真菌中一种控制侵染钉形成效率的新基因MgPPF5及其用途的制作方法

专利名称：真菌中一种控制侵染钉形成效率的新基因MgPPF5及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物基因工程和植物保护领域中一种控制侵染钉形成的基因。
背景技术：
梨孢菌(Magnaporthe grisea)是子囊菌亚门的真菌，能侵染水稻、小麦、大麦、粟以及其它多种禾本科植物，尤其是该菌侵染水稻引起的稻瘟病在世界各个栽培稻区每年均有发生，危害广泛、严重。一般情况下，稻瘟病的危害可使水稻减产5-10％，重病田可导致水稻绝收。稻瘟病在我国曾多次流行，也是我国水稻的主要病害之一。1993年，稻瘟病在我国发生大流行，在全面防治的情况下仍然减产上百亿斤。梨孢菌还可侵染钝叶草、狗牙草、假俭草等属的草坪草，造成大面积枯死，是草坪草常见病害。
M.grisea具有特异的、形态分化的侵染结构膨大的、半球型的附着胞、侵染钉以及随后形成的侵染菌丝等。分生孢子是稻瘟病流行的主要传播体，在稻瘟菌的再次侵染和病害流行过程中起着至关重要的作用。在合适的环境条件和遗传特性下，自身的营养物质就能够使分生孢子萌发、形成芽管、附着胞、侵染钉并完成侵入寄主细胞的整个过程。但是这以过程需要一系列的信号调节。芽管前端附着胞的形成依赖于其所接触表面的理化性质如疏水性、表面硬度、角质单体、蜡质和极性脂类等(Dean R.A.Signal pathways and appressoriummorphogenesis.Ann.Rev.Phytopathl.1997，35211～234)。在亲水表面如玻璃或一种叫Gelbond的(FMC Bioproducts，Maine)亲水面，芽管只能呈典型的营养生长。稻瘟菌在与水稻叶表具有相似结构的表面也能形成附着胞，但是附着胞形成只与固体基物硬度有关(Hamer J.E.，Howard R.J.，Chumley F.G.et al.A mechanism for surface attachment in spores of a plantpathogenic fungus.Science.1988，239288～290.)，接触基物的疏水性在形成附着胞中起的作用有待深入研究。cAMP是在真核和原核生物中普遍存在的第二信使分子，它的作用靶标是蛋白激酶A(PKA)的调节亚基，能够调节真菌的代谢和形态构成。在稻瘟菌中，cAMP调节菌丝的顶端生长、细胞接合、碳代谢并且在致病性中发挥重要作用(Kronstad，J.W.Virulence andcAMP in smuts，blast and blights.Trends Plant Sci.1997，2193～199)。cAMP和它的同系物都能够在非诱导性基质表面诱导稻瘟菌附着胞的正常形成，表明cAMP信号调控参与了附着胞形成的部分途径(Lee Y.H.，Dean R.A.cAMP regulates infection structure formation in the plantpathogenic fungus Magnaporthe grisea.Plant Cell.1993，5(6)693～700)。cAMP直接作用的靶标是CPKA编码的cPKA(依赖于cAMP的蛋白激酶A)，该酶是稻瘟菌从芽管开始向附着胞分化所必需的。真核细胞内的膨压受一个保守的分裂素激活蛋白激酶(MAPK)信号系统调控，在附着孢形成过程中，该信号系统在cAMP信号系统下游起作用，参与附着孢的形成和随后的侵染过程。在稻瘟菌中，编码MAPK的基因有3个PMK1、OSM1和MPS1，它们均在侵染过程中起重要作用(Thines E.，Weber R.，Talbot N.J.MAP kinase and protein kinaseA-dependent mobilization of triacylglycerol and glycogen during appressorium turgor generationby Magnaporthe grisea.Plant Cell.2000，121703～1718)。
糖代谢是真核生物代谢中一个重要组成部分，甘露糖酰基转移酶(Mannosyltransferase)是近年研究较多的一个热点。它和其它蛋白一起形成蛋白复合体，定位在细胞内质网上，参与低聚糖的生物合成和蛋白质的修饰。该酶的突变会引起真核生物糖代谢紊乱、影响细胞壁的形成，造成真菌毒性减弱等缺陷。目前在梨孢菌中有关该酶的研究报道很少，主要集中在白色假丝酵母和其他一些真菌上。
糖基磷脂酰肌醇是酵母菌生存必需的一种成分，而且在酵母细胞壁形成中起重要作用。SMP3基因在酵母中编码甘露糖酰基转移酶基因，2004年Stephen J.Grimme报道该基因的缺陷会阻碍糖基磷脂酰肌醇的装配，进而造成白色假丝酵母的生长和细胞壁合成的缺陷(Stephen J.Grimme，Paul A.Colussi，Christopher H.Taron and Peter OrleanDeficiencies in the essential Smp3 mannosyltransferase blockglycosylphosphatidylinositol assembly and lead to defects in growth and cell wallbiogenesis in Candida albicans，Microbiology 150(2004)，3115-3128)。甘露糖酰基转移酶在白色假丝酵母黏附人的体表和产生毒性的过程中起重要作用，基因被破坏后，在单层PAEC介质上，35％的野生型菌株能够黏附45分钟，而突变体只有13～25％(ClaudiaTimpel，Sigrid Zink，Sabine Strahl-Bolsinger，Klaus Schrppel，and Joachim Ernst。Morphogenesis，Adhesive Properties，and Antifungal Resistance Depend on the Pmt6Protein Mannosyltransferase in the Fungal Pathogen Candida albicans Journal ofBacteriology，June2000，Vol.182，No.11，p.3063-3071)。Lynn M.Thomson等(LynnM.Thomson，Steven Bates，Soh Yamazaki，Mikio Arisawa，Yuko Aoki，and Neil A.R.Gow Functional Characterization of the Candida albicans MNT1 MannosyltransferaseExpressed Heterologously in Pichia pastoris J.Biol.Chem.，2000，Vol.275，Issue25，18933-18938，June23)利用该酶在甲基营养酵母中的不同表达，证明它能够利用Mn2+和Zn2+，专一催化α-甲基甘露糖苷和α-1，2-甘露糖合成受体。N端和跨膜区不是活性必需部分，在基本不影响转录的情况下，破坏C端会破坏它的活性。
Takuji Oka的报道指出，在曲霉菌中，甘露糖酰基转移酶和O-甘露糖酰基化反应的引发有关，该基因的破坏会引起不正常的细胞形态建成，改变碳水化合物的成分，造成细胞壁中多聚糖骨架的减少，是曲霉菌形成正常细胞壁必不可少的成分(Takuji Oka，TetsuHamaguchi，Yuka Sameshima，Masatoshi Goto and Kensuke Furukawa Molecularcharacterization of protein O-mannosyltransferase and its involvement in cell-wallsynthesis in Aspergillus nidulans Microbiology 150(2004)，1973-1982)。
梨孢菌的侵染过程是一个多基因控制的，有多种信号调控参与的复杂系统。而糖代谢作为真核生物代谢的一个重要组成部分也发挥了重要作用，研究该代谢途径对梨孢菌侵染性的影响，将有助于搞清楚和梨孢菌致病性相关的分子机制，寻找可以作为杀菌剂靶标的蛋白及其基因，为新型农药的设计和筛选奠定基础。

发明内容
本发明的目的是提供真菌中一种控制侵染钉形成的基因，在梨孢菌该基因为MgPPF5。MgPPF5基因编码的蛋白质与已报道的真菌甘露糖酰基转移酶具有(Mannosyltransferase)序列相似性，该基因的突变导致梨孢菌侵染钉形成率降低，且在感病水稻品种上的致病力减弱。MGPPF5是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №3；2)将序列表中SEQ ID №3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与真菌甘露糖代谢及致病性相关的蛋白质。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
MGPPF5的编码基因(MgPPF5)也属于本发明的保护范围。其特征为具有下列核苷酸序列之一的多核苷酸序列1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №3蛋白质序列的多核苷酸，或者编码SEQ ID №3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的蛋白质的多核苷酸。
3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中的序列1由3238个碱基组成，其编码区位于序列1的2473位到3198位碱基之间。
本发明还提供了MgPPF5的cDNA基因，其特征为具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №3蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
含有MgPPF5基因的表达载体，细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增MgPPF5基因中任一片段的引物也在本发明的保护范围之内。
本发明证明了MgPPF5基因的突变导致梨孢菌形成侵染钉以及侵染菌丝的能力减弱，侵染菌丝的扩展能力下降，并且在亲和性水稻品种上的致病力减弱。筛选能够破坏掉该基因表达、剪切及其产物的表达、修饰与定位的药物，是本发明的一个重要用途。MgPPF5的核苷酸序列和MGPPF5的氨基酸序列可以作为靶位点应用于抗真菌药剂(特别是抗梨孢菌药剂)的筛选和设计中，也可以以该核苷酸序列的某一区段作为探针在梨孢菌中分离该序列，也可以用于筛选、分离其它真菌的与该基因具有一定序列同源性的序列。
本发明证明梨孢菌MgPPF5的变异可使侵染钉和侵染菌丝减少，并导致致病力显著减弱。
因此，可利用该基因与致病性变异的相关性筛选杀菌剂。


图1为野生菌株P131与突变体MO2393在洋葱皮上侵染钉形成情况的比较。
图2为野生菌株P131与突变体MO2393在洋葱皮上侵染菌丝形成情况的比较。
图3为野生菌株P131与突变体MO2393在亲和性水稻丽江新团黑谷叶片上形成病斑比较图4为插入质粒pV4在染色体上的插入方式5为MO2393的互补载体质粒图谱图6为MO2393的敲除载体质粒图谱图7为野生菌株P131与互补转化体CMO2393-1在洋葱皮上侵染钉形成情况的比较图8为野生菌株P131与互补转化体CMO2393-1在洋葱皮上侵染菌丝形成情况的比较图9为野生菌株P131与互补转化体CMO2393-1在亲和性水稻丽江新团黑谷叶片上形成病斑比较图10为突变体MO2393的互补转化子的southern杂交验证M为分子量标准物，1为P131，2为MO2393，3为CMO2393-1，4到9为CMO2393-2到CMO2393-7图11为野生菌株P131与敲除转化体QMO2393-1在洋葱皮上侵染钉形成情况的比较。
图12为野生菌株P131与敲除转化体QMO2393-1在洋葱皮上侵染菌丝形成情况的比较图13为野生菌株P131与敲除转化体QMO2393-1在亲和性水稻丽江新团黑谷叶片上形成病斑比较图14敲除转化子以contig2.1486第1700到2681位碱基序列为探针的southern杂交验证M为分子量标准物，1为P131，2为QMO2393-1，3到6为QMO2393-2到QMO2393-5，7为异位插入转化子对照图15敲除转化子以潮霉素磷酸转移酶基因序列为探针的southern杂交验证。
M为分子量标准物，1为P131，2为QMO2393-1，3到6为QMO2393-2到QMO2393-5，
7为异位插入转化子对照图16MGPPF5与其他真菌中同源蛋白的亲缘关系。图示说明GZPPF5、NCPPF5和ASPPF5分别为玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)中的MgPPF5同源蛋白质，具体实施方式
为了更好的理解本发明，以下通过实例予以进一步地说明，但并非对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、和甘露糖代谢相关并影响梨孢菌侵染钉形成蛋白MgPPF5及其编码基因的获得1.突变体的筛选与鉴定1)分生孢子的制备将梨孢菌菌株P131的各REMI转化体的菌丝充分打断，均匀地涂布到西红柿汁燕麦片培养基(每升含150ml西红柿汁、30-50克燕麦片煮沸30分钟过滤取滤液、20克琼脂)平板上，26℃～28℃培养，当肉眼可见新生菌丝长出培养基表面时，用棉签轻轻将菌丝洗下，并用水冲洗干净菌落表面，盖上单层纱布，于26℃～28℃光照培养48小时，在培养基表面即可见大量的梨孢菌孢子。
2)侵染钉及侵染菌丝形成减少突变体的筛选选择紫色、扁园、较小的新鲜洋葱，用无菌的手术刀切开。把洋葱的内表皮切割成1×1平方厘米的小块，用宽头镊子小心地从边缘撕下，正面朝上平铺在1.6％的水琼脂平皿上。用无菌水配制5×104的新鲜孢子悬浮液，点接在洋葱皮上。28℃避光保湿培养。36小时后在放大倍数为10×40的显微镜下观察梨孢菌菌株浸染钉和侵染菌丝的形成情况，获得了一个突变体MO2393。该突变体和野生型的梨孢菌P131相比，侵染钉以及侵染菌丝形成百分率大大下降，其侵染钉及侵染菌丝形成率和野生型相比较见表1。图1和图2为该数据的柱形图表示。
3)致病性的鉴定采用步骤2所述的方法培养梨孢菌的分生孢子，孢子洗下后用双层擦镜纸过滤于50毫升的离心管中，4000转/分钟室温离心5分钟收集孢子，然后悬浮于0.25‰(体积比)的吐温20水溶液中。调整分生孢子浓度到每毫升5×104个孢子，均匀地喷雾接种于五叶一心期的亲和性水稻品种丽江新团黑谷幼苗的叶片正面。
表1.P131、MO2393在洋葱表皮上形成侵染钉和侵染性菌丝的形成率


在亲和性水稻品种丽江新团黑谷叶片上，该突变体的致病力也比野生型的低，野生菌株P131与突变体MO2393在亲和性水稻丽江新团黑谷叶片上形成病斑如图3所示。
2.突变体表型变化与插入标记共分离分析用遗传杂交的方法对突变体中插入标记潮霉素抗性基因与突变表型的共分离进行分析，将此突变体分别与一个不具有突变表型和潮霉素抗性，并且交配型相反的梨孢菌菌株S1528进行杂交，分析其子囊孢子后代形成侵染钉及侵染菌丝的能力以及潮霉素抗性情况，具体方法如下将上述突变体分别与不具有潮霉素抗性、分生孢子形态正常的梨孢菌菌株S1528在西红柿燕麦片培养基上进行对峙培养。首先于25℃培养至两者菌落边缘即将接到一起但是没有接触的时候，将其移至20℃光照培养，约20天左右在菌落的交界处形成黑色突起的子囊壳。挑取成熟的子囊壳，于无菌水中轻轻挤破，释放壳内的子囊，将子囊悬浮液涂在水琼脂平板上，25℃培养24小时后挑取子囊内子囊孢子萌发的单根菌丝于西红柿燕麦片培养基上培养。统计这些子囊孢子后代的潮霉素抗性和形成侵染钉以及侵染菌丝的能力。结果如表2所示，表明在测定的子囊孢子后代中，侵染钉以及侵染菌丝形成能力下降的后代都具有潮霉素抗性，说明该突变体形成侵染钉能力下降的表型与插入标记潮霉素抗性基因是共分离的。
表2.S1528与突变体MO2393杂交后代的潮霉素抗性和侵染能力鉴定

3.与梨孢菌侵染钉及浸染菌丝形成能力降低有关的MgPPF5基因的克隆1)粒拯救通过对突变体中插入质粒的拯救，获得了相应的插入位点侧端的基因组序列，确定了突变体中质粒的插入位置。具体方法如下选取插入质粒pV4(Lu，S.，Lyngholm，L.，Yang，G.，Bronson，C.，Yoder，O.C.1994.Tagged mutants at the Toxl locus of Cochliobolus heterostrophus by restrictionenzyme-mediated integration.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 911264-12653)中pUC18部分的限制性内切酶HindIII和KpnI完全消化突变体的基因组。酶切产物用乙醇沉淀并纯化后用T4DNA连接酶进行自连接，转化大肠杆菌的感受态细胞JM109。提取转化子质粒，并进行酶切鉴定。酶切鉴定正确的质粒中除含有pV4中pUC18部分的序列外，还含有部分插入位点侧端的基因组的序列。对鉴定正确的两个质粒进行测序然后在数据库中检索所获得的序列，分析插入位点附近的基因的范围和可能的外显子。结果表明在突变体中，质粒插入在一个限制型内切酶XhoI的酶切位点处，对应于SEQ ID NO.1中的第2640位。通过对拯救到的质粒进行酶切分析得知质粒pV4是在染色体上串连重复一共两个拷贝插入的，且插入方向一致，其在染色体上插入位置和方向见图4。
质粒拯救过程中涉及到的限制性内切酶和T4DNA连接酶由宝生物工程(大连)有限公司生产，参照使用说明书使用。
2)基因的预测首先将该突变体MO2393中质粒插入位点所在的contig2.1486在国际稻瘟菌基因组协会的官方网站(http://www.riceblast.org/)中进行基因预测，结合网站(http://www.softberry.com/berry.phtml)的分析结果，质粒的插入位点在负链上一个预测的MgPPF5的基因组基因(梨孢菌基因组数据库中contig2.1486的第1427的核苷酸至第4664位的核苷酸)中。根据国际稻瘟菌基因组协会的官方网站中对这个基因的分析，contig2.1486中两个限制性内切酶HindIII位点(从contig2.1486的第516位的核苷酸至第5248位的核苷酸)之间的序列包含对这个基因所预测的范围，而且除了这个基因外不再包括别的完整基因。
3)基因组TAC文库的筛选将获得的侧端序列与国际稻瘟菌基因组协会的官方网站(http://www.riceblast.org/)已公布的梨孢菌的基因组数据库比较，这两个插入位点都位于第1号染色体的contig2.1486。以这两个位点之间的一段1142bp的DNA片断(序列4)为探针，筛选梨孢菌P131的基因组TAC文库(其平均克隆片段大小为50kb，共覆盖全基因组的16-18倍，该基因组TAC文库按照文献魏士平等(Construction and Evaluation of a TACLibrary of Magnaporthe grisea，植物病理学报，2003，3357-62)描述的方法构建)，获得七个阳性克隆，它们都包括MgPPF5的基因组基因(SEQ ID NO.1所示的第1位到第1146位的核苷酸序列)。
实施例2、MgPPF5及其编码基因功能的确认本发明采用互补实验和基因置换实验来确认MgPPF5基因的。在这部分内容中包括互补载体和基因置换载体的构建以及将上述两类载体导入梨孢菌中，得到梨孢菌的重组转化体。互补载体的构建是指将包含预测的MgPPF5的全长的基因组基因的DNA序列片断(梨孢菌基因组数据库中contig2.1486的第512位的核苷酸至第5648位的核苷酸)与一个带有新霉素抗性基因的载体相连，在这里新霉素抗性基因并不是对本发明的限制，其他能导致抗生素抗性的基因，即潮霉素抗性基因之外的导致真菌抗性的基因都可以达到同样的效果。互补载体所导入的梨孢菌受体菌株为该突变体即梨孢菌MO2393。基因置换载体的构建是指将包括预测的MgPPF5的大部份基因组序列(梨孢菌基因组数据库中contig2.1486的第809位的核苷酸至第3356位的核苷酸)连入一个载体中，然后用潮霉素抗性基因替换掉MgPPF5的基因组基因的大部分。基因置换载体所导入的梨孢菌菌株是野生型梨孢菌P131，基因置换载体通过基因两侧的侧翼序列与野生型菌株基因组的相应序列发生同源重组，从而将基因组中相应位点MgPPF5的基因组基因大部分序列与潮霉素基因置换。
1.互补载体和敲除载体的构建1)互补载体的构建首先合成带有限制性内切酶XbaI识别序列的引物从克隆质粒载体pS65T-C1(gi1019893)中扩增出新霉素磷酸转移酶基因(neu)连入pBlueScriptKS(+)的限制性内切酶切位点XbaI间，得到的质粒载体命名为KN。然后从实施例1中步骤三的1中所得到的阳性克隆中用限制性内切酶HindIII切下包含有预测的MgPPF5的基因组基因(梨孢菌基因组数据库中contig2.1486的第516位的核苷酸至第5248位的核苷酸)的DNA片断，和用同样限制性内切酶HindIII酶切的KN连接，得到包含有预测的MgPPF5的基因组基因(梨孢菌基因组数据库中contig2.1486的第516位的核苷酸至第5248位的核苷酸)和选择标记新霉素磷酸转移酶基因的互补载体pKNMT。构建过程中涉及到的限制性内切酶和连接酶，末端补平酶由宝生物工程(大连)有限公司生产，参照使用说明书使用。互补载体质粒图谱见图5。
2)敲除载体(基因置换载体)的构建。
根据国际稻瘟菌基因组协会的官方网站中所预测的MgPPF5的基因组基因的外显子-内含子的结构，结合结合网站(http://www.softberry.com/berry.phtml)的分析结果，从contig2.1486的第1458位的核苷酸至第2734位的核苷酸之间的序列能包括MgPPF5的基因组基因的大部分功能域(包括序列1的1931到3207位的序列)而不包括任何别的基因。
一方面从实施例1中步骤三的1中所得到的阳性克隆中用PCR方法在contig2.1486的第809位的核苷酸至第1458位的核苷酸序列上引入SpeI和HinaIII切点，在contig2.1486的第2734位的核苷酸至第3356位的核苷酸序列上引入KpnI和XhoI切点，分别与同样限制性内切酶酶切的KN连接；另一方面用限制性内切酶SalI从质粒载体pUCATPH中切下潮霉素磷酸转移酶基因(hyg)与同样限制性内切酶切的上步质粒连接，得到基因置换载体pPMT，这样质粒载体pKNS中的预测的MgPPF5的基因组基因(梨孢菌基因组数据库中contig2.1486的第1458位的核苷酸至第2734位的核苷酸)的大部份序列就被潮霉素磷酸转移酶基因所代替，在潮霉素磷酸转移酶基因的两侧分别留下649bp和622bp的MgPPF5基因组基因的侧端序列。敲除载体质粒图谱见图6。
2.梨孢菌的转化。
梨孢菌的转化首选REMI的方法。REMI的原意为限制性内切酶介导的整合，采用不破坏载体内基因的限制性内切酶将载体线性化，在限制性内切酶的介导下转化梨孢菌的原生质体，被转化的质粒随机的整合到基因组中相应的限制性内切酶的切点处。在本发明中，梨孢菌的转化中省略了限制性内切酶的应用，转化效率会比添加限制性内切酶的方法低，但不影响被转化质粒整合到基因组中。原生质体的制备和转化方法如下1)原生质体的制备500毫升三角瓶装入150毫升液体CM培养基(酵母提取物0.1％，酶水解干酪素0.05％，葡萄糖1％，硝酸钙0.1％，磷酸二氢钾0.02％，硫酸镁0.025％，氯化钠0.015％)，分别接入梨孢菌P131和MO2393的1×106个分生孢子，在26-28℃、100转/分钟条件下摇培30-32小时，三层灭菌擦镜纸过滤收集菌丝体，菌丝体用0.7M氯化钠溶液充分洗涤后转移至灭菌的50毫升离心管中，每1克菌丝加入1毫升的崩溃酶渗透液(含20毫克/毫升崩溃酶，用0.7M氯化钠配制)，26-28℃、100转/分条件下酶解3-4小时后，用0.7M氯化钠洗涤菌丝体，经三层灭菌擦镜纸过滤，收集原生质体，4,000转/分离心15分钟，先用25毫升STC(1.2 M山梨醇，10mM Tris-Cl，pH7.5，50mM氯化钙)洗涤原生质体一次，然后分别用10毫升STC洗2次，离心沉淀后用STC将原生质体浓度调至0.5-1×108个/毫升。
2)梨孢菌转化分别将梨孢菌P131和MO2393原生质体分装于灭菌的50毫升离心管中，每管150微升，分别加入等体积的线性化的质粒载体(约2微克，梨孢菌P131的离心管中加入用限制性内切酶KpnI线性化的基因置换载体pPMT，梨孢菌X54、H3035和H3587的离心管中分别加用限制性内切酶SmaI线性化的互补载体pKNMT，用STC溶液补足体积)，冰上放置20分钟，然后逐滴缓慢加入2毫升/管PTC溶液(60％聚己二醇3350，10mM Tris-cL pH7.5，50mM氯化钙)，冰上静止20分钟，加入25毫升/管冰冷的STC，缓慢混匀，4,000转/分钟、4℃离心15分钟，去上清，然后每管加入3毫升的LR培养基(0.1％酵母提取物，0.1％酶水解干酪素，1M蔗糖)，室温静置培养12-13小时后，转入培养皿，加入12毫升冷却至50℃的SR(LR+1.6％琼脂)，混匀，待其凝固吹干后，上面铺一层12毫升的0.7％上层琼脂(冷却至50℃，含400微克/毫升的G418(互补实验)或300微克/毫升的潮霉素(美国Roche公司生产，基因置换试验)。28℃培养4-6天，将出现的转化体(梨孢菌突变体MO2393的互补转化体为CMO2393；梨孢菌P131的基因置换转化体QMO2393)转至固体CM培养基(0.6％酵母提取物，0.3％酶水解干酪素，0.3％酸水解干酪素，1％的蔗糖，1.6％琼脂)(含400微克/毫升的G418(互补实验)或250微克/毫升的潮霉素(基因置换试验)上，二次筛选后将单个菌落转入燕麦片番茄培养基上培养，并进行单孢分离。
互补载体在突变体基因组中的异位整合使该突变体的致病力恢复到野生型的水平，包括在洋葱表皮上的侵染钉和侵染性菌丝的形成率，以及在亲和性水稻品种丽江新团黑谷叶片上形成病斑的数。互补实验获得多个转化子，表型都得到了恢复。互补转化体CMO2393接种洋葱表皮上形成侵染钉和侵染性菌丝的比率及与野生型菌的比较如表3所示；图7和图8为其柱形图所示。野生菌株P131和其中一个互补转化体CMO2393-1都能正常侵染亲和性水稻品种丽江新团黑谷叶片，侵染情况如图9所示。限制性内切酶SalI在congtig2.1486的第68位、3234位和5954位有酶切位点，用该酶酶切处理转化子总DNA，以contig2.1486第809位到1458位序列作探针进行分子杂交，结果见图10。野生型P131有一条约3.2Kb的信号带、突变体MO2393和互补转化子都有一条大小约2.0Kb的带而且互补转化子还有另外大小不同的信号带，表明他们的插入位点基本是不同的。
基因置换试验通过把MgPPF5的部分基因组基因序列置换为潮霉素磷酸转移酶基因序列导致转化体QMO2393的致病力减弱。实验获得5个敲除转化子，它们在洋葱表皮上的侵染钉和侵染性菌丝的形成率均以及在亲和性水稻品种丽江新团黑谷叶片上形成病斑的能力均下降到突变体水平上。其中，基因置换转化体QMO2393-1与野生型菌P131在洋葱表皮上接种后形成侵染钉和侵染性菌丝的情况如表4所示。图11和图12为其柱形图表示。野生菌株P131与基因置换转化体QMO2393-1对亲和性的水稻品种丽江新团黑谷的致病性比较如图13所示，表3.P131和CMO2393在洋葱表皮上形成侵染钉和侵染性菌丝的比率

和野生型菌株相比，敲除转化子形成的病斑数量大大下降。限制性内切酶ApaI在contig2.1486shang上的第705位、1629位、3064位和10179位碱基等处有酶切位点，以contig2.1486上第1700位到2681位碱基序列和潮霉素磷酸转移酶序列为探针进行分子杂交。结果见图14和图15，以contig2.1486第1700到2681位碱基作探针，野生型和异位插入转化子都有一条约1.4Kb的信号带，而敲除转化子由于序列被置换而没有任何信号带；以潮霉素磷酸转移酶纪基因序列为探针，五个敲除转化子和一个异位插入转化子都有一条信号带，敲除转化子的信号带大小约为3.4Kb。
表4.基因敲除转化体QMO2393与野生型菌P131在洋葱皮上侵染钉和侵染性菌丝的形成率

实施例3、其它植物病原真菌中MgPPF5同源蛋白的生物信息学分析对梨孢菌MgPPF5的氨基酸序列进行tBLAST检索分析，发现该蛋白在禾谷镰孢霉(Fusarium graminearum)、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)、黑穗病菌(Ustilago)、白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)等真菌中都存在与MgPPF5同源的蛋白质，经过FGENESH软件和网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)进行基因预测，获得上述真菌中MgPPF5的同源蛋白，其中新生隐球菌、黑穗病菌和白腐真菌同源蛋白和MgPPF5的同源性为100％。粗糙链孢霉、玉蜀黍赤霉和烟曲霉中同源序列与MgPPF5在氨基酸序列上的一致性分别为62％、55％和49％，其序列分别如SEQ ID NO5、6、7所示。
序列表<110>中国农业大学<120>真菌中一种控制侵染钉形成的基因MgPPF5及用途<160>7<211>3238<212>DNA<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)<400>1CGTAAATATA TGGGCGATGG TCAATTGTCA TTTTATGTAA TATCGAGGGA ACTAAAAAGT60CTGGATACTC ATTAATCTCT TTGATAAAAT TTCAAATTTC ATCTGCAAAC AATAAGAAAA120TGCCAAAGAT AGTGGTACTA GGGTAGGTTC ACCGTCCAAC ATGTATGACT ACACTGCACT180TCATAAATCA GTAGTGCTAA CACCATTCTT ATAAGGGCGG GTGTTTCGGG CCTTACTGCT240GCCCTTCTGC TTTCACGGAA CAAGGACAAT GATATCACGG TAATTGCAAA GCATATGCCT300GGCGACTATG ATATCGAATA TGCCTCACCA TGGGCAGGAG CCAATGTCTT GCCGTAAGAC360ACTATTTTAA TACGTTCAAT CAATGACCAT CGAGGCTCAA ATTTCCTGAT TAAGTCTTAG420ATGCGATTCG GGGAGGTCCG TTTAGATACT GACCCTGCTG CGCGCTCTCT CAGAATGAAC480ACCGTGGAAG ACAGCCGCTG GGAACGGCGG ACGTTTCCAG AGTTGAAGCG ACTGGCTGAA540GAGGTTCCCG AGGCCGGGAT ACACCTACTG AGTATGCATT TGTAGCCTCA AATCTAGCTG600GCCAAGACAC TGACTTGAGT TTCGACAGAG GTACGCTTGT TCCGACGCAC ACCTGCCTCG660GAAGACAACG AAACCCAGAC CGCGCTGGAC CCCATATTCG CCAAGGACCC ATGGTACAGC720GAAATGTTTG ACGACTTCCG AACCCTGAGC AAGGACGAGC TTCCTGACGG CGTGGTGTCC780GCCAACGAGT TCGGCTCCGT GTGCATCAAC ACGATGCTGT ACCTACCGTG GCTCGTAGGT840CAGTGCCGGG CCAACGGCGT CGTCTTCAAT CGCGCCAACC TCACCCACAT CGCCGAGGCG900GCAGCGCGTC ACCACAGCGG CGCCAAGGCA GACCTGGTCG TCAACGCGAC GGGCGTCACG960GCGTGCAAGC TGGGCGGCGT CATGGACGCG GCGGTGCAGC CCGCCAGGGG CCAGGTAGTC1020GTCGTGCGCA ACGAGCTCCC GCTCATGCTG GGCGCGACCC TGGCTGCCGA AGACGACGCA1080GAGCACCCGG ATGAGATGGT GTATTGCATG ACGCGAGCTG CGGGTGGAGG GACTGTCATT1140GGCGGGTGCT ACCAAAAGGG CAATTGGGAT CCAAACCCGG ATCCGAACCT GGCTGTGCGG1200ATCATGTCCC GCATGGTCGA ATTCTGGCCA GAGATTGCGG ACGGGAAGGG GGTTGCTGGC1260TTGGATGTCA TCCGTCACGG AGTTGGGCTG AGGCCGTACA GGGAGGGAGG TGTCAGGATA1320GAGAAGGAGA GGTTGAGTGA CGGGACGTGG GTTGTGCACA ATTATGGACA TGCGGGTTGG1380GGTTACCAGG GGTCCTATGG CTGCGCAGAG CGCGTGGTCG AGCTGGTCGA CGAGTCTTTT1440AAGGGAAAAC CGAAGCTGTA ATTAGTTGGT TCCTGTCTTG AAGAAGCAAT CGAGGTCTTG1500TAAATGTTTT TCTTTTTTTC CGAATGCCCT TCCTTCGTAA TACCTACCCT GCATGGAATT1560GATGCAACCC CACCACGATT CGACCCCTGA TCGAGACCTG GGCCCAGGCG GAAGCTCCCG1620TGTTTCGTCA TCAAGGAAGC TAACTGTCCA ACGGGAAACA CGACAACAGC AACATCAAAA1680CTCTATCCTG GTCAACTTTG CGGGCAACTT CGACTCTTAC GCAACTCCCC CGATGCGGAT1740GCATTGATCT GCAAAAATGG CTGCAGAAAG GCCGTCAACT CTGGGGAAAC CCGTTCAATT1800CGTCTTTGAT GTCGCAAATG GCCGACATCC TTTGTCGAGA GCCATCCCTC CAATGCTCTT1860AGCCTTTGAC GGTCTGCTCT GTGGCCTGAT CATCAAAAAG GTTCCCTGTC AGTTGCAGCT1920CACTTGGCAC TTTTTTTCTT CAAGCGCGAC TAATAACAGA AATCACTTGC TTCTGTAGAT1980ACCGAGATCG ACTGGACAAC GTACATGCAG CAAATAAAAC AATATGTTAC CGGCGAACGC2040GATTACACCA AAATTACTGG CAGCACCGGT CCTCTGGTCT ACCCAGCAGG CCACGTCTAC2100
ATCTACACAG GCCTGTACCA CATTACAGAT GAGGGAAGGA ATATCTTGTT TGCGCAGCAA2160TTGTTTGGTG CACTCTACCT ACTCACGCTA TACGTTGTCA TAGCGTGCTA CCGAAAGGCA2220AAGGTGCGAT AACGTTGCTC GCCGTCATGA CAATTTCCAT ATTGATGTCC AAGCTAACAA2280ACAGGCATAT GGCAGGTTCC TCCCTATGTT CTCCCCCTCC TCGTCTTGTC GAAACGCCTC2340CACAGTATCT TTGTGCTACG ATGCTTCAAC GATTGCTTCG CCGTGCTCTT CTTCTGGCTC2400GCCATCTACT GCTTCCAACG CCGCGCTTGG TCCCTCGGAG GCGTCTTCTA CAGCTTCGGA2460CTGGGCATCA AGATGACCGT CCTGTTGTCT CTGCCCGCAG TGGGCGTTAT TCTCCTCCTC2520GGCCGCGGTT TCGGAGGCGC GCTAAACGTC GCATCGATCA TGGGCCAGCT CCAGGTTGCC2580ATCGGTCTTC CTTTCTTGTC CAAGAATGCA TGGGGGTACC TTAGCCGAGC ATTCGAACTC2640TCGAGGCAGT TCATGTTCAA GTGGACTGTC AACTGGCGCT TCGTCGGCGA GGAGACTTTC2700TTGAGCAAGC CCTTTGCCAT CACGCTGCTC GCGCTCCACG CATCTGTGTT GCTTGCCTTT2760GTCACGAAGC GGTGGCTCAA GCCTGCGAGC AAAAGCATTG GCGGGCTGAT CGCCCCTCTC2820CTCTCCGGGC GGCCAATATT TACAGCGGAA GAGGCCCAAA CGGCGGCGCG TGCAGTCACG2880CCAGAGTATG TCATGACGAC GATGCTGACG GCCAACATTG TTGGAATGCT ATTTGCGCGG2940TCGCTGCACT ACCAATTCTA CGCCTATCTA GCCTGGTCAA CCCCGTACCT GCTCTGGCGG3000AGCGGAATTC ATCCCCTGCT TCAATGGGGG CTGTGGGCCC TGCAGGAGTG GGCGTGGAAC3060GTCTACCCGA GCACGCCGGT GAGCTCTGGC GTCGTCGTCG GCGTGATGGC TATCACGGTG3120GGTGCGGTTA TGGTTGGGGC AAAGGCGGAG TTTAGACCCC AGGTACCCGT CGCGAAAAAG3180GTTGAAGCAA AGCGCTGAAC CTTCTGGCTT TCGCTGCGCA CGGAATATGA CGCATATA 3238<210>2<211>726<212>DNA<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)<400>2ATGACCGTCC TGTTGTCTCT GCCCGCAGTG GGCGTTATTC TCCTCCTCGG CCGCGGTTTC60GGAGGCGCGC TAAACGTCGC ATCGATCATG GGCCAGCTCC AGGTTGCCAT CGGTCTTCCT120TTCTTGTCCA AGAATGCATG GGGGTACCTT AGCCGAGCAT TCGAACTCTC GAGGCAGTTC180ATGTTCAAGT GGACTGTCAA CTGGCGCTTC GTCGGCGAGG AGACTTTCTT GAGCAAGCCC240TTTGCCATCA CGCTGCTCGC GCTCCACGCA TCTGTGTTGC TTGCCTTTGT CACGAAGCGG300TGGCTCAAGC CTGCGAGCAA AAGCATTGGC GGGCTGATCG CCCCTCTCCT CTCCGGGCGG360CCAATATTTA CAGCGGAAGA GGCCCAAACG GCGGCGCGTG CAGTCACGCC AGAGTATGTC420ATGACGACGA TGCTGACGGC CAACATTGTT GGAATGCTAT TTGCGCGGTC GCTGCACTAC480CAATTCTACG CCTATCTAGC CTGGTCAACC CCGTACCTGC TCTGGCGGAG CGGAATTCAT540CCCCTGCTTC AATGGGGGCT GTGGGCCCTG CAGGAGTGGG CGTGGAACGT CTACCCGAGC600ACGCCGGTGA GCTCTGGCGT CGTCGTCGGC GTGATGGCTA TCACGGTGGG TGCGGTTATG660GTTGGGGCAA AGGCGGAGTT TAGACCCCAG GTACCCGTCG CGAAAAAGGT TGAAGCAAAG720CGCTGA 726
<210>3<211>241<212>PRT<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)<400>3Met Thr Val Leu Leu Ser Leu Pro Ala Val Gly Val Ile Leu Leu Leu1 5 10 15Gly Arg Gly Phe Gly Gly Ala Leu Asn Val Ala Ser Ile Met Gly Gln20 25 30Leu Gln Val Ala Ile Gly Leu Pro Phe Leu Ser Lys Asn Ala Trp Gly35 40 45Tyr Leu Ser Arg Ala Phe Glu Leu Ser Arg Gln Phe Met Phe Lys Trp50 55 60Thr Val Asn Trp Arg Phe Val Gly Glu Glu Thr Phe Leu Ser Lys Pro65 70 75 80Phe Ala Ile Thr Leu Leu Ala Leu His Ala Ser Val Leu Leu Ala Phe85 90 95Val Thr Lys Arg Trp Leu Lys Pro Ala Ser Lys Ser Ile Gly Gly Leu100 105 110Ile Ala Pro Leu Leu Ser Gly Arg Pro Ile Phe Thr Ala Glu Glu Ala115 120 125Gln Thr Ala Ala Arg Ala Val Thr Pro Glu Tyr Val Met Thr Thr Met130 135 140Leu Thr AlaAsn Ile Val Gly Met Leu Phe Ala Arg Ser Leu His Tyr145150 155 160Gln Phe Tyr Ala Tyr Leu Ala Trp Ser Thr Pro Tyr Leu Leu Trp Arg165 170 175Ser Gly Ile His Pro Leu Leu Gln Trp Gly Leu Trp Ala Leu Gln Glu180 185 190Trp Ala Trp Asn Val Tyr Pro Ser Thr Pro Val Ser Ser Gly Val Val195 200 205Val Gly Val Met Ala Ile Thr Val Gly Ala Val Met Val Gly Ala Lys210 215 220Ala Glu Phe Arg Pro Gln Val Pro Val Ala Lys Lys Val Glu Ala Lys225 230 235 240Arg *<210>4<211>1392<212>DNA<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)<400>4CCTTCCTTCG TAATACCTAC CCTGCATGGA ATTGATGCAA CCCCACCACG ATTCGACCCC60
TGATCGAGAC CTGGGCCCAG GCGGAAGCTC CCGTGTTTCG TCATCAAGGA AGCTAACTGT120CCAACGGGAA ACACGACAAC AGCAACATCA AAACTCTATC CTGGTCAACT TTGCGGGCAA180CTTCGACTCT TACGCAACTC CCCCGATGCG GATGCATTGA TCTGCAAAAA TGGCTGCAGA240AAGGCCGTCA ACTCTGGGGA AACCCGTTCA ATTCGTCTTT GATGTCGCAA ATGGCCGACA300TCCTTTGTCG AGAGCCATCC CTCCAATGCT CTTAGCCTTT GACGGTCTGC TCTGTGGCCT360GATCATCAAA AAGGTTCCCT GTCAGTTGCA GCTCACTTGG CACTTTTTTT CTTCAAGCGC420GACTAATAAC AGAAATCACT TGCTTCTGTA GATACCGAGA TCGACTGGAC AACGTACATG480CAGCAAATAA AACAATATGT TACCGGCGAA CGCGATTACA CCAAAATTAC TGGCAGCACC540GGTCCTCTGG TCTACCCAGC AGGCCACGTC TACATCTACA CAGGCCTGTA CCACATTACA600GATGAGGGAA GGAATATCTT GTTTGCGCAG CAATTGTTTG GTGCACTCTA CCTACTCACG660CTATACGTTG TCATAGCGTG CTACCGAAAG GCAAAGGTGC GATAACGTTG CTCGCCGTCA720TGACAATTTC CATATTGATG TCCAAGCTAA CAAACAGGCA TATGGCAGGT TCCTCCCTAT780GTTCTCCCCC TCCTCGTCTT GTCGAAACGC CTCCACAGTA TCTTTGTGCT ACGATGCTTC840AACGATTGCT TCGCCGTGCT CTTCTTCTGG CTCGCCATCT ACTGCTTCCA ACGCCGCGCT900TGGTCCCTCG GAGGCGTCTT CTACAGCTTC GGACTGGGCA TCAAGATGAC CGTCCTGTTG960TCTCTGCCCG CAGTGGGCGT TATTCTCCTC CTCGGCCGCG GTTTCGGAGG CGCGCTAAAC1020GTCGCATCGA TCATGGGCCA GCTCCAGGTT GCCATCGGTC TTCCTTTCTT GTCCAAGAAT1080GCATGGGGGT ACCTTAGCCG AGCATTCGAA CTCTCGAGGC AGTTCATGTT CAAGTGGACT1140GT 1142<210>5<211>442<212>PRT<213>粗糙链孢霉(Neurospora crassa)<400>5Met Ala Ala Pro Ser Ser Arg Pro Glu Ser Asn Pro Pro Leu Tyr Lys1 5 10 15Gln Ala Leu Asp Phe Ala Leu Asp Val Ala Asn Gly Arg His Ala Leu20 25 30Ser Lys Leu Ile Pro Pro Ala Leu Phe Leu Val Asp Ala Leu Leu Cys35 40 45
Gly Leu Ile Ile Trp Lys Val Pro Tyr Thr Glu Ile Asp Trp Ala Ala50 55 60Tyr Met Glu Gln Val Ser Gln Ile Leu Ser Gly Glu Arg Asp Tyr Thr65 70 75 80Lys Val Arg Gly Gly Thr Gly Pro Leu Val Tyr Pro Ala Ala His Val85 90 95Tyr Ile Tyr Thr Gly Leu Tyr His Leu Thr Asp Glu Gly Arg Asn Ile100 105 110Leu Leu Ala Gln Gln Leu Phe Ala Gly Leu Tyr Met Val Thr Leu Ala115 120 125Val Val Met Gly Cys Tyr Trp Gln Ala Lys Ala Pro Pro Tyr Leu Phe130 135 140Pro Leu Leu Thr Leu Ser Lys Arg Leu His Ser Ile Phe Val Leu Arg145 150 155 160Cys Phe Asn Asp Cys Phe Ala Val Leu Phe Leu Trp Leu Ala Ile Phe165 170 175Phe Phe Gln Arg Arg Asn Trp Gln Ala Gly Ala Leu Leu Tyr Thr Leu180 185 190Gly Leu Gly Val Lys Met Thr Leu Leu Leu Ser Leu Pro Ala Val Gly195 200 205Ile Val Leu Phe Leu Gly Ser Gly Ser Phe Val Thr Thr Leu Gln Leu210 215 220Val Ala Thr Met Gly Leu Val Gln Ile Leu Ile Gly Val Pro Phe Leu
225 230 235 240Ala His Tyr Pro Thr Glu Tyr Leu Ser Arg Ala Phe Glu Leu Ser Arg245 250 255Gln Phe Phe Phe Lys Trp Thr Val Asn Trp Arg Phe Val Gly Glu Glu260 265 270Ile Phe Leu Ser Lys Gly Phe Ala Leu Thr Leu Leu Ala Leu His Val275 280 285Leu Val Leu Gly Ile Phe Ile Thr Thr Arg Trp Ile Lys Pro Ala Arg290 295 300Lys Ser Leu Val Gln Leu Ile Ser Pro Val Leu Leu Ala Gly Lys Pro305 310 315 320Pro Leu Thr Val Pro Glu His Arg Ala Ala Ala Arg Asp Val Thr Pro325 330 335Arg Tyr Ile Met Thr Thr Ile Leu Ser Ala Asn Ala Val Gly Leu Leu340 345 350Phe Ala Arg Ser Leu His Tyr Gln Phe Tyr Ala Tyr Val Ala Trp Ser355 360 365Thr Pro Phe Leu Leu Trp Arg Ala Gly Leu His Pro Val Leu Val Tyr370 375 380Leu Leu Trp Ala Val His Glu Trp Ala Trp Asn Val Phe Pro Ser Thr385 390 395 400Pro Ala Ser Ser Ala Val Val Val Gly Val Leu Gly Val Thr Val Ala405 410 415
Gly Val Trp Phe Gly Ala Arg Glu Glu Trp Glu Pro Gly Met Lys Ser420 425 430Ser Ser Lys Lys Glu Glu Ala Ala Met Arg435 440<210>6<211>432<212>PRT<213>小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)<400>6Met Ala Asp Pro Ala Pro Gly Ala Leu Ala Arg Gly Thr Arg Phe Val1 5 10 15Arg Asn Val Leu Thr Gly Gln His Ala Leu Ser Lys Leu Ile Pro Val20 25 30Ala Leu Trp Leu Ala Asp Ala Val Gly Thr Ser Leu Ile Ile Trp Lys35 40 45Val Pro Tyr Thr Glu Ile Asp Trp Glu Ala Tyr Met Gln Gln Val Ser50 55 60Gln Phe Ile Ser Gly Glu Arg Asp Tyr Thr Lys Ile Glu Gly Gly Thr65 70 75 80Gly Pro Leu Val Tyr Pro Ala Ala His Val Tyr Thr Phe Thr Gly Leu85 90 95Tyr His Ile Thr Asn Glu Gly Glu Asn Ile Phe Leu Ala Gln Gln Ile100 105 110Phe Gly Val Leu Tyr Met Ala Thr Leu Ala Val Val Met Leu Cys Tyr
115 120 125Trp Lys Ala Lys Val Pro Pro Tyr Met Phe Val Phe Leu Ile Ala Ser130 135 140Lys Arg Leu His Ser Leu Phe Val Leu Arg Cys Phe Asn Asp Cys Phe145 150 155 160Ala Val Phe Phe Leu Trp Leu Ser Ile Tyr Phe Phe Gln Arg Arg Asn165 170 175Trp Thr Phe Gly Ser Leu Ala Tyr Thr Trp Gly Leu Gly Ile Lys Met180 185 190Ser Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ile Gly Val Ile Leu Leu Leu Gly195 200 205Arg Gly Phe Trp Pro Gly Leu Arg Leu Ala Trp Leu Met Ala Gln Val210 215 220Gln Phe Ala Ile Gly Ile Pro Phe Ile Met Lys Asn Ser Arg Gly Tyr225 230 235 240Ala Ala Arg Ala Phe Glu Leu Ser Arg Glu Phe Lys Phe Glu Trp Thr245 250 255Val Asn Trp Arg Met Leu Gly Glu Glu Val Phe Leu Ser Lys Ser Phe260 265 270Ala Ile Phe Leu Leu Ala Cys His Val Thr Ala Leu Leu Val Phe Ile275 280 285Ser Gln Arg Trp Leu Gln Pro Thr Gly Arg Pro Leu Ser Ala Met Ile290 295 300
Pro Ser Phe Leu Gln Leu Lys Ser Pro Phe Thr Leu Gln Glu Gln Leu305 310 315 320Arg Ile Ser His Tyr Val Thr Pro Glu Tyr Val Met Thr Thr Met Leu325 330 335Ser Ala Asn Val Ile Gly Leu Leu Phe Ala Arg Ser Leu His Tyr Gln340 345 350Phe Tyr Ala Tyr Leu Ala Trp Ala Ser Pro Tyr Leu Ile Trp Arg Ala355 360 365Thr Glu Asp Pro Phe Ile Val Leu Leu Ile Trp Ala Ala Gln Glu Trp370 375 380Ala Trp Asn Val Phe Pro Ser Thr Asp Leu Ser Ser Arg Val Thr Val385 390 395 400Gly Ala Met Leu Ala Thr Val Val Leu Ala Tyr Arg Gly Thr Ala Arg405 410 415Leu Ala Val Pro Pro Ser Gln Ala Arg Lys Ile Glu Ala Lys Asn Lys420 425 430<2l0>7<211>419<212>PRT<213>烟曲霉(Aspergillus fumigatus)<400>7Met Gln Leu His Arg Ile Asn Thr Met Asp Leu Lys His Ser Leu Arg1 5 10 15Asp Leu Cys Met Asn Pro Arg His Thr Ser Trp Ala Ala Pro Leu Leu20 25 30
Ile Leu Gly Asp Ala Val Leu Cys Ala Leu Ile Ile Trp Arg Val Pro35 40 45Tyr Thr Glu Ile Asp Trp Thr Thr Tyr Met Gln Gln Ile Ser Leu Tyr50 55 60Ile Ser Gly Glu Arg Asp Tyr Thr Leu Ile Lys Gly Ser Thr Gly Pro65 70 75 80Leu Val Tyr Pro Ala Ala His Val Tyr Ile Tyr Asn Ile Leu Tyr His85 90 95Leu Thr Asp Glu Gly Arg Asp Ile Phe Leu Gly Gln Ile Leu Phe Ala100 105 110Ile Leu Tyr Leu Ala Thr Leu Thr Val Ala Met Thr Cys Tyr Arg Gln115 120 125Ala Gly Ala Pro Pro Tyr Leu Leu Val Pro Leu Val Leu Ser Lys Arg130 135 140Leu His Ser Val Phe Met Leu Arg Leu Phe Asn Asp Gly Ile Ala Ala145 150 155 160Phe Ala Met Trp Val Ser Ile Phe Leu Phe Met Asn Lys Lys Leu Ala165 170 175Ala Gly Val Ile Val Trp Ser Thr Gly Val Ala Ile Lys Met Thr Leu180 185 190Leu Leu Leu Ala Pro Ala Ile Ala Met Val Leu Val Leu Ser Leu Ser195 200 205Phe Gly Pro Ser Ile Arg Leu Gly Phe Leu Ala Val Leu Ile Gln Val
210 215 220Leu Phe Gly Ile Pro Phe Leu Arg Asn Asn Pro Ala Gly Tyr Val Ser225 230 235 240Arg Ala Phe Glu Leu Thr Arg Gln Phe Met Phe Lys Trp Thr Val Asn245 250 255Trp Arg Phe Val Gly Glu Glu Leu Phe Leu Ser Arg Lys Phe Ser Leu260 265 270Ala Leu Leu Ala Leu His Leu Leu Leu Leu Gly Leu Phe Val Ala Thr275 280 285Val Trp Leu Glu Pro Ser Gly Ser Asn Leu Pro Ser Phe Leu Gln Arg290 295 300Leu Ile Gln Arg Arg Tyr Arg Thr Ala Ser Leu Ser Lys Ser Phe Val305 3l0 315 320Met Thr Ala Met Leu Ser Ser Leu Ala Ile Gly Leu Leu Cys Ala Arg325 330 335Ser Leu His Tyr Gln Phe Phe Ala Tyr Leu Ala Cys Ala Thr Pro Phe340 345 350Leu Leu Trp Gln Ala Gly Phe His ProIle Leu Val Tyr Val Val Trp355 360365Ala Ala Gln Glu Trp Ala Trp Asn Ala Tyr Pro Ser Thr Asn Ala Ser370 375 380Ser Leu Val Val Val Leu Ser Leu Ala Ala Gln Val Phe Gly Val Leu385 390 395 400
Gly Asn Ser Phe Ser Arg Lys His Leu Asp Gln Ser Ser Gln Lys Glu405 410 415His Met Gln
权利要求
1.真菌中一种控制侵染钉形成并影响真菌甘露糖代谢的蛋白，在梨孢菌中命名为MGPPF5，其特征在于具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №3；2)将序列表中SEQ ID №3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且影响真菌甘露糖代谢和侵染钉形成的蛋白质。3)小麦赤霉菌(Gibberella zeae)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)等真菌中与MGPPF5在氨基酸序列一致性高于40％、且功能相同的同源蛋白。
2.权利要求1所述的影响真菌甘露糖代谢和侵染钉形成的蛋白的编码基因MgPPF5及其它植物病原真菌的具有相同生物功能的同源基因。该基因的特征在于具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №3蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
3.权利要求2所述的基因，其特征还在于其编码区位于自SEQ ID №1的5′端第844位至3198位碱基之间。
4.权利要求2所述基因的cDNA，其特征在于编码影响真菌甘露糖代谢和侵染钉形成的蛋白MGPPF5，并具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №3蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
5.利用权利要求2所述的影响真菌甘露糖代谢相关和侵染钉形成的蛋白MGPPF5的编码基因或其部分序列构建的表达载体，细胞系和宿主菌。
6.利用权利要求1所述的影响真菌甘露糖代谢和侵染钉形成的蛋白的表达、修饰和定位，进行抗真菌药物的筛选和设计。
7.利用权利要求2所述的影响真菌甘露糖代谢和侵染钉形成的蛋白的基因的表达、转录物的剪切，进行抗真菌药物的筛选和设计。
8.利用权利要求1所述的影响真菌甘露糖代谢和侵染钉形成的蛋白或权利要求2所述的影响真菌甘露糖代谢和侵染钉形成的蛋白的基因参与的信号途径，进行抗真菌药物的筛选和设计。
9.权利要求6、7、8所述的抗真菌药剂包括抗梨孢菌(Magnaporthe grisea)、小麦赤霉菌(Gibberella zeae)等的药剂。
全文摘要
本发明提供了梨孢菌一个控制侵染钉形成并影响致病力的新基因MgPPF5基因及其用途。该基因及其cDNA、编码蛋白质分别具有序列表中SEQ ID №1、№2和№3的序列。该基因编码的蛋白质与甘露糖酰基转移酶相似。该基因的敲除导致梨孢菌侵染钉形成率显著下降，并几乎丧失对水稻的致病能力。本发明还发现该基因的同源基因在植物病原真菌中广泛存在，并高度相似，在致病过程可能具有相同的功能。因此，MgPPF5及其编码蛋白的表达、转录物的剪切、修饰与定位以及该基因和编码蛋白参与的信号途径可作为重要候选靶标，用于设计和筛选抗真菌的新型药剂。
文档编号C12N15/63GK1951958SQ20051010944
公开日2007年4月25日 申请日期2005年10月20日 优先权日2005年10月20日
发明者彭友良, 时涛, 赵文生, 王慧凤, 文朝慧 申请人:中国农业大学