专利名称：一株黄杆菌菌株及其在产生琼胶酶中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的微生物，具体说涉及一种黄杆菌属(Haw6acten'wm sp.)细菌，
本发明还涉及该菌株在产生琼胶酶中的应用。
背景技术：
琼胶是一种从江篱(龙须菜)、石花菜等红藻中提取出来的水溶性多糖，是世界 三大海藻胶之一，主要由琼胶糖和硫琼胶两部分组成，广泛应用于生化、临床、医药、 食品等领域，由于琼胶不易被绝大多数微生物所降解的特性，也被广泛用作实验室培
养基支持载体。
琼胶酶是一类能降解琼胶多糖的酶，琼胶酶根据其裂解糖苷键的不同，主要分为 a-琼胶酶和B-琼胶酶两大类。a-琼胶酶裂解琼胶糖的a-l，3糖苷键，B-琼胶酶裂解琼 胶糖的15-1,4糖苷键。琼胶酶主要通过海洋微生物得到。1902年Groleau第一次从海 水中分离到能分解琼胶的细菌-琼胶假单胞菌。从那以后人们己经从海水系统中分离到 了多种琼胶分解菌。
生产琼胶寡糖是琼胶酶的一个主要应用。琼胶酶作用的底物有琼胶、琼胶寡糖。 琼胶降解的中间产物为多种不同聚合度的寡糖混合物，而这些不同聚合度的寡糖混合 物可以通过控制琼胶酶的反应条件来获得。a-琼胶酶降解和酸法降解琼胶都可以得到 琼寡糖，新琼寡糖只能由B-琼胶酶降解得到。研究表明，琼胶低聚糖具有多种特殊功 能而倍受关注，比如可以作为食品添加剂、具有抗氧化性、抑制癌细胞的发生、抗病 毒等特殊功能；新琼寡糖也被发现具有一些生理活性，如新琼寡糖可促进小鼠肠道有 益菌群生长，具有作为益生元的潜力；新琼寡糖具有细胞增白和保湿功能，可以作为 化妆品的添加剂；新琼寡糖也具有抑菌作用、免疫激发功能。琼胶酶降解产生琼胶寡 糖，具有高度专一、高效的特点，降解条件温和，产物不易被破坏，利于产物分析和 回收。传统的酸法降解琼胶反应剧烈、工艺条件难以控制而逐渐被酶法降解所代替。
琼胶酶也可以应用于核酸凝胶电泳的核酸回收，目前已有相关的论文的报道，巿场上已有相关的试剂盒销售。琼胶是某些红藻细胞壁的重要成分，琼胶酶可以用于降 解细胞壁中的琼胶，从而获取单细胞或者原生质体，因此琼胶酶是一种重要的海藻遗 传工程的工具酶。琼胶酶还可以用于研究的海藻多糖的结构，这也是利用了琼胶酶可
以降解某些海藻多糖的特性，通过测定降解产物的结构推测多糖的结构。
因此，获取具有高活性、高特异性、高稳定性的琼胶酶对于琼胶酶的开发和应用 具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株能产琼胶酶的细菌，以及利用该菌株生产琼胶酶中的应用。
本发明的技术方案如下
一种黄杆菌菌株，该菌株为Flavobacterium sp.，于2008年1月16日寄存于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCN0.2342，保 藏单位地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。
该菌株在生产琼胶酶中的应用。
本发明的黄杆菌(F/avo6acten'ww) CGMCC N0.2342，是从海域中的紫菜藻体上 筛选得到，为革兰氏阴性菌、杆状，细胞大小为0.5 0.6nmxl.8 2.0nm (见图1，该 菌株的扫描电镜照片)。此菌株在2216E培养基上会形成凹陷、周围具透明圈的单菌 落，菌落黄色、圆形，边缘整齐。该菌株能在4。C一3(TC生长，最适合生长温度为25°C; 该菌株能在pH6.0-9.0范围内能生长，其中在pH7—8之间生长最好；本发明菌株的生 长必需NaCl， NaCl在培养基在的浓度为14wt。/。,其中最适合生长的NaCl浓度为2 —3wt%;液体培养该菌株时需要往培养基添加0.05%-0.25%的琼脂粉或者0.2%的可 溶性淀粉、糊精、麦芽糖、D-半乳糖、葡萄糖。该菌株不需要琼脂也可以生产琼胶酶， 这是它的独特之处。
本发明菌株所用培养基的配制方法为在每1000ml海水中，加入5g胰蛋白胨， lg酵母提取物，固体培养基添加1.5wty。的琼脂粉，液体培养需要添加可溶性淀粉、 糊精、麦芽糖、D-半乳糖、葡萄糖、琼脂等六种碳源中的一种，添加量为0.2wt%; pH7.0-8.0。海水可以用人工海水代替天然海水23.3g 1" NaCl, 10.65g l—1 Mg C12'6H20, 1.12g 1" CaCl2,0.724g 1" KCl， 3.936g 1、304 。
本发明菌株可产生过氧化氢嗨、淀汾酶、氧化酶、羧甲基纤维素酶，V.P.试验和甲基红试验均为阴性。
本发明菌株的主要脂肪酸组成为iso d5:0(19.10%), Summed Feature 3 (23.0%， 包括iso-C15:0 2-OH禾卩或者C16:1w7c ) ， iso-C17:0 3-OH(7.47%) ， C15:0 2-OH(5.0%)，ANTEISO C15:0 (4.92%), iso-C15:l G(4.76%), iso-C15:0 3-6k(4.70%)， C17:0 2-OH (4.22%)。
木发明菌株能够利用以下碳源糊精、淀粉、D-纤维二糖、D-半乳糖、a-D-葡萄 糖、a-D-乳糖、麦芽糖、D-甘露糖、Tween40、 L-谷氨酸。
本发明菌株在2216E培养基上25'C培养5天即可把菌落周围的琼脂降解完毕，在 2216E液体培养基中发酵24h,发酵液中酶的活力即达到3.46U/ml;相比文献报道， 其属于高产琼胶酶的菌株。因此，本发明的菌株可作为琼胶酶的生产菌株。[酶活力测 定的条件lml酶液加入9ml0.25X琼胶底物中，4(TC反应15min，沸水浴灭活5min， 用DNS法测定还原糖的量。在上述反应条件下，lml酶液lmin产生lpg还原糖作为 一个酶活力单位，以D-葡萄糖作为标准]
黄杆菌(F/flvo&acten'wm) ZC1 CGMCC NO.2342具有产生多种琼胶酶的特性。菌 株的胞外粗酶液在PAGE蛋白电泳后的琼胶平板活性染色表明，该菌产生多种胞外琼 胶酶(见图2);其中一个胞外琼胶酶经凝胶过滤得到分离纯化，SDS-PAGE法测得 其分子量为40kDa (见图3)。本发明菌株产生的多种胞外琼胶酶可有望用来生产琼 胶寡糖。
图l、本发明菌株的扫描电镜照片，其中标尺长度单位为lpm;
图2、本发明菌株胞外粗酶液的PAGE电泳凝胶琼胶平板活性染色，图中
箭头指琼胶酶条带-， 图3、从本发明菌株中纯化得到的一种胞外琼胶酶ZCla; 图4、本发明菌株的部分16SrDNA序列；
图5、本发明菌株的ITS序列。
具体实施例方式
下面通过实例对本发明作进一步的说明菌株的分离筛选和鉴定
本发明菌株分离筛选方法如下将从海水中采集回来的紫菜藻体放置于灭菌的研 钵中，加入适量灭菌海水，搅拌研磨，浆液系列浓度稀释涂布于2216E海水琼胶平板 上，在25"C培养一定时间后，挑取在周围产生透明圈或者凹陷的菌落作进一步菌株的 分离纯化。
菌株的全细胞脂肪酸成分分析采用Microbial Identification System系统，菌株对各 种碳源的利用是采用Biolog系统，均采用从2216E平板上直接挑取的菌落。
16SrDNA序列分析采用的引物为通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3')禾卩1492R(5'-TACCTTGTTACGACTT-3')，扩增得到的部分16SrDNA序列如 图4。
16S 23SrDNA核糖体大小亚基基因间隔序列(ITS序列)分析采用Yu等(2001) 所采用的通用引物[S926f: 5'-CT(C/T) AAA (G/T)GAATT GAC GG-3'; L189r: 5'-TAC TGAGATG(C/T)TT(A/C)A(G/A)TTC-3']。扩增片段(图5)不仅含全长ITS,而且还 包括侧翼16S rDNA (约600 bp)及23S rDNA (约190bp)。
除此之外，为鉴定菌株还采用扫描电镜观察细胞形态以及测试菌株的部分生理生 化反应。结合上述分析，最终将菌株归属为黄杆菌属(F/avo6flcten'wm)。 菌株的培养方法
菌株得到分离纯化后，其培养方法如下。培养基的组成是酵母提取物lg，胰蛋 白胨5g，陈海水1000ml， pH7.0-8.0，或者以人工海水代替陈海水，其组成23.3g1—1 NaCl, 10.65g 1" Mg C12'6H20， 1.12g 1" CaCl2， 0.724g 1" KCl, 3.936g l"Na2S04，固体培养 需要添加1.5%的琼脂粉，液体培养需要添加0.05%-0.25%的琼脂粉或者0.2%的可溶 性淀粉、糊精、麦芽糖、D-半乳糖、葡萄糖，于115"C灭菌20min。
用菌株发酵生产琼胶酶以及琼胶酶的纯化
将菌株用2216E培养基活化后，以1%的接种量接入装有400ml发酵培养基(含 0.1%琼脂粉，其他成分见前面菌株的培养方法中的培养基)的1000ml三角瓶中，25°C 摇瓶培养24h后，将培养液用冷冻离心机以6000rpm离心5min去除菌体，获得发酵 初酶液，发酵初酶液即可以用于生产琼胶寡糖。往发酵初酶液添加硫酸铵固体至终浓 度30%， 12000rpm/10min离心，取上清液继续添加硫酸铵固体至终浓度70%, 12000rpm/10min离心后的沉淀用20mM的Tris-Cl缓冲液(pH7.5)溶解，用同样的
6缓冲液透析，最后经PEG20000浓縮，离心，上清液即作为初步纯化的琼胶酶。初步 纯化的酶液再经离子交换层析(DEAE纤维素交换柱)，收集有琼胶酶活性组分，冷 冻干燥，重溶于20mM的Tris-Cl缓冲液(pH7.5)中，然后运用凝胶过滤层析(Sephacryl S-200)进一步分离纯化，同样收集有琼胶酶活性组分，冷冻干燥，重溶于20mM的 Tris-Cl缓冲液(pH7.5)中即为分离纯化的琼胶酶，运用SDS-PAGE检测其纯度以及 分子量。通过此方法，目前已得到本发明菌株所产的其中--个琼胶酶，如图3所示。
PAGE电泳凝胶的琼胶平板活性染色 含琼胶酶的酶液经PAGE电泳后，蛋白凝胶块在未染色前浸泡于PBS (20mM， pH7.0) 中约5分钟，然后将PAGE电泳凝胶覆盖到1.5。/。的琼胶平板上，37。C孵育15min。移走 PAGE电泳凝胶，往琼胶平板内倒入卢哥氏碘液，琼胶平板上有被琼胶酶作用过的区 域将会出现透明带，从而知道PAGE电泳凝胶上是否存在琼胶酶蛋白条带，亦即知道 酶液中所包含的琼胶酶的种类数量。
用本发明菌株所产琼胶酶生产琼胶寡糖
琼脂底物900ml(0.25X的琼脂加热溶于20mMpH7.5的Tris-Cl缓冲液1000ml)冷 却至40'C，加入发酵初酶液或者纯化的琼胶酶酶液100ml，混匀，4(TC下保持24h， 沸水浴加热5min使酶失活，加入2倍体积的95%乙醇，离心分离，上清液经浓縮冷 冻干燥得到寡糖混合物。
权利要求
1、一株黄杆菌菌株，该菌株为Flavobacterium sp.，于2008年1月16日寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株保藏编号为CGMCC NO.2342。
2、 根据权利要求1所述的菌株，其特征在于该菌株是从海洋中的紫 菜藻体上筛选得到，为革兰氏阴性菌、杆状，细胞大小为0.5 0.6(imxl.8 2.0该菌株在2216E培养基上会形成凹陷、周围具透明圈的单菌落， 菌落黄色、圆形，边缘整齐；兼性需氧。
3、 根据权利要求1所述菌株，其特征在于该菌株所用培养基的配制 方法为在每1000ml海水中，加入5g胰蛋白胨，lg酵母提取物，固体培 养基添加1.5wt。/。的琼脂粉，液体培养亦要添加0.05wt。/。-0.25wt。/。的琼脂粉 或者添加可溶性淀粉、糊精、麦芽糖、D-半乳糖、葡萄糖等五种碳源中的 一种，添加量为0.2wt。/。； pH7.0-8.0。
4、权利要求l所述的菌株在生产琼胶酶方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一株新的一株黄杆菌菌株及该菌株的培养方法和用该菌株在生产琼胶酶方面的应用。本发明提供可用来生产琼胶酶的菌株是黄杆菌(Flavobacteriumsp.)CGMCC NO.2342，其独特之处是菌株不需要琼脂亦可产生琼胶酶，可以在液体培养基中添加0.05％-0.25％的琼脂粉或者一定的碳源。本发明提供的生产琼胶酶的方法是在发酵培养基中培养Flavobacterium sp.，得到的琼胶酶粗酶液可继续进行浓缩纯化，亦可直接用于降解琼胶生产琼胶寡糖。该菌株产生的琼胶酶具有很高的活性，且产生多种琼胶酶，可望得到多系列的琼胶寡糖。
文档编号C12N9/42GK101608166SQ20081002812
公开日2009年12月23日 申请日期2008年5月15日 优先权日2008年5月15日
发明者伦镜盛, 李卫平, 林伯坤, 忠 胡, 钟名其 申请人:汕头大学