一种具有潜在治疗帕金森病的药物的制作方法

本发明涉及一种具有潜在治疗帕金森病的药物，属于医学神经药理学技术领域。

背景技术：

帕金森病(parkinson’sdisease，pd)是最常见的运动神经系统退行性疾病，主要临床表现为：静止震颤、行动迟缓、站立不稳以及姿势反射障碍。帕金森病患者脑部的主要病变部位为黑质及纹状体，其中黑质致密部内多巴胺能神经元的死亡和数量减少是造成投射到纹状体内多巴胺减少的直接原因。目前，pd的致病机制还不太明确，但与糖尿病并发脑病引起的氧化损伤、海马神经元细胞凋亡等疾病具有明显的区别。

pd作为仅次于阿尔茨海默症的第二大神经退行性疾病，帕金森病随年龄的增加其发病率和患病率均急剧增加，在60岁以上老年人中患病率达1％，85岁以上人群达5％-6％，目前我国的帕金森病患者数量超过200万。pd的病因与老化、环境及遗传因素有关，而pd发病机制目前仍不明确。但研究表明，氧化应激损伤、免疫炎症、内质网应激、凋亡等病理机制相互作用，可能引起了pd的发生和发展。目前我国已逐渐进入老龄化社会，随着老龄人口的增加，pd患者的数量也将迅速增加。pd不仅在行动上给患者造成不便，有的患者可有精神和智能障碍，使成千上万的家庭在精神上也备受折磨，因此，从多途径治疗pd已成为当今的研究热点。

目前临床针对帕金森病的治疗主要有化学药物治疗和外科手术治疗，以及仍处于实验阶段的细胞治疗和基因治疗。化学药物治疗将复方左旋多巴制剂作为治疗pd的“金标准”，但这是以进一步伤害多巴胺能神经元的功能状态为代价，短期疗效，在控制症状方面优于中药，但长期应用，毒副作用大，不仅疗效随时间延长而逐渐减弱、终止，而且会加快患者现有多巴胺能神经元的死亡速度，从长期效果观察无异于饮鸩止渴。中药单体以其毒副作用小、疗效持久和整体调节好等优势，已成为近年来防治pd新药的研究导向。

目前，已有报道一些用于防治pd的中药组合物，但是这些组合物一般原料配方比较复杂、需要对原料进行浸提等复杂的处理而导致用药繁琐，而且具体是哪些成分发挥了相应的作用也是不明确的。

技术实现要素：

为了克服现有临床治疗帕金森病药物的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种具有潜在治疗帕金森病作用的药物。

本发明通过建立c57bl/6j小鼠帕金森病模型，观察桃叶珊瑚苷对帕金森病小鼠运动障碍症状，通过实验论证，桃叶珊瑚苷能改善帕金森病小鼠的运动迟缓症状，减少纹状体多巴胺含量的降低以及改善黑质致密部神经元，从而证明桃叶珊瑚苷对帕金森病具有神经保护作用。

本发明的第一个目的是提供一种预防和/或缓解和/或辅助治疗和/或治疗帕金森病的药物或者药物组合物，所述药物或者药物组合物以桃叶珊瑚苷作为有效成分或者主要有效成分。

在本发明的一种实施方式中，所述药物或者药物组合物还包括药学上可接受的赋型剂。所述药学上可接受的赋型剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。

在本发明的一种实施方式中，所述药物或者药物组合物中含有质量百分比大于99％的桃叶珊瑚苷和质量百分比小于1％的药学上可接受的载体或赋形剂。

在本发明的一种实施方式中，本发明的桃叶珊瑚苷可以与其他活性成分组合使用，只要它们不产生其他不利的作用，例如过敏反应。

在本发明的一种实施方式中，本发明的药物或者药物组合物可配制成若干种剂型，其中含有药学领域中常用的一些赋形剂；例如，口服制剂(如片剂，胶囊剂，溶液或混悬液)；可注射的制剂(如可注射的溶液或混悬液，或者是可注射的干燥粉末，在注射前加入注射用水可立即使用)；局部制剂(例如软膏或溶液)。

在本发明的一种实施方式中，用于本发明药物组合物的载体是药学领域中可得到的常见类型，包括：口服制剂用的粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稀释剂、稳定剂、悬浮剂、无色素、矫味剂等；可注射制剂用的防腐剂、加溶剂、稳定剂等；局部制剂用的基质、稀释剂、润滑剂、防腐剂等。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可将其配制成肠衣片剂。

本发明的第二个目的是提供一种改善运动能力的药物，所述药物以桃叶珊瑚苷作为有效成分或者主要有效成分。

本发明的第三个目的是提供一种改善黑质致密部的酪氨酸羟化酶阳性神经元细胞分布和形态的药物，所述药物以桃叶珊瑚苷作为有效成分或者主要有效成分。

本发明的第四个目的是提供一种提高纹状体内酪氨酸羟化酶表达的药物，所述药物以桃叶珊瑚苷作为有效成分或者主要有效成分。

发明的第五个目的是提供桃叶珊瑚苷的新应用。所述应用，是制备预防和/或缓解和/或辅助治疗和/或治疗帕金森病的药物、保健食品、饮品、肠内营养制剂、膳食补充剂、兽药或者饲料添加剂。

本发明的有益效果：

本发明通过建立小鼠帕金森病模型，通过实验论证，桃叶珊瑚苷能改善帕金森病模型小鼠的运动迟缓症状，减少纹状体多巴胺含量的降低以及改善黑质致密部神经元，从而证明桃叶珊瑚苷对帕金森病具有神经保护作用。本发明采用桃叶珊瑚苷，而不需要复杂的原料配方、也不需要对原料复杂的处理，非常简便。

附图说明

图1：桃叶珊瑚苷对mptp诱导帕金森模型小鼠的爬竿实验行为学实验结果图；

图2：桃叶珊瑚苷对mptp诱导帕金森模型小鼠纹状体多巴胺含量实验结果图；

图3：桃叶珊瑚苷对mptp诱导帕金森模型小鼠黑质区多巴胺神经元细胞的影响图；

图4：桃叶珊瑚苷对mptp诱导帕金森模型小鼠纹状体westernblot蛋白印记图；

图5：桃叶珊瑚苷对mptp诱导帕金森模型小鼠纹状体westernblot蛋白印记的灰度统计分析图。

具体实施方案

下面通过具体实施进一步阐述本发明方法，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：动物模型的建立和分组

体重20-25g，8周龄，雄性c57bl/6小鼠，随机分为空白组，mptp模型组(先给mptp后给生理盐水)，桃叶珊瑚苷给药组(先给mptp后给桃叶珊瑚苷)，每组20只。置于23±2℃，照明时间为12h/day，动物适应环境一周后开始给予药物。mptp模型组每日腹腔注射mptp(30mg/kg)一次，连续5天，后每日腹腔注射生理盐水一次，连续7天。给药组每日腹腔注射mptp(30mg/kg)一次，连续5天，后每日腹腔注射桃叶珊瑚苷(50mg/kg)溶液一次，连续7天。空白组全程给予生理盐水，连续12天。随后通过爬杆实验对小鼠的行为学进行评价，然后通过免疫荧光检测黑质区多巴胺能神经元的变化，纹状体hplc检测纹状体内多巴胺的含量，westernblot检测酪氨酸羟化酶表达情况。通过以上方法来评价桃叶珊瑚苷对帕金森病小鼠的神经保护作用。

一、行为学评价

各组小鼠分别在给予行为学检测前三天进行训练，每天一次，于给药结束后第一天进行行为学检测。

爬杆实验(poletest)：自制爬杆架：选择长55cm，直径lcm的金属管，外紧裹纱布防滑，上端覆以直径2cm的球形突起(实验时作为小鼠的附着点)，然后将其固定于金属底座，放置在鼠笼中，底座用敷料覆盖。测试时将小鼠头朝上置于球形突起，记录其自放置杆至爬至杆底后肢着地的时间，测3次取平均值，每次间隔10分钟以上。如小鼠出现中途停顿或反向攀爬，则重新测量。该实验动物要经过提前训练3天。

利用爬杆实验检测小鼠运动能力，如图1所示。检测结果显示，空白组、模型组、给药组的小鼠的爬杆所需时间分别为4.055s、4.868s、3.921s。与空白组小鼠比较，模型组小鼠爬杆所需时间增加20.05％，运动的速度减慢。结果证实注射mptp的模型组小鼠活动能力减弱。桃叶珊瑚苷给药组的小鼠较模型组小鼠所需时间减少，速度较快，与模型组比较具有极显著性差异(p<0.001)，而且比空白组还略有减少。结果证实桃叶珊瑚苷能改善帕金森病小鼠的运动能力。

二、hplc-fld检测纹状体内多巴胺的含量

(1)样品处理

每组取8只小鼠，使用异氟烷吸入式麻醉，剪破右心耳，从左心室进针灌注生理盐水，取大脑剥离双侧纹状体，所有操作均在冰浴上进行，所得取材立即转移到-80℃保存。纹状体加入0.1mol/l高氯酸0.2ml匀浆，13000r/min，4℃离心5min，0.2μm滤膜过滤，-20℃储存备用。采用hplc-fld法检测小鼠脑纹状体da含量。

(2)hplc-fld检测

(a)色谱柱：美国waters公司atlantist3(4.6mm×150mm，5μm)；保护柱：美国waters公司(4.6mm×20mm，5μm，gdcrt)；流动相的配制：0.01mol/lpbs磷酸缓冲液试剂包(超纯水溶解到1l并调节ph到合适范围)，乙腈，超纯水，0.2μm滤膜过滤后超声脱气备用；柱温：30℃；流速：0.8ml/min；荧光检测器：激发波长280nm，吸收波长320nm。

(b)标准曲线的制备

将da对照品用甲醇溶液(含有10％超纯水)制成浓度为1mg/ml的贮备液，再用甲醇溶液稀释成0.2，0.4，1，2，4μg/ml的对照品溶液，取10μl注入色谱仪进行分析，得到对照品溶液色谱图。以各对照品溶液的浓度为横坐标(x)，各组分的峰面积为纵坐标(y)进行线性回归，得到标准曲线方程。

da：y＝2636864.1874x+16039.6352，r＝0.999

(3)实验结果

如图2所示，与空白组的正常小鼠比较，未经给药的模型组帕金森病小鼠多巴胺含量明显下降，下降了66.1％。然而桃叶珊瑚苷给药组的帕金病小鼠纹状体多巴胺含量较模型组相比有显著的升高(p<0.05)，结果证实桃叶珊瑚苷能减少帕金病小鼠纹状体多巴胺含量的降低。

三、免疫组化法检测小鼠大脑黑质区神经元的变化

(1)样品处理

每组取4只小鼠，使用异氟烷吸入式麻醉，剪破右心耳，从左心室进针灌注生理盐水，冲洗血液后灌注体积百分数为4％的多聚甲醛50ml。开颅取脑，浸入4％的多聚甲醛固定。经梯度蔗糖溶液脱水，组织胶包埋制成冰冻切片(6μm)。

(2)免疫荧光

取脑组织黑质部位冠状切片3张，55℃烘片30min，用柠檬酸盐缓冲液95℃水浴修复抗原，冷却后pbs浸洗10min×2次，体积分数为5％山羊血清室温孵育lh，加酪氨酸羟化酶(th)一抗(体积比为1:1000)4℃孵育过夜，加荧光二抗(1:1000)室温避光孵育1h，避光显色5min，封片，避光保存。

(3)实验结果

结果如图3所示，以空白组的正常小鼠为基准，未经治疗的帕金森病小鼠的神经元细胞数目下降明显，桃叶珊瑚苷给药组的帕金病小鼠的神经元细胞数目较模型组有所上升。由此可见，本发明使用的桃叶珊瑚苷对帕金森病小鼠黑质致密部的酪氨酸羟化酶阳性神经元细胞分布和形态具有良好的改善作用。

四、westernblot检测纹状体酪氨酸羟化酶水平变化

(1)样品处理

每组取6只小鼠，使用异氟烷吸入式麻醉，剪破右心耳，从左心室进针灌注生理盐水，取大脑剥离双侧纹状体，所有操作均在冰浴上进行，所得取材暂存于干冰后立即转移到-80℃保存。纹状体加入0.2mlripa和2μlpmsf匀浆，13000r/min，4℃离心5min，取上清液分装，-20℃储存备用。

(2)bca法检测纹状体总蛋白浓度

配制工作液：根据标准品和样品的数量，按50倍体积的bca试剂加入1倍体积的cu试剂(50:1)配制bca工作液。稀释标准品：取bsa标准品溶液，用pbs稀释成0、25、125、250、500、750、1000、1500、2000μg/ml标准品液。将样品取适量加到96孔板的样品孔中，用pbs补足。各孔加入200μlbca工作液，37℃反应30min，用酶标仪测定562nm的吸光度，以不含bsa的样品吸光值为空白独照。制作标准曲线，以a562为纵坐标，bsa含量为横坐标，计算样品的蛋白浓度。

(3)sds-page电泳、转膜

电泳：所提取的蛋白样品测定浓度以后，用ripa溶液将其调到一致浓度，加入上样缓冲液，水浴煮沸5min，取适量蛋白上样，恒压80v电泳。转膜：剪适当大小的pvdf膜，用甲醇活化，后用去离子水浸泡后置入转膜液，将海绵—滤纸—page胶—pvdf膜—滤纸—海绵顺序夹好，加入转膜液，将整个电泳槽放在冰上，恒流转膜。

(4)封闭、抗体孵育以及显色

封闭：将膜置于含有5％的胎牛血清溶液(bsa，tbst溶液配制)的容器置于水平摇床上室温封闭1小时。一抗孵育：封闭完成以后根据蛋白marker将含有th、gadph的条带剪下，将剪好的膜分别浸于相应的一抗抗体工作液(5％bsa配制)，4℃摇床过夜。二抗孵育：将孵育一抗过夜的膜从4℃取出，用tbst在摇床上轻摇洗膜，后使用hrp标记的二抗工作液(5％bsa配制)孵育，室温摇床1h，之后用tbst在摇床上轻摇洗膜。ecl显色：将膜从洗膜液中取出，适当控干水分，放入凝胶成像仪中，加入ecl显色液显像。

(5)实验结果

结果如图4～5所示。与空白组正常小鼠对比，以gadph为内参的情况下，未经给药的帕金森病小鼠的酪氨酸羟化酶th的表达下降明显(下降了50.9％)，桃叶珊瑚苷给药组的帕金病小鼠的th表达有所上升(相对于未经给药的帕金森病小鼠的酪氨酸羟化酶th的表达上升了64.7％)。本发明使用桃叶珊瑚苷有助于增加帕金森病小鼠纹状体内酪氨酸羟化酶表达。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。