基于海洋生物提取物的皮肤病护理治疗产品及其制备方法与流程

【技术领域】

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于海洋生物提取物的皮肤病护理治疗产品及其制备方法。

背景技术：

皮肤病在我国是一种常见病，发病率较高，且有些皮肤病不易根治，治愈后易反复。我们仅以由真菌感染引起的脚气病为例，该病在全国的平均发病率就达到1/3左右，在温度和湿度相对较高的南方部分地区发病率甚至超过50％。现阶段，常用的皮肤科外用药有600多个品种，其中化学药品种与中成药品种的比例大致在8:2。从药品功效来看，销售最多的皮肤科外用药则主要集中在用于治疗由细菌、真菌、球菌等致病菌引起的感染性皮炎和因食物、花粉等引起的过敏性皮炎的药品。

真菌感染是最常见的一种皮肤疾病。真菌是一种真核生物。最常见的真菌是各类蕈类，另外真菌也包括霉菌和酵母。现在已经发现了七万多种真菌，估计只是所有存在的一小半。现代医学认为，真菌性皮肤病是由霉菌所致，而霉菌种类繁多，绝大多数不会致病，其中一小部分为条件致病菌，可存在于人的皮肤、粘膜、肠道等处。正常情况下，各菌群间相互影响，相互制约，平衡代谢。但由于长期使用抗生素可造成体内菌群失调，当人体皮肤破损，抵抗力下降时，致病性霉菌则大量繁殖，侵入皮肤，皮下组织而引起癣的发生。该病多为接触传染，如通过衣物、用具或自身手足癣传染致病。环境条件亦有影响，如在温热季节和潮湿地区比较容易发病。以足癣(脚气)为例，我国人群中足癣的发病率约为15-20％，温度和湿度较高的地区，这一比例甚至超过50％。

与真菌性皮肤病类似，细菌性皮肤病由细菌感染导致。正常皮肤表面的细菌可分为皮肤常驻菌及皮肤暂驻菌。前者指能在皮肤上生长繁殖，包括表皮葡萄球菌等；后者指着落于皮肤，经过一定时间可从皮肤上消失，包括金黄色葡萄球菌、链球菌等。细菌与皮肤病的关系十分密切，细菌及其毒素可分别引起感染性病变(如疖)、中毒性病变(如葡萄球菌烫伤样皮肤综合征)和免疫介导性病变(如超抗原诱发或加重特应性皮炎、银屑病等)。

因此，大部分皮肤病都是有真菌、霉菌、细菌等复杂多种类菌群引起的病变。

目前，治疗皮肤病的药物以外用药为主。常用的皮肤科外用药有600多种，化学药品中占比为80％，是治疗皮肤病的主流用药；中成药占比20％，主要集中用于烧伤、烫伤和皮肤瘙痒等几个症状上。

抗真菌药物是皮肤病药物细分市场规模最大的一类。抗真菌药物中，主要以含有咪唑类结构的一类药物为主，其中代表药物是咪康唑，该药物于1969年由戈德弗鲁瓦合成，后由比利时杨森公司开发生产。咪康唑是一种高效、安全、广谱抗真菌药，对致病性真菌几乎都有作用。其机理是抑制真菌细胞膜的固醇合成，影响细胞膜通透性，抑制真菌生长，导致死亡。其作用机理和抗生素类药物极为类似。

皮质激素类药物是皮肤病药物中仅次于抗真菌药物的第二大品种，作为激素类药物，具有抗炎、抗毒素和抑制免疫等作用，长期使用会产生较大副作用，比如皮肤免疫力下降。目前使用量较大、增速较高的激素类药物为卤米松、莫米松和地奈德。

抗组胺类药物，如苯海拉明、扑尔敏(氯屈米通)、息斯敏(阿司咪唑)等用于治疗皮肤病中的瘙痒等症状，长期使用该类药物能引起人体的低毒反应。

然而，目前市售的皮肤病外用药物不仅治疗效果不佳，同时还会产生不良反应等副作用，加上皮肤病容易复发的特点，大量的皮肤病患者在医院治疗几次失败后拒绝长期使用皮质激素类和抗生素类药物，默默忍受着皮肤病带来的长期困扰。

技术实现要素：

本发明提供了一种在海洋生物中提取天然钙和多种抗菌多肽，完全不依赖抗生素、皮质激素和抗组胺类药物的新型皮肤病护理和治疗产品及其制备方法。

本发明提供了一种基于海洋生物提取物的皮肤病护理治疗产品制备方法，所述方法包括：预处理，将贝壳用碳酸氢钠溶液浸泡，清洗，干燥并粗粉碎，得到贝壳粗粉；第一煅烧，将所述预处理步骤中的所述贝壳粗粉在低温真空条件下进行煅烧，得到第一贝壳粗粉；第二煅烧，将所述预处理步骤中的贝壳粗粉在高温二氧化碳气氛下进行煅烧，得到第二贝壳粗粉；粉碎，将所述第一贝壳粗粉和所述第二贝壳粗粉冷却后，按比例混合后并进行粉碎，得到贝壳微粉；抗菌多肽的制备，将贝壳经粗粉碎后放入醇溶液体系中，在低温高压的环境下萃取有机物，萃取物经过液相色谱分离和质谱鉴定后保存，抗菌多肽经过富集后进行抗菌谱鉴定，绘制出抗菌多肽的抗菌谱，并建立数据库，从中筛选出需要的抗菌多肽；包埋，利用包埋剂将抗菌多肽包埋在所述贝壳微粉中。

优选的，所述抗菌多肽的制备具体方法为：将所述贝壳清洗，常温下或40～100℃干燥、粉碎，得到贝壳粉体；将所述贝壳粉体用醇溶液浸泡10～12小时，并用4～10℃低温高压超声萃取5～60min，得到液固比为2～100ml/g的固液混合体；将所述固液混合体过滤得到过滤液；将所述过滤液用有机溶剂提取、分离、鉴定并通过生物反应器生产制备得到所述抗菌多肽。

优选的，抗菌多肽的分离鉴定方法如下，抗菌多肽采用液相色谱和质谱联用平台进行鉴定。

优选的，将所述鉴定后所得混合多肽蛋白使用浓缩超滤截留10kd以下目的多肽蛋白；将截留纯化的多肽进行酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳；切割下抗菌蛋白条带，进行制备性酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳洗脱；将实验获得的所有肽段的信息同时送入数据库进行搜索；允许未切位点的最大数为1，肽段和断裂离子的质量容差为1，进行分析鉴定各个多肽的序列；依据多肽氨基酸序列，并根据使用原核表达系统对设计多肽基因表达序列进行密码子优化，构建多肽表达载体，通过转基因技术，在表达系统中生产制备抗菌多肽。

优选的，所述筛选出的抗菌多肽包括mfp-a7、mfp-bd、mfp-cg、mfp-p3c、mfp-tc。

优选的，所述粉碎步骤中，将第一贝壳粗粉和所述第二贝壳粗粉的质量比为0.01～10进行混合。

优选的，所述包埋步骤中，包埋剂为聚丙烯酸钠溶液或多聚赖氨酸溶液。

优选的，所述包埋步骤中，所述贝壳微粉和所述抗菌多肽的质量比为10⁷:1～10⁵:1。

本发明还提供了一种基于海洋生物提取物的皮肤病护理治疗产品，其中生物提取物比例为0.05-0.5％，甘油比例为1-10％的甘油，天然薄荷提取物比例为0.01-0.05％。

本发明还提供了一种基于海洋生物提取物的皮肤病护理治疗产品，其中生物提取物比例0.05-0.5％，甘油比例为1-10％，卡波姆或羟甲基纤维素或羧甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素中的一种或几种的比例为1-3％。

本发明通过从贝壳中提取抗菌止痒物质，创新性地解决了皮肤病治疗中难以解决的复杂菌群杀灭和长效止痒的问题，同时避免各种毒副作用的发生。产品主要针对真菌性皮肤病(如手足癣、体癣)、细菌性皮肤病(如丹毒、麻风)、过敏性皮肤病(如湿疹、接触性皮炎)、神经功能障碍性皮肤病(如神经性皮炎、瘙痒症)等皮肤病。适用于长期反复发作患者的长期日常护理和急性发作患者的短期治疗。

【附图说明】

图1为本发明提供的实施例中目的蛋白占全菌总蛋白含量示意图。

【具体实施方式】

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面对本发明做进一步的详细说明，以使本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

本发明提供了一种基于海洋生物提取物的皮肤病护理治疗产品的制备方法，所述方法包括：

1)预处理，将贝壳用碳酸氢钠溶液浸泡，清洗，干燥并粗粉碎，得到贝壳粗粉；所述预处理步骤中，所述碳酸氢钠溶液的质量浓度0.01％～0.25％，所述用碳酸氢钠溶液浸泡的时间为15～45min。更优选地，所述预处理步骤中，所述碳酸氢钠溶液的质量浓度为0.05％～0.1％，所述用碳酸氢钠溶液浸泡的时间为20～40min。所述预处理步骤中，所述贝壳粗粉的粒径为0.1～2mm。更优选地，所述预处理步骤中，所述贝壳粗粉的粒径为0.5～1.5mm。

2)第一煅烧，将所述预处理步骤中的所述贝壳粗粉在低温真空条件下进行煅烧，得到第一贝壳粗粉；所述第一煅烧步骤中，煅烧温度为300℃～800℃，煅烧时间为1～5h。优选地，所述第一煅烧步骤中，煅烧温度为400℃～700℃，煅烧时间为2～4h。

3)第二煅烧，将所述预处理步骤中的贝壳粗粉在高温二氧化碳气氛下进行煅烧，得到第二贝壳粗粉；所述第二煅烧步骤中，所述氧化性气氛为空气和二氧化碳的混合气体，所述二氧化碳与所述空气的体积比为0.03％～0.1％，煅烧温度为600～1400℃，煅烧时间为1～3h。优选地，所述第二煅烧步骤中，所述氧化性气氛为空气和二氧化碳的混合气体，所述二氧化碳与所述空气的体积比为0.05％～0.08％，煅烧温度为700～1200℃，煅烧时间为1.5～3h。

4)粉碎，将所述第一贝壳粗粉和所述第二贝壳粗粉冷却后，按比例混合后并进行粉碎，得到贝壳微粉；所述粉碎步骤中，所述贝壳微粉的粒径为0.1～100μm。优选地，所述粉碎步骤中，所述贝壳微粉的粒径为1～50μm。所述粉碎步骤中，所述第一贝壳粗粉和所述第二贝壳粗粉的质量比为0.01～10。优选地，所述粉碎步骤中，所述第一贝壳粗粉和所述第二贝壳粗粉的质量比为0.05～5。

5)抗菌多肽的制备，虾蟹贝经粗粉碎后放入醇溶液体系中，在低温高压的环境下萃取有机物。萃取物经过液相色谱分离和质谱鉴定后保存。其中鉴定包括多肽序列、功能、可能的抗菌谱。随后，抗菌多肽经过富集后进行抗菌谱鉴定，绘制出抗菌多肽的抗菌谱，并建立数据库，从中筛选出五种抗菌能力强，使用范围广的多肽，采用原核生物反应器制备凝胶产品生产中所需的抗菌多肽。具体的，将所述贝壳用清洗，常温下或40～100℃干燥、粉碎，得到贝壳粉体；将所述贝壳粉体用醇溶液浸泡10～12小时，并用4～10℃低温高压超声萃取5～60min，得到液固比为2～100ml/g的固液混合体；将所述固液混合体过滤得到过滤液；将所述过滤液用有机溶剂提取、分离、鉴定并通过生物反应器生产制备得到所述抗菌多肽。

6)包埋，利用包埋剂将抗菌多肽包埋在所述贝壳微粉中。将经过挑选的抗菌多肽在自主研发的包埋结合技术的帮助下，于天然钙基载体进行包埋结合，封装成为抗菌止痒材料；所述包埋步骤中，所述包埋剂为聚丙烯酸钠溶液，所述聚丙烯酸钠溶液的质量浓度为0.1％～0.5％。优选地，所述包埋步骤中，所述聚丙烯酸钠溶液的质量浓度为0.2％～0.4％。需要说明的是，所述包埋步骤中，所述包埋剂也可以是多聚赖氨酸溶液，所述多聚赖氨酸溶液的质量浓度为0.01％～0.1％。上述包埋步骤中，所述贝壳微粉和所述抗菌多肽的质量比为10⁷:1～10⁵:1。所述贝壳包括贻贝、帆立贝、牡蛎、蛤蜊、紫石房蛤、鲍鱼、老蛤、虾、蟹、河蚌和花甲的一种或两种。优选地，所述贝壳包括贻贝、帆立贝、牡蛎、蛤蜊、紫石房蛤、虾、蟹、河蚌和花甲的一种或两种。

7)根据生物提取物的特征与剂型配方结合，生产出针对不同皮疹皮肤问题的护理凝胶类产品。

需要说明的是，抗菌多肽的分离鉴定方法如下，抗菌多肽采用液相色谱和质谱联用平台(liquidchromatography-tandemmassspectrometry,lc-ms/ms)进行鉴定：

1.将所得混合多肽蛋白使用浓缩超滤截留10kd以下目的多肽蛋白。

2.将截留纯化的多肽进行酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳完毕后，一侧凝胶用考马斯亮蓝染色；另一侧采用电泳凝胶琼脂糖扩散法分析抗菌活性，所用菌株为大肠杆菌及铜绿假单胞菌。

3.切割下抗菌蛋白条带，进行制备性酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳洗脱。洗脱液透析48小时后冷冻干燥。用反相高效液相色谱进一步分离纯化，条件是：0.1％三氟乙酸→60％乙腈0～60min线性梯度洗脱，检测波长214nm，流速1ml/min。按分钟收集洗脱液。分离部分利用1mm微柱(phenomenexc18,1.0mm×150.0mm,30nm,5μm),50μl/min流速，梯度洗脱。流动相为a[水/0.1％甲酸]和b[乙腈/0.1％甲酸]。利用100％a平衡后,采用如下梯度程序：0～50min，b相由0上升至60％；45～60min，b上升至95％；55～75min,保持95％b，自动进样器进样2.5μl。

4.实验获得的所有肽段的信息(质量及断裂离子)同时送入数据库进行搜索。允许未切位点的最大数为1，肽段和断裂离子的质量容差为1，进行分析鉴定各个多肽的序列。

5.依据多肽氨基酸序列，并根据使用原核表达系统对设计多肽基因表达序列进行密码子优化，构建多肽表达载体，通过转基因技术，在表达系统中生产制备抗菌多肽。

本发明实施例中，申请人将筛选出的5种抗菌多肽，分别为mfp-a7、mfp-bd、mfp-cg、mfp-p3c、mfp-tc，按照原核表达宿主大肠杆菌表达系统的密码子偏好性进行优化，并将mfp-bd和mfp-tc两种抗菌多肽通过连接肽(gly4ser)3融合为一个多肽，可使mfp-bd的抗菌活性提高100多倍。分别将优化抗菌多肽基因序列进行合成，并将上述合成的基因片段克隆在pet28b上。

参考图1，为选择更利于表达上述抗菌肽的大肠杆菌表达菌株，比较常规蛋白表达菌株bl21(de3)以及2种表达毒性蛋白的大肠杆菌表达菌株bl21(de3)plysss和c43(de3)作为质粒pet28b的宿主菌时蛋白的表达情况。最终选择c43(de3)作为目的蛋白的表达菌株，通过对iptg浓度试验得出，在其浓度为0.8mmol/l时，目的蛋白占全菌总蛋白含量具有明显差异，目的蛋白的表达量达到最高。,

使用抑菌圈实验来测试转基因菌株总蛋白的抑菌活性，具体方法如下：

(1)分别接菌种，大肠杆菌atcc25922、金黄色葡萄球菌atcc6538、铜绿假单胞菌atcc47085和白色念珠菌atcc0231于20ml液体培养基中；37℃，200rpm摇床培养过夜。

(2)分别取200ul培育过夜的菌液接种到20ml培养基中，继续培养至od600约为0.1，此时，菌体细胞浓度约为1x10⁸cfu/ml，为对数生长期或者对数生长前期。

(3)分别取培养液按1:200的比例加入到未凝固的含有1％琼脂的培养基中，摇匀，倾倒至平板上，至于4℃放置至平板凝固。

(4)在超净工作台中取出灭菌的抑菌环，放置于平板中央。分别向抑菌环中加入总量为0.1mg转基因菌株总蛋白浓缩液，阳性对照组加入0.1mg卡那霉素，阴性对照组为未转基因的菌株总蛋白浓缩液。

(5)平板水平放置于37℃培养箱中培养12小时，期间分不同时间观察是否有抑菌圈形成。结果表明转抗菌多肽菌株总蛋白具有很强的抑菌作用，作为阴性对照的未转基因的菌株总蛋白则没有表现出抑制作用。

此外，还需要对抗菌多肽蛋白的纯化，首先对样品进行预处理：每克湿重菌体/4～5mllysisbuffer的比例充分悬浮离心收集的菌体，置-80℃冰箱过夜；在4℃融解菌体，vortex悬浮细菌，400w功率下，每个循环超声5s，冷却5s，每次10min，共循环2次破碎菌体；4℃12000rpm离心30min，收集上清液或者用0.45μm滤膜过滤，并用低浓度naoh调节ph至8.0待纯化。具体操作步骤如下：

1)介质平衡与亲和

取1mlni-nta琼脂糖凝胶，置入15ml离心管中，2000rpm离心2min，移去上清液；加入5mllysisbuffer，混匀，低速离心，去上清。加入4-5ml细胞(细菌)裂解液，置于混匀转盘，4℃低速旋转1小时。

2)装柱

a)将层析柱固定在铁架台或层析架上，封闭层析柱下端出口，向柱内充入纯水，排开层析柱内空气，先将垫片完全浸没于水面下方，在保持水平的状态下，小心推向底部，避免垫片下方滞留气泡。

b)打开层析柱下端出口，排出柱中纯水；在液面低至距垫片1～1.5cm高度时封闭下端出口，用移液管吸取已与样品亲和的介质，将介质加入到层析柱中；在4℃静置10min，让介质自然沉降。

c)从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免垫片与介质接触面滞留气泡(如对实验要求并非十分严格，为提高流速，可不覆盖上垫片)。

d)在使用一段时间后，如果层析柱流速减慢，可先用小镊子沿边缘将垫片推翻，夹出垫片，倒出介质，清洗或更换新的垫片后，按b)、

c)所述步骤重新装柱；或不更换垫片，用细棒搅拌介质，使其疏松，再装入上端垫片。

3)洗柱

用5～10倍介质体积含10mm咪唑缓冲液c洗去层析柱中未结合蛋白；保留洗涤液，待sds-page电泳检测无目的蛋白后，再将洗涤液丢弃。

4)洗脱

用含20、50、250mm咪唑的缓冲液c分步洗脱，每个梯度2～3倍介质体积洗脱，分别收集洗脱样品，sds-page电泳检测蛋白质。

在实际使用生物提取物制作产品过程中，可以按照0.05-0.5％生物提取物，1-10％的甘油，0.01-0.05％天然薄荷提取物配制成喷雾产品。

或者，按照0.05-0.5％生物提取物，1-10％的甘油，1-3％的卡波姆或羟甲基纤维素或羧甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素中的一种或几种配制成凝胶产品。

根据对凝胶产品的抗菌效果进行检测，发现其抗菌效果显著，具体表现如下：

皮疹护理凝胶抗菌效果的检测：

此外，对凝胶产品的止痒效果进行试验，试验结果如下：

本发明通过从贝壳中提取抗菌止痒物质，创新性地解决了皮肤病治疗中难以解决的复杂菌群杀灭和长效止痒的问题，同时避免各种毒副作用的发生。产品主要针对真菌性皮肤病(如手足癣、体癣)、细菌性皮肤病(如丹毒、麻风)、过敏性皮肤病(如湿疹、接触性皮炎)、神经功能障碍性皮肤病(如神经性皮炎、瘙痒症)等皮肤病。适用于长期反复发作患者的长期日常护理和急性发作患者的短期治疗。