片层碳‑四氧化三铁复合体在抑制Aβ聚集中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及一种片层碳-四氧化三铁复合体在抑制aβ聚集中的应用。

背景技术：

阿尔茨海默氏病(alzheimer’sdisease,ad)是一种常见的老年痴呆病，在所有的神经退行性疾病中，发病率最高、危害最大，分布范围最广，已成为目前医学及社会学关注的重要问题之一。在阿尔茨海默氏病患者的组织病理切片中，发现了神经细胞外的淀粉样物质沉积形成的斑块以及细胞内的神经原纤维缠结现象。这两种现象被认为是阿尔茨海默氏病的神经病理学特征，其主要成分是β淀粉样蛋白----aβ，它是由β淀粉样前体蛋白app水解产生的多肽，阿尔茨海默氏病患者体内的aβ多肽会聚集形成难溶性纤维，进一步聚集形成老年斑，而正常人体内的aβ不会发生聚集。aβ聚集与各种导致阿尔茨海默氏病的发病机理都密切相关，因此，aβ聚集一直在阿尔茨海默氏病相关研究中占据重要位置。

人的大脑中会持续产生aβ，正常情况下aβ不会聚集，这是因为人的机体本身带有有效的清除机制。但阿尔茨海默氏病的患者脑中则出现了aβ的清除和产生之间的失衡，导致aβ大量富集并且发生聚集，对大脑神经元产生毒性。研究发现aβ42对神经细胞有很强的毒性。因此，如何抑制aβ42多肽的聚集及其带来的毒性具有重大意义。

传统的抑制剂有小分子及多肽分子。常用的小分子抑制剂有表面活性剂、离子螯合剂、或如利福霉素e、姜黄素等其它生物活性分子[stainsetal.,chemmedchem,2007,2,1674]。多肽分子抑制剂的生物相容性比小分子抑制剂要好，且有较低的免疫原性，如cn201510579526.4公开了一种具有抑制aβ聚集活性的多肽及其用途，该多肽包含下述氨基酸序列：xaa1-xaa2-xaa3-xaa4，其中，xaa1和xaa3为相同的氨基酸，选自i或l；xaa2选自q或n；xaa4选自a,c,d,e,f,g,h,k,m,p,r,s,t,v,w或y，该多肽具有抑制aβ的聚集活性，能有效地抑制阿尔茨海默症多肽aβ的聚集；又如，cn200710062628.4公开了一种具有含氮杂环修饰的多肽类化合物及其在制备阿尔茨海默病、帕金森病等神经系统退行性疾病或二型糖尿病预防和治疗性药物中的应用，该多肽类化合物不仅能抑制aβ的聚集，还能使已经聚集的aβ聚集体解聚，并且能最终水解清除aβ蛋白，抑制与清除aβ产生的毒性。

但是，虽然研究人员已发现多种物质能干扰aβ聚集，对其作用机制的了解还很有限，这大大限制了研究的深入，因此迫切需要开发新的技术及材料来进一步研究抑制剂与aβ多肽之间的相互作用，发现更有效的抑制剂。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题或者至少部分地解决上述问题，本发明提供了一种片层碳-四氧化三铁复合材料在制备治疗或预防抑制aβ多肽聚集的药物中的应用。

在本发明实施方式中，复合材料可以抑制不同长度的aβ多肽聚集，如aβ10多肽、aβ25多肽、aβ42多肽等，其中，更优选为aβ42多肽。

为了提高抑制效果，在本发明一个优选实施方式中，片层碳-四氧化三铁复合材料为片层碳材料和四氧化三铁颗粒复合而成。

其中，在复合材料中，当四氧化三铁颗粒均匀分布在片层碳表面时，可以显著增加其和aβ多肽的接触面积，富积多肽，提高抑制aβ多肽聚集效果，从而显著降低aβ多肽的细胞毒性，尤其是aβ42多肽。

在本发明一个优选实施方式中，片层碳材料与四氧化三铁颗粒的质量比可以根据需要来调控，为了提高抑制效果，片层碳材料与四氧化三铁颗粒的质量比可为1:1-100:1，优选为10:1-50:1，更优选为25:1-30:1。

在本发明的实施方式中，可以使用本领域中常用的方法来制备四氧化三铁颗粒，并将均匀分布在片层状碳材料表面，从而得到本发明的复合材料。

在本发明一个具体实施方式中，可以将片层碳材料分散在溶剂中，再加入制备四氧化三铁颗粒的原料反应即得。更优选地是，将片层碳材料分散于溶剂中，再加入丙烯酸钠、醋酸钠和氯化铁，均匀混合反应生成四氧化三铁和片层碳材料的复合体，反应结束后，清洗，通过磁分离收集复合体。

其中，本发明的片层碳，即片层碳材料，可以选用氧化石墨烯，也可以用其他碳材料，如碳纳米管，c60纳米颗粒以及活性碳等，优选为氧化石墨烯，即将四氧化三铁颗粒均匀分散在片层氧化石墨烯的表面，从而更有效地提高抑制aβ多肽的聚集效果，降低aβ多肽的细胞毒性，尤其是aβ42多肽。

本发明的片层碳-四氧化三铁复合材料可以与aβ多肽结合，通过酪氨酸残基的荧光谱中可以看出，材料和多肽混合后，两者相互作用，，导致aβ多肽中酪氨酸残基荧光的猝灭。

本发明的片层碳-四氧化三铁复合材料可以抑制aβ多肽聚集成纤维，在加入本发明的复合材料后，aβ多肽聚集体的尺寸明显降低，很大程度上抑制aβ多肽的聚集，有效地降低了aβ多肽的细胞毒性。

本发明的片层碳-四氧化三铁复合材料可以抑制aβ多肽形成β折叠结构，从而来抑制aβ多肽的聚集。

本发明的另一方面，还提供了上述片层碳-四氧化三铁复合材料在制备降低aβ多肽聚集体对神经细胞或组织的毒性的药物中的应用，尤其是降低aβ42多肽聚集体对神经细胞或组织的毒性。

其中，神经细胞或组织为人神经母细胞瘤细胞或组织。优选为sh-sy5y细胞或是含有sh-sy5y细胞的组织。

本发明的再一方面，还提供了上述片层碳-四氧化三铁复合材料制备治疗或预防神经系统退行性疾病药物中的应用。

其中，神经系统退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、二型糖尿病等。

本发明首次利用特定片层碳材料-四氧化三铁复合体材料来达到很好的抑制aβ多肽聚集的效果，尤其是抑制aβ42多肽聚集的效果。同时，利用特定结构片层碳材料-四氧化三铁复合体可以增加其和aβ多肽的接触面积,富集多肽，提高抑制aβ多肽聚集效果，从而降低aβ多肽的细胞毒性。本发明的复合材料更适用于aβ42多肽。

附图说明

图1为本发明实施例1中片层碳材料-四氧化三铁复合体的形貌和红外光谱图；

图2为硫磺素t(tht)作为荧光探针检测实施例1中片层碳材料-四氧化三铁复合体对aβ42聚集的动力学影响曲线图；

图3为使用本发明实施例1的片层碳材料-四氧化三铁复合体的对aβ42形貌影响的透射电镜图；

图4为本发明实施例1的片层碳材料-四氧化三铁复合体的对aβ42二级结构影响的圆二色光谱；

图5为本发明实施例1的片层碳材料-四氧化三铁复合体的对aβ42酪氨酸自源荧光的影响；

图6本发明实施例1的片层碳材料-四氧化三铁复合体对aβ42的sh-sy5y细胞毒性的抑制作用。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规技术手段。若未特别指明，实施例中所用的试剂为市售。

实施例1

片层碳材料-四氧化三铁复合体的制备及其表征

将0.01毫克氧化石墨烯分散于0.5毫升乙二醇中，再加入0.283克丙烯酸钠、0.283克醋酸钠和0.27毫克氯化铁，均匀混合。将上述混合溶液转移至反应釜中，200℃条件下加热10小时。反应结束后，用乙醇进行清洗，最后，通过磁分离收集产物。

图1a是制备的片层碳材料-四氧化三铁复合体的透射电镜图像，从图中可以看到，四氧化三铁纳米颗粒均匀分布在片层碳材料表面。用红外光谱仪对片层碳材料-四氧化三铁复合体的红外光谱进行测量。如图1b所示，在片层碳材料-四氧化三铁复合体的红外光谱谱图中，片层碳材料在3412cm^-1、1734cm^-1、1616cm^-1和1060cm^-1处的峰分别对应于o-h、c＝o、c＝c和c-o振动。复合材料在1560cm^-1和1408cm^-1附近的两个新的振动谱带是由于coo^-和fe相互作用带来的，585cm^-1的高峰是fe-o官能团的特征峰，表明四氧化三铁已经修饰在片层碳材料表面。

实施例2

硫磺素t(tht)作为荧光探针检测片层碳材料-四氧化三铁复合体对aβ42聚集的动力学影响

硫磺素t(tht)是一种能够与β折叠结构特异性结合的荧光分子，结合之后在440nm的激发波长下在485nm处有最强的荧光发射。用tht分子荧光实验监测aβ42聚集的动力学过程，在不同时间点分别取20μlaβ42溶液与10μm的tht溶液180μl在96孔黑板中混合均匀后，用酶标仪测量在485nm的荧光发射强度。将不同时间点的数据绘制成聚集动力学曲线。

图2是无材料的情况下以及加入材料后时aβ42的聚集动力学曲线。当加入材料时，aβ42的硫磺素t荧光强度明显减弱，说明aβ42的聚集程度受到抑制。在相同浓度下，片层碳材料-四氧化三铁复合体对aβ42聚集的抑制效果要优于单纯的片层碳材料。

实施例3

片层碳材料-四氧化三铁复合体的对aβ42形貌影响

通过透射电镜观察片层碳材料-四氧化三铁复合体对aβ42成纤维的抑制作用。

图3是在有、无材料的情况下aβ42成纤维情况的透射电镜表征结果。在没有材料介入时，经过老化后观察到aβ42聚集形成的很明显的纤维(图3a)。而在加入片层碳材料后，图中观察不到成熟的纤维(图3b)，如果加入的是片层碳材料-四氧化三铁复合体，aβ42聚集成纤维的过程被进一步抑制了，形成的聚集体尺寸明显降低。这个结果也说明了，与单纯的片层碳材料相比，相同浓度的片层碳材料-四氧化三铁复合体对aβ42的聚集抑制效果更加显著。

实施例4

片层碳材料-四氧化三铁复合体的对aβ42二级结构影响。

用圆二色光谱(cd)研究片层碳材料-四氧化三铁复合体的对aβ42二级结构影响。用于cd实验的aβ42溶液在37℃恒温摇床中振荡4h后，在j-810圆二色光谱仪上采集190nm到260nm的信号。

结果如图4所示。在203nm处的正峰以及217nm处的负峰说明aβ42的二级结构是典型的β折叠结构。在加入片层碳材料后，217nm处的负峰强度减弱，表示β折叠结构的含量在减少。在加入片层碳材料-四氧化三铁复合体后，负峰强度进一步减弱。该结果说明片层碳材料-四氧化三铁复合体可以抑制aβ42形成β折叠结构。

实施例5

片层碳材料-四氧化三铁复合体的对aβ42酪氨酸自源荧光的影响

利用光谱实验考查片层碳材料-四氧化三铁复合体与aβ42间的相互作用。将aβ42样品置于四面通透的石英比色皿中，用荧光光谱仪采集室温下290nm到350nm间的酪氨酸自源荧光光谱。将加入相同浓度的片层碳材料和片层碳材料-四氧化三铁复合体之后的aβ42酪氨酸荧光和没加材料的aβ42自身的酪氨酸荧光进行比较。

图5为酪氨酸在309nm处的荧光光谱，在加入材料后，酪氨酸荧光发生了明显的猝灭。在加入片层碳材料的样品中，aβ42的酪氨酸荧光约为aβ42本身的70％；而在加入片层碳材料-四氧化三铁复合体的样品中，酪氨酸荧光强度仅为aβ42本身的40％。实验结果证明，片层碳材料-四氧化三铁复合体能够与aβ42多肽结合，通过荧光能量共振转移，能量从酪氨酸残基)转移到了材料上，从而导致酪氨酸荧光的猝灭。

实施例6

片层碳材料-四氧化三铁复合体对aβ42的sh-sy5y细胞毒性的抑制作用

以人神经母细胞瘤细胞sh-sy5y为模型，研究材料对aβ42神经毒性的抑制作用。sh-sy5y细胞置于37℃，含5％co2的细胞培养箱进行常规培养。加入不同浓度的aβ42或者是含材料的aβ42溶液，培养48h后，用cck-8试剂检测细胞活力。

从图6可以看到，aβ42对于sh-sy5y细胞具有比较强的毒性，aβ42的浓度从5μm到40μm，细胞的存活率明显下降。当加入了复合材料后，aβ42多肽的细胞毒性明显降低。例如，在40μm的多肽作用下，细胞存活率为50％，加入片层碳材料后，细胞存活率提升至60％，加片层碳材料-四氧化三铁复合体后细胞存活率高达80％。该结果证明了复合材料抑制了aβ42聚集，从而降低了其对神经细胞的毒性。

最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。