Nedd4-2在帕金森病治疗中的应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及Nedd4-2在帕金森病治疗中的应用。
【背景技术】
[0002]帕金森病是一种中老年常见的神经系统变性疾病，临床上以静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态异常等运动系统症状为主要表现。最近几年帕金森病的非运动症状逐渐引起人们的注意，这些症状不仅包括多汗、便秘等自主神经功能障碍，嗅觉减退，视空间能力受损、记忆力下降等认知障碍和焦虑、抑郁等情绪障碍，而且还有幻觉、妄想等精神障碍，严重者伴发痴呆。
[0003]目前公认帕金森病的发病机制为黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元变性缺失和路易小体(Lewy body)形成[6]，同时兴奋性毒性作用、环境因素、钙超载、线粒体功能障碍、氧化应激过度、年龄老化以及神经干细胞随衰老发生退行性变等诸多因素参与了帕金森病的发病过程[7]。
[0004]根据帕金森病的发病机制，延缓黑质多巴胺能神经元的变性和补充多巴胺是治疗的基本原则，基于此，目前，左旋多巴仍然是治疗帕金森病的“金标准”，它可以通过血脑屏障，在多巴胺脱羧酶的作用下变成多巴胺，发挥替代疗法的作用，在疾病初期具有明显的缓解作用，但长期服用容易出现直立性低血压、心律失常，并且易出现谵妄、幻觉等精神症状，严重时出现异动症、剂末恶化现象、“开-关”现象等并发症，神经干细胞移植和基因治疗是近几年新兴的治疗手段，但是因为成本和风险较高，尚不能用于临床的推广。
[0005]谷氨酸(glutamate,Glu)是哺乳动物中枢神经系统最主要的兴奋性神经递质，释放到突触间隙，发挥作用后很快被位于星形胶质细胞和神经元胞膜上的兴奋性谷氨酸转运体所终止。真核生物高亲和力谷氨酸转运体(excitatory amino acid transporters ,EAATs)分为GLAST(EAATl)、GLT-1 (EAAT2)、EAAC1 (EAAT3)、EAAT4和EAAT5等5个亚型，其中，GLAST和GLT-1主要表达于脑内的胶质细胞上，GLAST在小脑的Bergmann胶质细胞表达较高，在脊髓和前脑也有少量表达，GLT-1主要表达于前脑、海马、大脑皮层和纹状体等部位，GLAST和GLT-1不仅可单独表达在不同神经胶质细胞，亦可同时表达于同一细胞的不同部位。星形胶质细胞通过GLAST和GLT-1可以清除细胞间隙90%以上的谷氨酸，从而保护神经元免受谷氨酸兴奋性毒性损伤[8]。因为谷氨酸能突触没有降解递质的相应酶，只能通过突触前重摄取终止递质的传递，所以，EAATs在清除递质、终止突触传递中起重要作用，同时，EAATs通过迅速移除兴奋性突触释放出的谷氨酸，有效维持了细胞外谷氨酸的低浓度，防止了兴奋性扩布的发生，同时也限制了潜在的兴奋性毒性作用。
[0006]在帕金森病的众多病理机制中，兴奋性氨基酸的毒性作用一直是国内外研究的热点，目前的研究证据提示，突触前NMDA受体的激活等参与了谷氨酸的过度释放，通过谷氨酸受体介导的兴奋性神经毒性作用选择性导致黑质DA能神经元变性或坏死，在H)的发病中起到重要作用[9]。
[0007]EAATs功能的异常和谷氨酸摄取的下降与帕金森病的发病密切相关，Ferrarese等[1()]研究了34名ro患者和21名正常人的血小板谷氨酸摄取功能，发现与对照组相比，原发性ro患者谷氨酸摄取量减少了50%，且摄取减少量与ro的严重程度有关。在6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-0HDA)和 1-甲基_4_苯基-1，2，3，6_四氢P比啶(Ι-methy 1_4_phenyl-Ι，2，3，6_tetrahydropyridine，MPTP)及其离子MPP+制造的FO鼠模型中，发现GLT-
1、EAAC1表达的减少和谷氨酸摄取的下降[11—13]。当应用抑制剂阻断GLT-1后，伴有多巴胺合成限速酶一酪氨酸羟化酶磷酸化水平的降低，导致了多巴胺合成的较少[14]。然而，在PD患者和动物模型上也发现了谷氨酸转运体表达的升高，？1&^&1^8等[15]进行的人脑原位杂交实验结果显示，黑质多巴胺能神经元具有高表达的EAACl，说明EAACl与PD具有密切的相关性。同时研究表明，在GLT-1表达下降的同时伴随有EAACI摄取谷氨酸的增加和表达的增高[11’14]。同样|&18816等[16]的研究也证实，在应用6-0HDA后的第3周和第12周，GLT-1的在H)大鼠模型双侧纹状体的表达增加。这些研究提示，在PD的发病过程中，随着EAATs表达的下降，其摄取谷氨酸的能力降低，导致了细胞外谷氨酸水平的升高，胞外的谷氨酸持续作用于代谢性谷氨酸受体，激活多巴胺能神经元胞内第二信使三磷酸肌醇(inositoltriphosphate, IP3)与环腺苷二磷酸核糖，通过各自信号调控途径诱导胞内Ca2+浓度升高，引起对Ca2+敏感的K+通道开放，多巴胺能神经元胞膜超极化导致细胞死亡，同时导致能量消耗增多、自由基形成，最终引发兴奋性神经毒性效应[17]。而在PD中谷氨酸转运体表达的增加可能作为一种补偿机制来对抗谷氨酸的兴奋性毒性效应，以EAACl为例，其在H)中表达的增加，一方面，摄取谷氨酸用来合成γ -氨基丁酸(GABA)，参与中枢神经系统抑制性GABA能神经元的突触传递，一方面，摄取半胱氨酸用来合成谷胱甘肽，对抗机体的氧自由基损伤，研究表明，机体在氧化应激条件下，中枢神经系统通过激活转录因子2-抗氧化剂应答元件通路上调神经元转运体EAACl的表达[18]，从而提高谷胱甘肽的合成，对抗氧自由基损伤，另一方面，也有研究表明，在神经退行性疾病患者的海马，伴随有非离子表面活性剂聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)处理后不可溶解的EAACl的聚集和谷氨酸摄取的降低，这种功能异常的EAACl是活性氧对其进行了翻译后氧化修饰形成的高分子量的多聚体，参与了神经退行性疾病的发病过程[19]。
[0008]研究表明，通过上调EAATs的表达，可以减弱兴奋性毒性对神经系统的损伤，例如，头孢曲松钠能够提高谷氨酸转运体GLT-1的表达，保护多巴胺神经元免受兴奋性毒性作用，从而减弱6-0HDA造成的运动缺陷[2()]，国内胡刚实验室自主研制的ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channel，Katp)开放剂埃他卡林(iptakalim，IPT)可以增强星形胶质细胞谷氨酸转运体功能，降低细胞外谷氨酸水平，从而对PD模型鼠起到一定的治疗效应[21]，显示了该类药物应用于ro治疗的前景。
[0009]EAATs主要利用Na+-K+ -ATP酶形成的Na+和K+的电化学浓度梯度来完成对谷氨酸的转运，EAATs每转运一个谷氨酸分子，伴有3个Na+和I个H +同向转入细胞内，I个K+转至细胞外，而EAATs只有在胞膜上表达才能发挥正常的摄取功能[22]。
[0010]调节谷氨酸摄取功能的一个重要机制是EAATs在胞浆和胞膜之间的动态周转循环。EAATs在胞浆合成、修饰完毕后，定位表达至细胞膜表面发挥摄取功能，而胞膜上的EAATs经泛素化过程被转运至胞浆的蛋白酶体系统，在蛋白酶体系统中，EAATs被降解或改变生物活性，从而维持细胞膜上EAATs的动态水平。整个周转循环受到复杂、精细的调控，一旦周转循环异常，则导致细胞膜上的EAATs不能正常发挥功能，摄取谷氨酸的能力下降，介导兴奋性毒性作用参与帕金森病的发生和发展。
[0011]泛素化是指泛素分子在一系列酶作用下，对靶蛋白进行特异性修饰的过程，是翻译后修饰的一种常见形式。早期的研究发现，泛素与靶蛋白结合，由泛素激活酶(ubi quit in-activating enzyme , El)、泛素结合酉每(ubiquitin-con jugaring enzyme ,E2)和泛素连接酶(ubiquitin protein ligase，E3)级联催化形成多聚泛素链，在E3酶的作用下将被泛素化的底物提交给26S蛋白酶体降解，多聚泛素链在去泛素化酶(deubiquitinenZymes，DUBs)的作用下被解离为单体，重新回到泛素循环，这个过程称为泛素蛋白酶体通路，主要参与体内蛋白质的降解，这一研究获得2004年诺贝尔化学奖。其后的研究发现，并非所有泛素化修饰都会导致蛋白质的降解，研究发现泛素化介导的非蛋白降解功能包括DNA损伤修复、信号传导、转录调节、胞吞作用和蛋白激酶活化，因此，泛素化异常与多种疾病的发生和发展有关[23]。
[0012]在泛素化过程中，泛素激活酶El只有一种，泛素结合酶E2有20余种，而泛素连接酶E3有几千种。El是通用的，E2、E3则具有底物特异性，即每一种E2和E3只识别、转运、结合各自特定的一种或一类蛋白。其中，泛素连接酶E3分为HECT(homologous to E6AP Cterminus)家族和RING-finger家族，通过多泛素化或单泛素化将泛素分子连接到革E蛋白上，提交给蛋白酶体降解或改变靶蛋白在细胞内的定位或功能[24]。
[0013]Nedd4属于泛素连接酶E3，其在细胞膜蛋白和离子通道的泛素化过程中起重要作用，Nedd4有两个异构体:Nedd4_l和Nedd4_2。前期的研究证实Nedd4_2介导了上皮钠离子通道和电压门控钾离子通道的泛素化降解过程[25]。
[0014]泛素连接酶E3功能异常与帕金森病的发病密切相关，如Parkin(PARK2)属于一个保守的泛素样和环基序蛋白质家族，是泛素连接酶E3的一种，Parkin基因突变导致蛋白酶体活性降低、线粒体自噬、氧化应激水平增加，参与了帕金森病的发病过程[26]。神经前体细胞表达的发育下调基因4-2(NeuronaI precursor cell Expressed DevelopmentalIyDown-regulated 4-2，Nedd4_2)蛋白质属于泛素连接酶E3的一种，在细胞膜蛋白的泛素化过程中起作用。有研究表明，长期接触锰元素造成的锰中毒症状类似于原发性帕金森病的症状，机体通过激活PKC，导致了 Nedd4-2表达的上调，促进了星形胶质细胞上谷氨酰胺转运体(glutamine transporters)因过度泛素化而表达减少，证实Nedd4_2表达异常参与了猛中毒导致的神经系统症状。目前，尚未有研究涉及Nedd4-2对谷氨酸转运体的调节异常在H)发病过程中的作用及其调节分子机制，我们拟对此进行深入研究。
[0015]参考文献
[1]Chen W， Chen S， Xiao Qj Wang Gj Chen SD.Current clinical practicefor Parkinson’s disease among Chinese physicians, general neurologists andmovement disorders speciali