白酶切位点之间具有良 好抗原性、亲水性和易溶性分析的330-350区段和500-520区段作为候选片段；(2)对候选肽段通过抗体的筛选，最终得到针对新型Hmi、H3N2和Hmi三 种流感病毒具有保护作用的合成多肽，该多肽为498-520AA的氨基酸，其序列为 CVKNGTYDYPQYSEEARLNREEIS。
3.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述载体蛋白为KLH血蓝蛋白。
4.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为以包被免疫家兔的偶联多肽检测免疫血清，当兔多抗血清滴度已经达到1 100000， 进行终放血，收获血清；利用全病毒(H3N2、H1N1、新型H1N1)作为包被抗原对免疫兔的多克隆血清抗体进行筛 选，其中，包被液称取 Na2CO3O. 15g, NaHCO3O. 293g，蒸馏水稀释至 100ml，得到 0. 05mol/L ρΗ9· 6 碳酸缓冲液，4°C，保存；洗涤液(稀释液)称取 NaCl 8g，KH2PO4O. 2g，Na2HPO4. 12H20 2. 9g，量取 Tween-20， 0. 5ml，用蒸馏水加至 1000ml,即为 0. Olmol/L ρΗ7· 4PBS-Tween_20 洗涤液，4°C，保存；封闭液5%脱脂奶粉或BSA的pH7. 4PBS ；终止液2mol/L的硫酸溶液；然后按已知方式进行ELISA实验，并根据实验结果筛选出对新型Hmi流感病毒具有特 异性的合成多肽，即1)包被抗原用包被液将病毒作1000倍稀释，反应板每孔加100ul，4°C冰箱过夜；2)洗涤倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置2min，反复三次，最后将反应板倒置在吸 水纸上，使孔中洗涤液流尽；3)加封闭液200ul，37°C放置Ih；4)洗涤同2)；5)加抗体兔免疫血清用封闭液1 500倍稀释，反应板每孔加lOOul，同时作稀释液 对照，37 °C放置lh；6)洗涤同2)；7)加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG(l 1000倍稀释)，反应板每孔lOOul，37°C放置Ih;8)洗涤同2)；9)加底物加TMBlOOml，室温暗处放置15min；10)加终止液反应板每孔50ul；11)观察结果用酶联免疫检测仪记录490nm读数。
全文摘要
本发明公开了一种用于流感病毒亚单位疫苗研究的合成多肽，该合成多肽的序列为CVKNGTYDYPQYS EEARLNREEIS。本发明多肽合成过程简单快速，而且所得到的多肽偶联抗原有较广泛的保护作用。对于亚单位疫苗的研制，控制流感病毒的蔓延具有积极的意义。
文档编号C07K14/00GK101899101SQ20101023302
公开日2010年12月1日 申请日期2010年7月21日 优先权日2010年7月21日
发明者平芮巾, 张丽萍, 杨鹏飞, 王琳, 胡孔新, 郭雪, 马雪征 申请人:中国检验检疫科学研究院