专利名称：真菌Xylaria sp.FDYS-1及其制备的生物制剂与在防治松材线虫中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物农药领域，具体涉及一株真菌^^n'a sp. FDYS-1 及其制备的生物制剂与在防治松材线虫中的应用。
技术背景松材线虫病是松树的一种毁灭性病害。该病通常来势凶猛，染病 松树死亡率极高，被称为"森林的癌症"和"无烟的森林火灾"。我 国自1982年在南京中山陵首次发现该病，现已蔓延至江苏、浙江、安 徽、山东、湖北、广东、江西、重庆、贵州等12个省份的113个县(区)， 发生面积超过73hm2，死亡松树200万株，造成林业经济、森林生态的 巨大损失和自然景观的严重破坏，并对我国广大适生区的松林构成严 重威胁。目前对松材线虫病的防治主要针对其传媒昆虫和松材线虫本身， 而当前研究的松材线虫控制因子主要包括产毒真菌、抗生素和杀虫植 物等。在产毒真菌方面，孙建华报道总状共头霉(&"c印^/o^^m racemo ^)对松材线虫有极强的杀线虫活性。向红琼等发现用乙酸 乙酯从粗皮侧耳麦粒培养物中提取的粗毒素，对松材线虫有较强的毒 性。李国红等发现一种侧耳属(尸/wra加sp.)真菌，12h内对松材线 虫的致病率可达90%以上，且其活性组分存在于发酵液中，不需诱导能稳定生成，水溶性，对热不敏感。张克勤等发现/^^fo/^/o恥C加'fl^ZveraaWa ZD1菌株通过液体和麦粒固体培养后，可从代谢产物中提 取有效的水溶和脂溶性物质制备成杀线虫生物毒素；Q^yowora ca仿cwpa ZD2菌株通过液体和固体发酵后，可制备成对松材线虫具 毒杀活性的生物制剂。董锦艳等发现粉红粘帚霉(G/k/a^謂ro^訓) Gr87菌株采用常规固体发酵及提取分离的方法，可以获得6种对松材 线虫有毒杀活性的化合物，这些化合物可单独或组合制备杀线虫生物 农药。可见，寻找对松材线虫有毒性作用的真菌已经逐渐成为研究的热点。使君子是传统的杀虫药用植物，自身能产生杀虫成分，基于植物 内生真菌能产生与其宿主相同或相似的活性成分这一观点，如果以使 君子植物内生真菌为筛选对象，应该可以获得对松材线虫有毒杀活性 的菌株，从而为线虫的生物防治奠定基础，目前尚未有相关报道。 发明内容本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种具杀线虫活性 的真菌ly/an'a sp. FDYS-1 。本发明的另一个目的在于提供由上述真菌X;^nb sp. FDYS-1的 代谢产物制备而得的生物制剂，该生物制剂具有较高的松材线虫致死 活性。本发明的另一个目的在于提供上述生物制剂的制备方法。 本发明的另一个目的在于提供上述真菌Xy/"n'a sp. FDYS-1及其代谢产物在松材线虫防治中的应用。本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的真菌J^/an'fl sp. FDYS-1分离自广州华南植物园栽培的使君子 (gw'WMa//""&caL.)健康叶片，该菌为子囊菌中炭角菌属Q^/aWa sp.)的菌株FDYS-1，在PDA培养基上菌落为纯白色，辐射状，表 面稍有褶叠，未见产孢结构，菌株的ITS序列与GenBank中登陆号 为EF423534.1的Xylaria sp.同源性达99%，菌株X少/an'a sp. FDYS-1 己于2008年1月25日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为 CCTCCNO: M 208025。一种生物制剂，是由杀线虫活性菌株^^n'a sp. FDYS-1经液体 发酵后提取制备而得，其制备方法为将X少/an^sp. FDYS-1接种至 pH为5 8的液体培养基，于26。C 29。C无光照条件下120 r/min振 荡培养3~5天，将含菌丝的发酵液放入离心管中，离心过滤除去菌丝， 收集滤液即得。上述液体培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基(PD)或马铃薯蔗 糖液体培养基(PS)。实验证明上述生物制剂对松材线虫有毒杀活性，对线虫的致死 率可达99%，且经12rC处理20min也不失活；真菌Xy/an'a sp. FDYS-1 产生毒杀松材线虫的活性物质的能力基本保持遗传稳定，连续继代6 代后对线虫的致死率仍达90.43%。因此，本发明的真菌^;/fln'asp. FDYS-1及其代谢产物(如上述 的由发酵培养液制备的生物制剂)可用于松材线虫的防治。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果l.本发明的生物制剂对松材线虫具有高致死活性，热稳定性好，经12rC处理20min也 不失活，而且该生物制剂来源环保无毒性，选择性强，对人畜安全， 对生态环境影响小；2.本发明采用的々/anb sp. FDYS-1菌株，其培 养条件要求低，且产生活性物质的能力基本保持遗传稳定，连续继代 6代后对线虫的致死率仍高达卯.43%，具有很好的开发应用前景。
图1为Xy/fln'a sp. FDYS-1在PDA培养基上的菌落正面图； 图2为X少/an'a sp. FDYS-1在PDA培养基上的菌落背面图； 图3为义>^;女sp. FDYS-1经不同培养液培养后滤液的杀线虫活性；图4为^/an'a sp. FDYS-1在不同培养温度下培养后滤液的杀线 虫活性；图5为J^/aWa sp. FDYS-1在不同初始pH值下培养后滤液的杀 线虫活性；图6为Xy/anh sp. FDYS-1在不同培养代数后滤液的杀线虫活性。
具体实施方式
各种培养基配方PDA培养基称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml 煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g葡萄糖和17 20g琼脂，充分溶 解后趁热纱布过滤，12rC灭菌20分钟后，冷却后贮存备用。 PD培养液马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000ml。 PS培养液马铃薯200g，蔗糖20g，水1000ml。PC培养液马铃薯200g，胡萝卜100克，水1000ml。 马丁氏培养液蛋白胨5g,葡萄糖10g， MgS04*7H20 0.5g，KH2P04lg，水1000ml。Czapek培养液蔗糖30g， NaN03 2g， K2HP04 1 g， MgS04'7H200.5g， KC10.5g， FeSO40.01g，水lOOOml。改良Fries 3号培养液蔗糖20g，酒石酸铵5g， NHtNOslg,KH2P04lg， MgS04.7H20 0.5g， NaClO.lg， CaCl2'2H20 0.13g，玉米浆lg，水lOOOml。实施例1 Xj^/nVi sp. FDYS-1的分离及其对松材线虫的活性 采集广州华南植物园使君子植物的健康叶片，自来水冲洗干净，晾干水分后剪成约1.5x1.5cm的小块，进行表面消毒，其具体步骤如 下先用70%酒精漂洗30s，再用0.1%升汞漂洗lmin，接着再用70% 酒精漂洗30s后，无菌水冲洗4次，在无菌滤纸上吸干水分即可。采用漂洗液检验法和组织印迹法检验表面消毒效果漂洗液检验 法即吸取最后一次无菌水冲洗的冲洗液0.2mL，涂布于PDA平板上； 组织印迹法即用灭过菌的镊子将经上述表面消毒的材料移植至PDA 平板上，接触5min后取出。处理后的PDA平板于于26士rC无光照 条件下培养7d后，若发现皿中无菌落出现，证明材料表面消毒彻底； 否则，需重新分离。将上述表面消毒处理过的材料在无菌状态下剪切成0.5x0.5cm的 小块(剪去0.5cm的边缘)，并移植于含链霉素(0.05mg/ml)的PDA 培养基上，于26土rC无光照条件下培养，待组织块边缘有菌丝长出后，及时挑取菌丝尖端转入PDA平板上获得纯培养。经多次分离，得到多株纯菌，纯菌经过接种至PD培养液中，于25。C无光照条件下120r/min振荡培养5d，过滤除去菌丝，获得培养 滤液。采用触杀法检测滤液对松材线虫的致死活性取2mL滤液加入 小培养皿(d=3cm)中，然后用胶头滴管加入供试松材线虫30~50条， 置25。C培养箱中培养，分别于24h和48h后，用连续变倍体视显微 镜检査线虫死亡情况，并将处理后僵直不动的虫体转入清水中，如 4h后线虫不能恢复活动，则记为死亡。经比较筛选，最后得到一株 对松材线虫具有高致死活性的菌株FDYS-1 ，该菌在PDA培养基上的 菌落为纯白色(如图1、 2所示)，辐射状，表面稍有褶叠，未见产孢 结构，其培养滤液对松材线虫的致死活性可达99%，该菌经ITS序列 分析鉴定，其ITS序列与GenBank中登陆号为EF423534.1的Xy/an'a sp.同源性达99%。因此，本实施例分离得到的一株对松材线虫具有高致死活性的菌 株FDYS-1属于炭角菌属(JT，/n'a sp.)，命名为J^/an'a sp. FDYS-1 ， 并于2008年1月25日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为 CCTCCNO: M 208025。实施例2培养条件对J^/flWfl sp. FDYS-1活性物质产生的影响1、培养液的选择将^^Wa sp. FDYS-1分别接种至马铃薯葡萄糖培养液(PD)、马铃薯蔗糖培养液(PS)、马丁氏培养液、Czapek培养液、含20%马铃薯汁的Czapek培养液和改良Fries 3 号培养液等7种液体培养基中，于25'C黑暗条件下120r/min振荡培 养5d，制备培养滤液并以触杀法检测滤液对松材线虫的致死活性。结论如图3所示，Zy/an'a sp. FDYS-1在7种液体培养基中均 能生长和产生杀线活性物质，但不同培养基得到的培养滤液，其杀线 虫活性强弱差异明显，PD和PS的培养滤液的杀线虫活性最强，分别 达95.67%和95.29%;菌株在PD和PS中生长也最好，培养5d后菌 丝干重分别达7.556 g/L和7.533 g/L。2、 培养温度的选择以PD培养液为供试培养基，接种J^/an'" sp. FDYS-1后分别于 20°C、 23°C、 26°C、 29°C、 32。C黑暗条件下120r/min振荡培养5d， 制备培养滤液并以触杀法检测滤液对松材线虫的致死活性。结论如图4所示，Zy/ar/a sp. FDYS-1在20。C 32。C条件下可以 产生杀线虫活性物质，但产毒的最适温度为26。C 29t:，在此温度范 围内培养，菌株培养滤液的杀线虫活性可达93.35%~96.41%。3、 培养基pH的选择以PD培养液为供试培养基，用lmol/L HCL和lmol/LNaOH将 其初始pH值分别调为3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11，以培养基自 然pH值(6.4)为对照，接种后于26。C黑暗条件下120r/min振荡培 养5d，制备培养滤液并以触杀法检测滤液对松材线虫的致死活性。结论如图5所示，初始pH值为5~8时有利于Z;^n'a sp. FDYS-1菌株产生杀线虫活性物质，初始pH值过高或过低均不利于活性物质 的产生，当pH为ll时，菌株不能生长。根据本实施例可得出由Zy/^^ sp. FDYS-1菌株制备毒杀松材线 虫生物制剂的方法为将Xj^W" sp. FDYS-1接种至马铃薯葡萄糖液 体培养基(PD)或马铃薯蔗糖液体培养基(PS)中，培养基的pH为 5 8，于26。C 29。C无光照条件下120r/min振荡培养5d，将含菌丝 的发酵液放入离心管中，离心过滤除去菌丝，收集滤液即为毒杀松材 线虫的生物制剂。实施例3 J^/wVi sp. FDYS-1产杀线虫活性物质的遗传稳定性 及活性物质的热稳定性将X少/^7'a sp. FDYS-1连续继代培养6代，再制备培养滤液及检 测其对松材线虫的致死活性。结论由图6所示，sp. FDYS-1连续继代培养6代后， 其培养滤液的杀线虫活性基本保持不变，对松材线虫的致死率仍高达 90.43%。将J^/an'a sp. FDYS-1培养滤液分别于60、 70、 80、 90、 100°C 水浴中处理20、 30、 40、 50、 60min以及121。C高压灭菌处理20 min， 用无菌蒸馏水补足损失水分后，检测杀线活性。测定结果表明，菌株 ^;/an'asp. FDYS-1培养滤液杀线虫活性的热稳定性较好，经121。C处 理20min也不失活。综上所述可以看出，^^nh sp. FDYS-1菌株产生活性物质的能力基本保持遗传稳定，且培养滤液经12rC处理20min也不失活，热 稳定性好，X少/an'a sp. FDYS-1是一株具有较好开发应用前景的杀线 虫活性菌株。
权利要求
1. 一种真菌Xylaria sp.FDYS-1，该菌株属于炭角菌属，于2008年2月25日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNOM 208025。
2、 权利要求1所述真菌制备的生物制剂，其特征在于该生物制 剂是由真菌X乂"W"sp. FDYS-1经液体发酵培养后提取制备而得。
3、 权利要求2所述生物制剂的制备方法，其特征在于包括如下 步骤将J^/腦'asp.FDYS-l接种至液体培养基中，无光照条件下培 养，培养结束后，将含菌丝的发酵液离心过滤除去菌丝，收集滤液即 得。
4、 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述液体培养 基为马铃薯葡萄糖液体培养基或马铃薯蔗糖液体培养基。
5、 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述培养基的 pH为5 8，培养温度为26°C 29°C。
6、 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述振荡培养 的频率为120r/min。
7、 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述培养时间 为3 5天。
8、 权利要求1所述真菌Xy/an'a sp. FDYS-1或其代谢产物在防治 松材线虫中的应用。
全文摘要
本发明公开一株真菌Xylaria sp.FDYS-1及其制备的生物制剂与在防治松材线虫中的应用。真菌Xylaria sp.FDYS-1，于2008年2月25日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NOM208025。本发明将Xylaria sp.FDYS-1接种至马铃薯葡萄糖液体培养基或马铃薯蔗糖液体培养基中，培养基的pH为5～8，培养温度为26℃～29℃，无光照条件下培养3～5天后，将培养液离心过滤，收集滤液即得生物制剂，该生物制剂对于松材线虫具有高致死活性，且热稳定性好，来源环保无毒性，选择性强，对生态环境影响小。本发明的菌株Xylaria sp.FDYS-1的培养条件要求低，产生活性物质的能力基本保持遗传稳定，具有很好的开发应用前景。
文档编号C12R1/645GK101260370SQ200810027690
公开日2008年9月10日 申请日期2008年4月25日 优先权日2008年4月25日
发明者向梅梅, 姜子德, 袁永平 申请人:仲恺农业技术学院