一株禽致病性大肠杆菌菌株及其在疫苗制备中的应用
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，本发明提供一株禽致病性大肠杆菌菌株，为禽致病性大肠杆菌luxS和aroA双基因缺失株，其保藏号为CGMCC10601。本发明所述禽致病性大肠杆菌菌株可用于制备禽致病性大肠杆菌灭活、弱毒疫苗和菌蜕疫苗，预防禽致病性大肠杆菌感染。CGMCC No.1060120150311
【专利说明】
一株禽致病性大肠杆菌菌株及其在疫苗制备中的应用
技术领域
[0001 ]本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一株禽致病性大肠杆菌菌株及 其在疫苗制备中的应用。
【背景技术】
[0002] 禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli， APEC)引起的严重影响养禽业的传染病之一。APEC感染家禽可引起肺炎、气囊炎、心包炎、肝 周炎、腹膜炎、输卵管炎等症状。严重时引起以败血症为特征的全身感染，导致急性死亡。目 前禽致病性大肠杆菌复杂的血清型和广谱的耐药性，给禽大肠杆菌病的防控提出了新的挑 战。APEC不仅危害禽体健康，同时影响了产蛋量和肉用禽的上市时间，并且增加了饲养成 本，对养禽业造成了严重的经济损失。
[0003] 目前对禽大肠杆菌病的防治除加强管理外，主要采用药物防治，治疗药物主要选 用抗生素。但由于耐药性的出现，导致目前在该病的防控过程中大量使用抗生素，极易造成 禽产品出现药物残留，进而直接影响禽产品的食品的安全，这不仅关系到畜牧业生产和畜 牧业经济的发展，还关系到人类的身体健康和生存环境。
[0004] 制约APEC疫苗研制的一个关键因素是缺少具有良好免疫原性、毒力低的APEC疫苗 株。因此筛选合适的APEC毒力基因，对APEC菌株毒力进行致弱、减毒是获得APEC疫苗株的主 要技术方式之一。国内外的研究表明，对大肠杆菌的基因进行缺失、改造和修饰，都可以减 毒，这些基因主要包括一些毒力基因、调控基因以及代谢相关基因，如aroA和IuxS等。
[0005] 在上述减毒基因中，APEC中的IuxS基因是构成LuxS/AI-2型密度感应系统的关键 基因，不但是APEC的重要毒力基因，而且对APEC的致病性具有重要的调控作用。此外，aroA 基因缺失对细菌可以明显减毒并保持良好的免疫原性，是大肠杆菌减毒的主要手段之一。 aroA基因编码芳香族氨基酸生物合成途径中的3-烯醇丙酮酰莽草酸-5-磷酸合成酶，该基 因的功能缺失导致细菌的生长需要酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等，在缺乏这些代谢产物的情 况下，细菌的生长会受到抑制。此外，aroA突变株所需要的芳香族代谢产物没有在脊椎动物 组织中发现，包括人体组织，确保了其在哺乳动物体内有限的复制，减少了在野外条件下散 毒的风险。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述问题，本发明提供一株禽致病性大肠杆菌菌株，为禽致病性大肠杆 菌aroA和IuxS双基因缺失株，命名为DE17 Δ aroA Δ luxS。
[0007] 本发明再一目的在于提供一株禽致病性大肠杆菌菌株在用于制备禽致病性大肠 杆菌灭活、弱毒疫苗和菌蜕疫苗中的应用。
[0008] 本发明还一目的在于提供包含该禽致病性大肠杆菌菌株的疫苗。
[0009] 本发明采用如下技术方案：
[0010] -株禽致病性大肠杆菌菌株，为禽致病性大肠杆菌IuxS和aroA缺失株，命名为 DE17 Δ aroA Δ luxS，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，已于2015年3月11日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3 号），其保藏号为CGMCC10601。
[0011] 本发明所述禽致病性大肠杆菌菌株用于制备禽致病性大肠杆菌灭活、弱毒疫苗和 菌蜕疫苗中的应用。
[0012] 本发明提供一种包含保藏号为CGMCC10601的禽致病性大肠杆菌菌株的禽致病性 大肠杆菌灭活、弱毒疫苗和菌蜕疫苗，可用于预防禽致病性大肠杆菌感染。
[0013] 为验证本发明缺失株DE17 Δ aroA Δ IuxS对APEC的减毒作用，进行了 IuxS和aroA缺 失株对樱桃谷鸭半数致死量的检测、对鸡胚层纤维细胞DF-I的黏附和入侵检测、在樱桃谷 鸭体内肝脏、脾脏和血液的载菌量检测、运动性检测、部分毒力基因，转录水平检测以及对 感染樱桃谷鸭脏器(肝脏、肾脏、脾脏)的病变分析，结果表明，IuxS和aroA的缺失导致APEC 的毒力显著降低。
[0014]本发明通过同时缺失禽致病性大肠杆菌DE17株aroA和IuxS基因，有效的实现了对 DE17的毒力减弱，建立了致弱禽致病性大肠杆菌毒力的新方法。本发明的禽致病性大肠杆 菌灭活、弱毒疫苗和菌蜕疫苗，可用于预防禽致病性大肠杆菌感染的防控，减少抗生素的使 用，对该病的防控和食品安全具有重要的公共卫生意义和良好的经济效益。
[0015] 本发明所述禽致病性大肠杆菌菌株，为禽致病性大肠杆菌IuxS和aroA缺失株，命 名为DEl7 Δ aroA Δ luxS，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，已于2015年3月11日 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路1号 院3号），其保藏号为CGMCC10601。
【附图说明】
[0016] 图1为本发明aroA和IuxS缺失对APEC运动性的影响；
[0017] 图2A为本发明野生株DE17、缺失株DE17ΔaroA和双缺失株DE17ΔluxSΔaroA对 APEC黏附的影响；
[0018] 图2B为本发明野生株DE17、缺失株DE17 Δ aroA和双缺失株DE17 Δ IuxS Δ aroA对入 侵DF-I细胞的影响；
[0019] 图3为本发明针对野生株DE17、缺失株DE17 Δ aroA和双缺失株DE17 Δ IuxS Δ aroA 进行动物感染实验；
[0020] 图4为本发明对感染野生株DE17、缺失株DE17 Δ aroA和双缺失株DE17 Δ IuxS Δ aroA的樱桃谷鸭的肝脏、脾脏和肾脏做病理切片分析。
【具体实施方式】
[0021] 以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按 照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟 练人员所熟悉的意义相同。
[0022] 本发明中未标注的试剂和原料均为市场上购买所得。
[0023]实施例1禽致病性大肠杆菌IuxS和aroA缺失株的构建
[0024] 以禽致病性大肠杆菌DE17基因组为模板，以luxS-UF/luxS-UR为引物，进行IuxS基 因上游同源臂片段的扩增(775bp)，以luxS-DF/luxS-DR为引物，进行IuxS基因下游同源臂 片段的扩增（l〇23bp)。以aroA-UF/aroA-UR为引物，进行aroA基因上游同源臂片段的扩增 (886bp)，以aroA-DF/aroA-DR为引物，进行aroA基因下游同源臂片段的扩增(957bp)。
[0025] 分别将IuxS和aroA基因上、下游同源臂片段克隆至pUC19载体中，分别构建pUC19- luxS-up-down 和 pUC19-aroA_up-down 重组载体。
[0026]以pKD3质粒为模板，以pkD3-F/pkD3-R为引物，扩增氯霉素抗性基因（cat)，PCR产 物经1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收。将单酶切后的氯霉素抗性基因分别与PUC19-luxS-up-down和pUC19-aroA-up-down重组载体4°C连接过夜，将连接产物转化入DH5a感受 态细胞，在氯霉素的LB固体培养基进行筛选，构建用于IuxS和aroA基因缺失的缺失载体 pUC19-luxS-up-cat_down和pUC19-aroA-up-cat_down〇
[0027]以质粒 pUC19-luxS-up-cat_down 和 pUC19_aroA-up-cat-down 为模板，分别以 luxS-UF/luxS-DR和aroA-UF/aroA-UR为引物，扩增含有同源臂的抗氯霉素片段，用于Red同 源重组反应。
[0028]将含有pKD46的DE17菌株在28°C条件下培养，在对数生长初期加入L-阿拉伯糖诱 导Red重组系统充分表达后，6000g，4°C离心5min，收集菌体。10 %甘油洗涤两次，最后用 10%甘油重悬，分装，_80°C冻存备用。
[0029]将制备好的的含有pKD46的DE17感受态与带同源臂的抗氯霉素 DNA片段预混，放入 点击杯，进行电转化后，加入LB培养基，在37°C摇床中复苏lh，涂布于含氯霉素的LB固体平 板培养。
[0030] 挑取单菌落进行培养，分别使用引物luxS-inF/luxS-inR和11^3-〇1^?/111叉3- outR，&1'〇4-;[1^/&1'04-;[111?和&1'04-01^?/&1'04-01^1?进行？0?鉴定，筛选11^3和&1'04双缺失 株，PCR鉴定结果表明，成功获得禽致病性大肠杆菌DE17株的IuxS和aroA双缺失株，并将该 缺失株命名为DE17 AaroA Δ IuxS(保藏号为CGMCC10601)。
[0031]表1缺失株构建及鉴定引物
[0033] 上述构建的缺失株DE17 Δ aroA Δ IuxS，已于2015年3月11日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号），其保藏号为 CGMCCl0601。
[0034] 为了验证本发明缺失株DE17 Δ aroA Δ IuxS对APEC的减毒作用，开展了IuxS和aroA 缺失株对樱桃谷鸭半数致死量的检测、对鸡胚层纤维细胞DF-I的黏附和入侵检测、在樱桃 谷鸭体内肝脏、脾脏和血液的载菌量检测、运动性检测、部分毒力基因，转录水平检测以及 对感染樱桃谷鸭脏器(肝脏、肾脏、脾脏)的病变分析，上述研究结果表明，IuxS和aroA的缺 失导致APEC的毒力显著降低。
[0035] 实施例2半数致死量(LD5q)的测定
[0036] 本实施例将野生株DE17、缺失株DE17 Δ aroA和DE17 Δ aroA Δ IuxS培养到对数期， 收集菌体，无菌PBS洗涤三次，调整细菌数，倍比稀释。每株细菌分五组，每组8只樱桃谷鸭， 使每株细菌每组的细菌数分别为IO 7CFU/只，IO6CFU/只，IO5CFU/只，IO4CFU/只，IO 3CFU/只和 IO2CFU/只采用大腿肌肉注射，攻毒后观察7日，记录樱桃谷鸭的死亡情况。数据统计采用 Reed-Muench 法计算 LD50。
[0037] 检测结果表明，DE17、缺失株DE17 Δ ar〇A和双缺失株DE17 Δ IuxS Δ ar〇A的LD5q分别 为1.2\1040?1]，3.8\10 50?1]&11(12.4\10(^71]。缺失了31(^后，与野生株相比，缺失株毒力 降低31.7倍，而双缺失株DE17 Δ IuxS Δ ar〇A毒力降低了200倍，表明同时缺失aroA和IuxS基 因，可以显著降低APEC的毒力。
[0038] 实施例3 aroA和IuxS缺失对APEC运动性的影响
[0039] 本实施例将野生株DE17，缺失株DE17 Δ aroA和双缺失株DE17 Δ IuxS Δ aroA培养到 对数期，用无菌PBS将细菌洗涤三次，并将OD6qq调到1.0。在运动性培养基中央，加入10μ1的 菌体，放于37°C培养箱培养过夜。用游标卡尺记录菌圈大小，进行比较分析。运动性分析结 果表明，单独缺失aroA基因不会影响APEC的运动性，而同时缺失IuxS和aroA基因，能显著降 低APEC的运动性(p〈0.05)，如图1所示。
[0040] 实施例4 aroA和IuxS缺失对APEC黏附和入侵DF-I细胞的影响
[0041 ] 本实施例将野生株DE17、缺失株DE17 Δ aroA和双缺失株DE17 Δ IuxS Δ aroA培养到 对数期，将处理好的细菌加入到铺满DF-I细胞的24孔细胞板中，阴性对照加入等体积的 DMEM，以感染复数200为加入感染细菌的量，于37°C培养箱中孵育1.5h，使细菌与细胞充分 作用后，无菌PBS洗5次。黏附组每孔加入0.5% Triton X-100 200μ1，室温作用10min，用平 板计数法进行细菌计数。入侵组每孔加入1ml含有庆大霉素的DMEM，37°C培养箱中作用lh， 用0.5 % Triton Χ-100200μ1裂解细胞，平板计数法进行细菌计数。
[0042] 检测结果表明，缺失aroA基因后，APEC对DF-1的黏附和入侵能力分别有25.8 %和 29.3%的降低(p〈0.05)，如图2A所示，而同时缺失aroA和luxS，其对DF-I的入侵和黏附能力 分别有36.5%和42.5%的降低(p〈0.01)，如图2B所示。
[0043]实施例5动物感染实验
[0044] 本实施例将野生株DE17、缺失株DE17 Δ aroA和双缺失株DE17 Δ IuxS Δ aroA培养到 对数期，收集菌体，每组细菌感染10只樱桃谷鸭，每只攻毒剂量6X IO5CFU/只。感染24h后将 樱桃谷鸭安乐死，无菌条件下分别取血液，肝脏和脾脏。血液直接用无菌PBS倍比稀释，肝脏 和脾脏先称重，再加入无菌PBS匀浆，倍比稀释，均用平板计数法进行细菌计数。
[0045] 与野生株相比，DE17 Δ ar〇A和双缺失株DE17 Δ IuxS Δ ar〇A显著降低了其在樱桃谷 鸭体内的细菌载量。DE17在感染的樱桃谷鸭肝和脾的细菌载菌量量分别为2.6 X IO5CFlVg 和4.2X IO5CFlVg，在血液中为1.7 X 105CFU/ml ;DE17 Δ ar〇A感染的樱桃谷鸭肝和脾细菌载 菌量分别为3 · 5 X IO2和4 · 3 X IO2CFlVg，在血液中为1 · 0 X IO2CFlVml;而DE17 Δ IuxS Δ aroA 感染的樱桃谷鸭肝中没有分离到细菌，脾细菌载菌量为5.OX IO1CFlVg,双缺失株的脾脏和 血液中细菌载量比野生株分别减少8400倍和11333倍，如图3所示。
[0046] 结果表明，进行双基因缺失可以显著降低细菌在感染宿主体内的增殖能力。
[0047]实施例6 aroA和IuxS缺失对感染动物脏器组织病理切片分析
[0048] 本实施例分别对分别感染野生株DE17、缺失株DE17 Δ ar〇A和双缺失株DE17 Δ IuxS Δ ar〇A的樱桃谷鸭的肝脏、脾脏和肾脏做病理切片分析。
[0049] 结果表明，DE17 Δ IuxS AaroA基本不造成感染樱桃谷鸭上述脏器的病理损伤，如 图4所示。
[0050]实施例7 aroA和IuxS缺失株的免疫原性评价
[00511本实施例为了评价aroA和IuxS缺失株的免疫原性，将50只7日龄的樱桃谷鸭分成5 组，每组10只，其中4组分别免疫DE17、DE17 Δ aroA、DE17 Δ IuxS和DE17 Δ IuxS Δ aroA，第5组 对照组免疫佐剂作为空白对照。免疫2周后，用IO9个CFU的DE17菌株进行攻毒，观察各组的 存活与死亡数，对各免疫菌株的免疫原性进行评价。
[0052] 结果表明，未免疫的对照组全部死亡，用DE17A IuxS AaroA菌株进行免疫的保护 率为80%，其他菌株保率率均为70%，表明本发明构建的禽致病性大肠杆菌菌株具有良好 的免疫原性。
[0053]本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本 领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落 入所附权利要求书的范围之内。
【主权项】
1. 一株禽致病性大肠杆菌菌株，为禽致病性大肠杆菌luxS和aroA缺失株，其保藏号为 CGMCC10601。2. 权利要求1所述禽致病性大肠杆菌菌株在制备疫苗中的应用。3. 根据权利要求1所述的应用，所述的疫苗为禽致病性大肠杆菌灭活、弱毒疫苗和菌蜕 疫苗。4. 一种包含权利要求1所述菌株的禽致病性大肠杆菌疫苗。5. 根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述的疫苗为禽致病性大肠杆菌灭活、弱 毒疫苗和菌蜕疫苗。
【文档编号】C12R1/19GK105861404SQ201610254852
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月22日
【发明人】韩先干, 于圣青, 王少辉, 杨立军, 陈兆国, 黄燕, 米荣升, 贾海燕
【申请人】中国农业科学院上海兽医研究所