专利名称：一种海洋硫氧化盐硫杆菌菌株hmgs18及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18及其应用。
背景技术：
我国的海水养殖产量一直位居世界第一，是仅次于肉类的优质蛋白质的重要来源，在保证国家海洋食物产出的安全方面也具有至关重要的作用。多年来，我国的海水养殖虽然保持了稳步发展，但养殖过程中产生的有机和无机废物量大，随着养殖“自身污染”效应的长期积累，养殖环境恶化问题日益凸现出来，不但对邻近海域生态环境造成了严重负面影响，反过来又制约了海水养殖生产本身。硫化物是养殖环境的最主要的污染物之一，且对养殖生物有毒害作用，因此，有效去除环境中的硫化物，改善海水养殖环境，不但有利养殖生产，而且对保护海洋环境也有重要意义。硫氧化菌(Sulfur Oxidizing Bacteria简称SOB)是能氧化元素硫、硫化物、硫代硫酸盐和亚硫酸盐等产生代谢产物硫酸的一类菌。该微生物在工业和环保上具有重要价值，国内外目前主要集中在生物冶金，处理污泥和废水中的重金属，煤炭脱硫，刻蚀以铜及铜合金为材料的基片等方面都有不同程度的应用。研究发现，硫氧化菌能将有机质碳源硫化物沉淀转化为硫酸盐，抑制硫酸盐还原菌的代谢减少硫化物污染，改善海水养殖环境，但目前很少有人将硫氧化细菌有效利用于海水养殖中。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18，该菌株能快速有效的去除污染海水中的硫化物，成本低且环保。本发明的第二个目的在于提供上述海洋硫氧化盐硫杆菌菌株在处理受硫化物污染海水中的应用。本发明的第三个目的在于提供一种可降解海水中硫化物的菌剂，该菌剂含有上述海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18，能有效去除污染海水中的硫化物。本发明的最后一个目的在于提供上述菌剂在去除受硫化物污染的海水中的应用。本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的一种海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18，该菌株的保藏名称为盐硫杆菌HMGS18，分类命名为HalothicAacillus sp. HMGS18，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，保藏日期为2010年11月2日，保藏号为CCTCC NO :M2010290o其中上述海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18的筛选分离鉴定过程为取海水鱼类网箱养殖场区的沉积物，在实验室利用富集基和选择培养基培养后，并分离纯化菌株，根据菌株对硫化物去除能力的强弱，筛选出对硫化物去除能力强的菌株，并最终筛选出一株对硫化物有较强降解能力的菌株，编号为HMGS18，然后根据菌株的菌落形态特征、培养特征和生理生化特征，及其16SrDNA基因序列经与Genbank中已登陆的基因序列进行对比分析发现，菌株HMGS18经鉴定为盐硫杆菌属，命名为盐硫杆菌(HalothicAacillus sp. )HMGS18。本发明的第二个目的在于提供上述海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18在去除受硫化物污染海水中的应用。本发明的第三个目的是通过如下技术手段来实现的一种可降解海水中硫化物的菌剂，含有上述海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18。该菌剂可以为取经上述分离纯化的盐硫杆菌(HalothicAacillus sp.)HMGS18单菌落，于活化培养基中扩大培养40-4 得到。上述活化扩大培养中培养基的组成优选为=MgSO4 · 7H20 0. lg, Na2S2O3 · 5H205g， K2HPO4 2. 0g, (NH4)2SO4 0. lg, CaCl2 · 2H20 0. lg, FeSO4 · 7H20 0. 02g,陈海水 IOOOmL, PH7. 6-8. 2，121°C 灭菌 20min。本发明的最后一个目的是通过如下技术手段来实现的上述菌剂在去除受硫化物污染的海水中的应用。与现有技术相比，本发明具有如下优点(1)本发明从海水网箱养殖区沉积物中筛选得到海洋硫氧化盐硫杆菌菌株 HMGS18，其具有良好的去除受硫化物污染的海水中硫化物的能力，能在l-7d内有效去除海水中的硫化物(去除率68.8% )，并且该新菌株对海水养殖生物斑节对虾(Penaeus monodon)虾苗和黑鲷(Sparus macrocephalus)仔鱼等海洋常见鱼类没有毒害致病作用；(2)本发明利用硫氧化细菌将海水中的硫化物转化为硫酸盐是去除硫化物污染的一种经济有效的方法，其能对海水养殖环境中的硫化物污染物进行快速、高效的去除，所以，可用于对海洋环境中硫化物污染的有效治理。
图1是实施例2中筛选得到的海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18的PCR产物琼脂糖电泳图；图2是实施例3中筛选得到的海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18的电镜图片；图3是实施例5中的海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18在高浓度硫化物废水中pH 的变化图； 图4是实施例5中的海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18在高浓度硫化物废水中硫酸盐的变化图；图5是实施例5中的海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18在高浓度硫化物废水中硫化物的降解效率图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但不以任何形式限制本发明。实施例1海洋好氧反硝化菌株的筛选方法一、材料准备1、菌源和实验废水(1)菌源有20多年养殖历史的深圳市大鹏澳海水鱼类网箱养殖场区的沉积物；(2)实验废水(高浓度硫化物海水)=Naj2O3 · 5H20 (硫化物)5g，MgSO4 · 7H20
40. lg, K2HPO4 2. 0g, (NH4)2SO4 0. lg, CaCl2 · 2H20 0. lg, FeSO4 · 7Η200· 02g,陈海水 IOOOmL, PH7. 6 8. 2，121°C 灭菌 20min。2、培养基(1)选择培养基=Na2S · 5H20 2g，高纯水 1L，121°C 灭菌 20min ；(2)分离及斜面培养基=MgSO4 · 7H20 0. lg, Na2S2O3 · 5H20 5g，K2HPO4 2. 0g, (NH4)2SO4 0. lg，CaCl2 ·2Η20 0. lg，FeSO4 ·7Η20 0. 02g，琼脂 20g，陈海水 1000mL，PH7. 6-8. 2， 121°C 灭菌 20min ；(3)活化扩大培养基=MgSO4 · 7H20 0. lg, Na2S2O3 · 5H20 5g，K2HPO4 2. Og, (NH4)2SO4 0. lg, CaCl2 · 2H20 0. lg, FeSO4 · 7H20 0. 02g,陈海水 IOOOmL, PH7. 6-8. 2，121°C灭菌 20min。3、实验仪器和设备广东海利电磁式空气压缩机AC0-009E ；苏州安泰超净工作台SW-CJ-IBU ；上海精宏生化培养箱SHP-150 ；苏州欧倍振荡培养箱0BS-2F ；德国HYDRO-BIOS-KIEL 采泥器；日本HIRAYAMA高压灭菌器HVN-85 ；日立H-7650透射电子显微镜；
上海雷磁酸度计PHS-3C ；加热板及滴定仪；PC818 型 PCR 仪；电泳仪及电泳槽；凝胶紫外观测仪等。二、菌株的分离与筛选1、菌株的富集取大鹏澳海水鱼类网箱养殖场沉积物表层以下5cm处的沉积物放入采样袋，再放入0°C冰盒中带回实验室，取250g沉积物加到2L的富集瓶中，每2天加入ImL选择培养基， 并加入适量的纤维棉，在室温条件下间歇曝气富集培养2个月，中间据情况不定期添加灭菌海水。2、菌株的分离纯化挑选并直接冲洗细菌附着量较大的纤维棉，得到富集菌液，适当稀释，均勻涂布于分离培养基平板上，2548°C培养2-3d，待菌落长出后，挑取形态各异的单菌落，在分离培养基平板上进行划线分离，直至得到纯的单菌落。将分离纯化的细菌接种至斜面培养基中并于冰箱4°C保存。3、硫氧化细菌的筛选通过用pH、硫酸盐及硫化物值来衡量菌株对硫化物的降解能力，以硫化物浓度变化表示细菌利用硫化物的降解能力。取分离纯化得到的菌株于活化扩大培养基中2548°C振荡培养40-4 ，按海水于菌液体积比40-60 1，接种到含高浓度硫化物的海水中，取不接种菌液的硫化物海水作为空白对照，25-28 V振荡培养，反应时间l-8d。
经过筛选获得一株编号为HMGS18的菌株，即海洋硫氧化菌株HMGS18。实施例2海洋硫氧化菌株HMGS18的鉴定1、对海洋硫氧化菌株HMGS18的鉴定对海洋硫氧化菌株HMGS18进行了生理生化的鉴定以及16S rDNA分子的鉴定，从分子水平，并结合细菌形态学特征及生理生化特性分析确定菌株的种属。16S rDNA序列分析主要按照以下步骤(1)细菌核DNA的提取1)用高压灭菌的牙签挑单菌落接种于扩大培养基内培养过夜，取1.5mL菌液于 Eppendorf管内，8000rpm室温离心5min，彻底除去上清； 2)加STE (Sodium-Tris-EDTA)缓冲液1. 5mL洗涤一次，离心弃上清，再加入 0. 6mLTE (Tris-EDTA)缓溶液，重悬细菌；3)力口 30 μ L 10mg/ml 的溶菌酶，37°C水浴 45min ；4);^65yL 10 % 的 SDS (十二烷基磺酸钠)，20mg/mL 的蛋白酶 K3 μ L，50°C 水浴池，至溶液变清；5)加入等体积酚氯仿抽提三次，直至看不到蛋白质为止；6)在上清液中加入1/10体积的3M的NaAc (ρΗ5· 2)；7)加入等体积的异丙醇，沉淀DNA。用玻璃棒缠绕挑出DNA细丝，再用体积百分含量为70%的乙醇洗涤一次，自然晾干，并将DNA溶于100 μ L TE溶液中；8)加入终浓度为 50 μ g/mL 的 foiase (RNA 酶)，37°C，30min，去除 RNA，_20°C保存(2) 16S rDNA 基因的 PCR 扩增Pl (上游引物)27F(5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')P2(下游引物)1522R(5' -AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA_3') 在50 μ L的反应体积中，加入1 μ L模板DNA (0. 1 μ g)，0. 5 μ L Pl和Ρ2 (终浓度为 0. 5 μ Μ), 1 μ L dNTP(每种 NTPO. 2mM)，0· 5 μ L Taq 聚合酶 QU)禾口 5 μ L 10XPCR 缓冲液。 PCR扩增条件为94°C预变性5min，在94°C变性30s，61-65°C退火30s，72°C延伸lmin，循环 30次；最后72°C终延伸IOmin0(3) PCR产物的回收将PCR产物以琼脂糖凝胶(质量百分比)进行电泳后，在紫外灯下切取含欲回收片段的凝胶，放入1. 5mL离心管中加2倍体积TE，65°C水浴IOmin后加等体积水饱和酚抽提一次离心后取上层水相再用酚-氯仿-异戊醇抽提一次，收集上清加0. 1倍体积的 10mol/L乙酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀，离心，用体积百分含量为70%的乙醇洗沉淀一次，风干后溶于适量灭菌双蒸水。(4) 16S rDNA的部分序列测定和分析P-f :CACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC ；P-r :GGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。力口入1 μ L 模板 DNA ( < 0. 1 μ g)，PCR 扩增 30 个循环(94 "C lmin, 55 "C 30s, 72 °C 2min) 0采用ABIPRISM测序试剂盒中染料终止剂终止反应。然后，在Applied Biosystem373 ADNA测序仪上测序。测得的16S rDNA序列采用BLAST软件与GenBank数据库比较分析，最终从分子水平上确定该菌的种属。2、16S rDNA 序列测定本发明采用对16S rDNA序列测定和分析的方法对细菌进行分子水平的鉴定。以细菌的核DNA为模板，以16S rDNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，得到长度为1458bp的扩增带用琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示。PCR产物经纯化后，测定其全序列。GGGACAGGGGGGGCTGCCTTMCCATGCMGTCGMCGGTMCAGGAGAGAGCTTGCTCT60
CTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTMTACATGGGMTCTGCCCTGAGGTGGGGGAT120
MCCTGGGGAMCTCAGGCTMTACCGCATGATCTCTACGGAGCAMGTGGGGGACCTTC180
GGGCCTCACGCCTTGGGATGAGCCCATGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTMGAGCCTA240
CCMGGCGACGATCAGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGGACGGCCACACTGGGACTGAGACAC300
GGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGMTATTGGACMTGGGGGCMCCCTGAT360
CCAGCMTGCCGCGTGTGTGMGMGGCCTGCGGGTTGTAMGCACTTTTATCGGGGMG420
MTAGGTTGTCGCTMTACCGGCMCACTTGACATTACCC GTTGMTMGCACCGGCTM480
CTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTMTACGGAGGGTGCGAGCGTTMTCGGMTTACTGGGCG540
TAMGCGTGCGTAGGCGGMGCTTMGTCTGATGTGAMGCCCCGGGCTTMCCTGGGM600
TGGCATTGGAMCTGGGTTTCTAGAGTGTGGTAGAGGATAGTGGMTTTCCAGTGTAGCG660
GTGAMTGCGTAGATATTGGAMGMCACCGATGGCGMGGCAGCTATCTGGGCCMCAC720
TGACGCTGAGGTACGAMGCGTGGGGAGCAMCAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGC780
CCTAMCGATGTCGACTTGTCGTTGGGGGAGTTTAGTCCTTCAGTGACGGAGCTMCGCG840
TTMGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCMGGTTGAMCTCAMGGMTTGACGGGGG900
CCCGCACMGCGGTGGAGCATGTGGTTTMTTCGATGCMCGCGMGMCCTTACCTGGC960
CTTGACATCCTCGGMCTTGGCAGAGATGCCTTGGTGCCTTCGGGMCCGAGTGACAGGT1020
GCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCMCGAGCGC1080
MCCCTTATTCCTAGTTGCCAGCACTTCGGGTGGGMCTCTAGGGAGACTGCCGGTGACA1140
MCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCMGTCATCATGGCCCTTATGGCCAGGGCTACACA1200
CGTGCTACMTGGTCGGTCCAATGGGTAGCTMGCCGCGAGGTGGAGCCAATCCCTCAAA1260
GCCGATCTTAGTCCGGATTGCAGTCTGCMCTCGACTGCATGMGTCGGAATCGCTAGTA1320
ATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCA1380
CACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGMGTGGCTAGTCTMCCTTCGGGAGGACGGTCACCA1440
CGGTGGATTCCCGTTTG C
1458实施例3海洋硫氧化菌株HMGS18菌落形态、生理和生化特征海洋硫氧化菌株HMGS18菌落形态、生理和生化特征见表1_1 ；细胞形态见图2。表1-1海洋硫氧化菌株HMGS18的菌落形态特征以及主要的生理生化特征
权利要求
1.一种海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18，其特征是该菌株的保藏名称为盐硫杆菌 HMGS18，分类命名为HalothicAacillus sp. HMGS18，保藏单位为中国典型培养物保藏中心， 保藏日期为2010年11月2日，保藏号为CCTCC NO :M2010290o
2.权利要求1所述的海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18在处理受硫化物污染的海水中的应用。
3.—种可降解海水中硫化物的菌剂，其特征是含有权利要求1中所述海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18。
4.权利要求3所述菌剂在处理受硫化物污染的海水中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种海洋硫氧化盐硫杆菌菌株HMGS18，该菌株的保藏名称为盐硫杆菌HMGS18，分类命名为Halothiobacillus sp.HMGS18，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2010年11月2日，保藏号为CCTCC NOM2010290。该菌株具有高效硫化物降解能力，能快速有效的去除受硫化物污染海水中的硫化物，并且对海水养殖生物没有毒害致病作用；本发明对去除海水养殖环境和海洋环境中硫化物污染具有安全、环保、高效的特点。
文档编号C02F1/58GK102399721SQ201110335439
公开日2012年4月4日 申请日期2011年10月28日 优先权日2011年10月28日
发明者古小莉, 孟霞, 廖秀丽, 黄洪辉 申请人:中国水产科学研究院南海水产研究所