专利名称：金耳与寄主真菌粗毛韧革菌的dna分子鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种真菌菌种的DNA分子鉴定方法，更具体地说涉及一种金耳与寄主真菌 粗毛韧革菌的核糖体大亚基基因Dl/D2区序列的分子鉴定方法。
背景技术：
金耳7>>ewe//a做ra"Z/a/6a Bandoni et Zang野生分布稀有，为中国特有种。由于生活的特 殊性决定了金耳菌必须寄生于粗毛韧革菌(&ereww; ir幼加/M(Willd.)Fr.)表面，共同形成异质 复合体，因此少量寄主真菌的存在是金耳菌赖以正常生长发育的基础。由于粗毛韧革菌具有 强大的分解和利用木质纤维素等碳水化合物的能力，在金耳的生长发育史中极易处于生长优 势，采用传统的营养体繁殖手段得到的往往是粗毛韧革菌的菌丝培养物，但被误认为是金耳 菌丝，采用这种粗毛韧革菌培养物进行深层发酵难以获得真正意义上的金耳产物。为了克服 这种技术弊病，中国专利(ZL200410022376.9)报道用金耳栽培种的制备方法，将栽培的金 耳的酵母状孢子菌种和寄主真菌粗毛韧革菌分别培养后，按比例混合接种生产金耳子实体(即 担子果)。这就要求培养前须对培养物做出准确鉴定，但单纯采用形态学特征还不能判断菌种 的准确性。中国专利(ZL2004I0022377.3)公开了一种金耳酵母状孢子的培养方法，以克服 金耳子实体产量低的弱点，以寻找金耳的可替代资源，该专利也存在金耳的酵母状孢子菌种 的鉴定问题。
基于DNA序列的分子标记技术，能达到准确鉴定金耳菌种的目的。核糖体DNA在细胞 中以一种协同方式进化，在个体和群体内有着较好的均质性，因此个体的核糖体DNA通常 具有种代表性。真菌核内一个典型的核糖体DNA重复单位约为8 12kb。不同的选择压力作 用于核糖体DNA区域，造成3种核糖体基因及间隔区有不同的进化速度，有的序列比较保 守，有的序列进化比较快。核糖体大亚基基因是一段由保守区与高变区相互镶嵌的DNA片 段，内部还存在一些进化速率相对较快的变异区域，如Dl、 D2区等，这些区域的鉴定适合 从种到属的分类鉴定，是很好的分子标记，也就是金耳菌与粗毛韧革菌的核基因组核糖体大 亚基基因Dl/D2区序列是不相同的。以核糖体大亚基基因Dl/D2区基因序列分析和分子探针 形式应用于金耳菌种和寄主菌种的鉴定中，对菌种的核糖体大亚基基因Dl/D2区序列进行测 序，获得其序列，就可通过对比核糖体大亚基基因D1/D2区序列来达到准确鉴定金耳菌种和 寄主真菌粗毛韧革菌种的目的。
发明内容
本发明的目的是解决上述现有技术存在的不足与问题，提供了一种金耳与寄主真菌粗毛韧革菌的核糖体大亚基基因Dl/D2区序列的分子鉴定方法。
为达到本发明的目的，本发明人从金耳主产区采集了数个金耳样品，所有金耳样品均经 过真菌分类专家鉴定。所测的金耳样品和组成金耳子实体的寄主真菌粗毛韧革菌的核糖体大 亚基基因Dl/D2区序列见序列表，以测得的序列作为菌种鉴定的核糖体大亚基基因Dl/D2区 序列，金耳的核糖体大亚基基因Dl/D2区序列长度为638bp，如SEQIDNO.l所示；寄主真 菌粗毛韧革菌的核糖体大亚基基因Dl/D2区序列长度为607bp，如SEQ ID N0.2所示。金耳 核糖体大亚基基因Dl/D2区G+C含量为49%,寄主真菌粗毛韧革菌核糖体大亚基基因Dl/D2 区G+C含量为52%。
本发明首先建立了一套金耳及寄主真菌粗毛韧革菌的高质量基因组DNA的制备方法，然 后对其核糖体大亚基基因Dl/D2区序列进行了测序，获得了核糖体大亚基基因Dl/D2区序列， 最终可通过对比其核糖体大亚基基因Dl/D2区序列来鉴定金耳菌种和寄主真菌粗毛韧革菌 种，其鉴定方法主要包括以下步骤
(1) 提取待鉴定金耳子实体的基因组DNA;
(2) 以提取得到的基因组DNA样品为模板，用针对核糖体大亚基基因D1/D2区的引物进行聚 合酶链式反应扩增得到金耳和寄主真菌粗毛韧革菌的核糖体大亚基基因Dl/D2片段产物，扩 增的正向引物Pl为5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'，反向引物P2为 5，-GGTCCGTGTTTCAAGACGG- 3，；将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；
(3) 对每一条凝胶电泳条带进行害鹏回收纯化，每样平行重复5次以上，另设双蒸水的聚合酶 链式反应为空白对照组；
(4) 纯化后的DNA进行序列测定，得到金耳的核糖体大亚基基因Dl/D2区序列和组成金耳子实 体的寄主真菌粗毛韧革菌的核糖体大亚基基因Dl/D2区序列，其中测序引物是与聚合酶链式反 应所用引物相同的P1和P2;所有序列至少经过正反两次重复测定，以保证序列的准确性； 建立的核糖体大亚基基因Dl/D2区的全序列，见序列表；
(5) 将待鉴定菌种的菌体按上述步骤进行分析，得到待鉴定菌种的核糖体大亚基基因D1/D2区序 列，将此序列与序列表中已经确定的金耳或寄主真菌粗毛韧革菌的核糖体大亚基基因Dl/D2区 序列进行比较判定，得到分析鉴定结果，判断是否为金耳菌种或寄主真菌粗毛韧革菌菌种。
本发明的金耳与寄主真菌粗毛韧革菌的DNA分子鉴定方法中，待鉴定品种的基因组DNA 提取纯化的方法，其步骤为取菌体材料加入无菌研钵中，同时加入用pH9.0的0.15mol/L三 羟甲基氨基甲烷溶液7mL与pH为8.0的0.05 mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液8mL混合后定容至 100mL配制而成的提取缓冲液，迅速彻底研磨混匀，取研磨后的液体加入无菌离心管中，再 依次加入质量百分浓度为10%的十二烷基磺酸钠溶液和氯化节试剂，混匀，50'C水浴处理，加入等体积的pH为5.0的3mol/L醋酸钠溶液混匀，冰水浴处理，离心取上清，加入等体积 的无水乙醇析出DNA沉淀，离心弃去无水乙醇，加入70-75%的乙醇洗涤沉淀，离心弃去乙 醇，挥干乙醇用无菌水溶解，琼脂糖凝胶电泳分析得到基因组DNA样品。
本发明的金耳与寄主真菌粗毛韧革菌的核糖体大亚基基因Dl/D2区序列的分子鉴定方法 中，其步骤(2)中所述的引物为寡核苷酸，所述的核糖体大亚基基因Dl/D2区序列的聚合酶 链式反应的反应条件如下聚合酶链式反应的50pL反应液含5pL的10x buffer(pH为8.3)、 0.2 mmol/L四种单核苷酸、0.2 nmol/L每种引物、5 U尔LDNA聚合酶0.25 以及100-500 ng DNA模板，其所述核糖体大亚基基因Dl/D2区序列的聚合酶链式反应的反应循环参数为95°C, 预变性5分钟，然后按9fC变性1分钟，50-60'C退火1分钟，72'C延伸20秒钟，循环36次， 最后在72'C延伸8分钟，在4'C终止反应。
本发明与现有技术相比还具有以下有益效果
1、 本发明建立了一套快速、有效的金耳和寄主真菌粗毛韧革菌高质量DNA的提取方法。
2、 本发明提供了金耳和寄主真菌粗毛韧革菌的核糖体大亚基基因D1/D2区序列，利用 它们可以对人工培养的金耳菌种和寄主真菌粗毛韧革菌种进行准确鉴定。
3、 本发明的鉴定方法可以直接用于检测菌种的序列差异，以准确区分和鉴定金耳菌种的 真实性和纯度，为品系鉴定、品种保护、菌种质量控制、有效菌种繁育及金耳的人工栽培提 供可靠技术。
具体实施例方式
下面提供本发明的实施例，但本发明并不仅仅限定于这些实施例。 实施例l金耳7>ewe//a awra^a/6a Bandoni et Zang的核糖体大亚基基因Dl/D2区序列的分子 鉴定方法
本实施例取金耳7>ewe//a awrawto/k Bandoni et Zang菌种CGMCC0179 (中国普通微生 物菌种保藏管理中心)，通过以下步骤进行鉴定
(1)基因组DNA的提取，具体方法如下
无菌收集人工培养的待鉴定孢子菌种的培养3天的菌体0.1 g置于已灭菌的研钵中，加 0.5-1 mL提取缓冲液(提取缓冲液为pH9.0的0.15 mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液7mL与pH为 8.0的0.05 mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液8mL混合后定容至lOOmL配制而成)，研磨混匀；将匀 浆后的液体移入无菌Eppendorf管中，力卩入0.1-0.2 mL质量百分浓度为10%的十二烷基磺酸 钠溶液和0.3-0.6 mL氯化苄试剂，充分混匀，5(TC保温1-2小时；加0.3-0.6 mL 3 mol/L NaOAc
(pH5.0)混匀，冰水浴15-20 min， 6000 r/min室温离心15-20 min;取上清加等体积无水乙 醇室温沉淀20-50 min，去上清，10000 r/min室温离心10-15 min，沉淀用70 °/。乙醇洗一次，风干水溶，4'C保存；1-1.5 。/。Agrose琼脂糖凝胶电泳(100 V电压下电泳30-40min)检测纯 度和分子量范围；提取过程中均以无菌水作空白提取对照，以防止提取和扩增过程中外源 DNA的污染。
(2) 以提取得到的待鉴定孢子菌种的基因组DNA样品为模板，用针对核糖体大亚基基因Dl/D2 区的引物分别进行聚合酶链式反应扩增得到待鉴定孢子菌种核糖体大亚基基因Dl/D2片段产 物，将产物进行琼脂糖凝胶电泳；
其中聚合酶链式反应扩增核基因组DNA核糖体大亚基基因Dl/D2区，正向引物为Pl: 5'"GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3';反向引物为P2: 5'~GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'。
聚合酶链式反应的反应体系采用50 nL内含5 nL的10xbuffer (pH为8.3) ， 0.2 mmol/L 四种单核苷酸，0.2 pmol/L每种引物，5U/piLDNA聚合酶0.25 jiL以及100-500 ng DNA模板， 聚合酶链式反应在TGradient thermocycler (Whatman BiometraTM)上完成。
聚合酶链式反应的反应条件为95'C预变性5分钟，然后按94t:变性1分钟，50-6(TC退 火1分钟，72'C延伸20秒钟，循环36次，最后在72'C延伸8分钟，在4'C终止反应；每样 平行重复5次以上，每次实验设阴性对照(不加DNA模板)用于排除非特异的聚合酶链式 反应产物；扩增产物用1-1.5% (w/v)琼脂糖凝胶电泳鉴定(Marker分子量范围100-1200 bp)。
(3) 对得到的所有凝胶电泳条带分别进行害帔回收纯化，每样平行重复5次以上，另设聚合酶 链式反应无菌水空白对照组。
(4) 纯化后的DNA进行序列测定，确立并得到的待鉴定菌种的核糖体大亚基基因Dl/D2区序列， 其中测序引物采用聚合酶链式反应扩增使用的引物Pl和P2，正向引物为Pl: 5，-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3,，反向引物为P2: 5，-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3，；
测序引物与聚合酶链式反应所用引物相同，所有序列至少经过正反两次重复测定，以保 证序列的准确性。
(5) 将得到的待鉴定的菌种的核糖体大亚基基因D1/D2区序列输入计算机后，用DNAStar软 件包中的Editseq和Seqman进行编辑，用Megalign中Clustal W方法，与已经确定的金耳的 核糖体大亚基基因Dl/D2区序列进行比对判定，通过人工比对也可得出同样的结论，比对后序列 相同可判定该菌种为金耳7Veme〃fl awra"ria/Z a Bandoni et Zang菌种。
实施例2寄主真菌粗毛韧革菌/ >Www (Willd.)Fr.的核糖体大亚基基因Dl/D2区序列
的分子鉴定方法
本实施例取菌体形态为菌丝状的待鉴定菌种，通过以下步骤进行鉴定 (1)基因组DNA的提取，具体方法如下
无菌收集人工培养的待鉴定菌丝菌种的培养5-7天的菌体0.1 g置于已灭菌的研钵中，加0.5-1 mL提取缓冲液(提取缓冲液为pH9.0的0.15 mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液7mL与pH为 8.0的0.05 mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液8mL混合后定容至100mL配制而成)，研磨混匀；将匀 浆后的液体移入无菌Eppendorf管中，加入0.1-0.2 mL质量百分浓度为10%的十二烷基磺酸 钠溶液和0.3-0.6 mL氯化苄试剂，充分混匀，50 "C保温1-2小时；加0.3-0.6 mL 3 mol/LNaOAc (pH5.0)混匀，冰水浴15-20 min， 6000 r/min室温离心15-20 min;取上清加等体积无水乙 醇室温沉淀20-50 min，去上清，10000 r/min室温离心10-15 min，沉淀用70%乙醇洗一次， 风干水溶，4。C保存；1-1.5 。/。Agrose琼脂糖凝胶电泳(100 V电压下电泳30-40min)检测纯 度和分子量范围；提取过程中均以无菌水作空白提取对照，以防止提取和扩增过程中外源 DNA的污染。
(2) 以提取得至啲待鉴定菌丝菌种的基因组DNA样品为模板，用针对核糖体大亚基基因D1/D2 区的引物分别进行聚合酶链式反应扩增得到待鉴定菌丝菌种核糖体大亚基基因Dl/D2片段产 物，将产物进行琼脂糖凝胶电泳；
其中聚合酶链式反应扩增核基因组DNA核糖体大亚基基因Dl/D2区，正向引物为Pl: 5'~GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3，；反向引物为P2: 5'~GGTCCGTGTTTCAAGACGG- 3'。
聚合酶链式反应的反应体系采用50 fiL内含5pL的10x buffer (pH为8.3) ， 0.2 mmol/L 四种单核苷酸，0.2 pmol/L每种引物，5U/jaLDNA聚合酶0.25pL以及100-500ng DNA模板；聚 合酶链式反应在TGradient thermocycler (Whatman BiometraTM)上完成。
聚合酶链式反应的反应条件为95'C预变性5分钟，然后按94'C变性1分钟，50-6(TC退 火1分钟，72'C延伸20秒钟，循环36次，最后在72'C延伸8分钟，在4'C终止反应；每样 平行重复5次以上，每次实验设阴性对照(不加DNA模板)用于排除非特异的聚合酶链式 反应产物；扩增产物用1-1.5% (w/v)琼脂糖凝胶电泳鉴定(Marker分子量范围100-1200 bp)。
(3) 对得到的所有凝胶电泳条带分别进行割胶回收纯化，每样平行重复5次以上，另设聚合酶 链式反应无菌水空白对照组。
(4) 纯化后的DNA进行序列测定，确立并得到的待鉴定菌种的核糖体大亚基基因D1/D2 区序列，其中测序引物采用聚合酶链式反应扩增使用的引物P1和P2，正向引物为P1: 5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'，反向引物为P2: 5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3';
测序引物与聚合酶链式反应所用引物相同，所有序列至少经过正反两次重复测定，以保 证序列的准确性。
(5) 将所得待鉴定菌种的核糖体大亚基基因Dl/D2区序列输入计算机后，用DNAStar软件包 中的Editseq和Seqman进行编辑，用Megalign中Clustal W方法，与已经确定的金耳寄主真 菌粗毛韧革菌的核糖体大亚基基因Dl/D2区序列进行比对判定，通过人工比对也可得出同样的结论，比对后序列相同可判定待鉴定菌种为寄主真菌粗毛韧革菌Ww^wm (WiUd.)Fr.菌种。 实施例3
本实施例取菌体形态为酵母状的待鉴定菌种，通过以下步骤进行鉴定
(1) 基因组DNA的提取，具体方法如下 无菌收集待鉴定的孢子菌种的培养3天的菌体0.1 g置于已灭菌的研钵中，加0.5-1 mL
提取缓冲液(提取缓冲液为pH9.0的0.15 mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液7mL与pH为8.0的0.05 mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液8mL混合后定容至100mL配制而成)，研磨混匀；将匀浆后的液体 移入无菌Eppendorf管中，加入0.1-0.2 mL质量百分浓度为10%的十二垸基磺酸钠溶液和 0.3-0.6 mL氯化节试剂，充分混匀，50 。C保温1-2小时；加0.3-0.6 mL 3 mol/LNaOAc (pH 5.0) 混匀，冰水浴15-20 min, 6000 r/min室温离心15-20 min;取上清加等体积无水乙醇室温沉淀 20-50 min，去上清，10000 r/min室温离心10-15 min，沉淀用70%乙醇洗一次，风干水溶，4°C 保存；1-1.5 。/。Agrose琼脂糖凝胶电泳(100V电压下电泳30-40min)检测纯度和分子量范围； 提取过程中均以无菌水作空白提取对照，以防止提取和扩增过程中外源DNA的污染。
(2) 以提取得到的待鉴定孢子菌种的基因组DNA样品为模板，用针对核糖体大亚基基因D1/D2 区的引物分别进行聚合酶链式反应扩增得到待鉴定孢子菌种核糖体大亚基基因Dl/D2片段产 物，将产物进行琼脂糖凝胶电泳；
其中聚合酶链式反应扩增核基因组DNA核糖体大亚基基因D1/D2区，正向引物为P1: 5'~GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3';反向引物为P2: 5'~GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'。
聚合酶链式反应的反应体系采用50jiL内含5[iL的10x buffer (pH为8.3) , 0.2 mmol/L 四种单核苷酸，0.2 nmol/L每种引物，5U/nLDNA聚合酶0.25pL以及100-500ng DNA模板，聚 合酶链式反应在TGradient the皿ocycler (Whatman BiometraTM)上完成。
聚合酶链式反应的反应条件为95'C预变性5分钟，然后按94'C变性1分钟，50-6(TC退 火1分钟，72'C延伸20秒钟，循环36次，最后在72'C延伸8分钟，在4'C终止反应；每样 平行重复5次以上，每次实验设阴性对照(不加DNA模板)用于排除非特异的聚合酶链式 反应产物；扩增产物用1-1.5% (w/v)琼脂糖凝胶电泳鉴定(Marker分子量范围100-1200 bp)。
(3) 对得到的所有凝胶电泳条带分别进行割胶回收纯化，每样平行重复5次以上，另设聚合酶 链式反应无菌水空白对照组。
(4) 纯化后的DNA进行序列测定，确立并得到的待鉴定菌种的核糖体大亚基基因Dl/D2区序列， 其中测序引物采用聚合酶链式反应扩增使用的引物Pl和P2，正向引物为Pl: 5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'，反向引物为P2: 5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3';
测序引物与聚合酶链式反应所用引物相同，所有序列至少经过正反两次重复测定，以保证序列的准确性。
(5)将得到的待鉴定的菌种的核糖体大亚基基因D1/D2区序列输入计算机后，用DNAStar软 件包中的Editseq和Seqman进行编辑，用Megalign中Clustal W方法，与已经确定的金耳的 核糖体大亚基基因D1/D2区序列进行比对判定，通过人工比对也可得出同样的结论，比对后序列 相同可判定该菌种为金耳做ra"Ha/6fl Bandoni et Zang菌种。卿U跳E LISTING
〈110〉江苏同源堂生物工程有限公司
〈120〉金耳与寄主真菌粗毛韧革菌的DNA分子鉴定方法
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〈210>1
<211>638
〈212〉廳
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〈210〉2
〈211〉607
〈212〉DNA
〈213〉粗毛韧革菌(S""wm Wra^wm (Willd.)Fr.)
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cgg3cc权利要求
1、一种金耳与寄主真菌粗毛韧革菌的核糖体大亚基基因D1/D2区序列，其特征在于，所述的金耳的核糖体大亚基基因D1/D2区，具有SEQ ID NO.1所示的序列；寄主真菌粗毛韧革菌的核糖体大亚基基因D1/D2区，具有SEQ ID NO.2所示的序列。
2、 一种利用权利要求1所述的序列鉴定金耳与寄主真菌粗毛扨革菌的方法，包括以下步骤(1) 提取待鉴定人工培养菌种的菌体的基因组DNA;(2) 以步骤(1)提取得到的DNA样品为模板，用针对核糖体大亚基基因D1/D2区的引物 进行聚合酶链式反应扩增得到待鉴定菌种的核糖体大亚基基因Dl/D2片段产物，将产物进行 琼脂糖凝胶电泳纯化；(3) 将步骤(2)纯化后的DNA进行序列测定，获得待鉴定菌种的核糖体大亚基基因Dl/D2 区序列；(4) 将步骤(3)得到的序列与SEQIDNO.l和SEQ ID N0.2的序列分别进行比较，判断是 否为金耳菌种或寄主真菌粗毛韧革菌菌种。
全文摘要
本发明涉及一种金耳与寄主真菌粗毛韧革菌的核糖体大亚基基因D1/D2区序列的分子鉴定方法。金耳的核糖体大亚基基因序列如SEQ ID NO.1所示；寄主真菌粗毛韧革菌的核糖体大亚基基因D1/D2区序列如SEQ ID NO.2所示。所说的鉴定方法是提取得到待鉴定菌种的核糖体大亚基基因D1/D2区序列，将此序列与SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2序列进行比较判定，判断是否为金耳菌种或寄主真菌粗毛韧革菌菌种。利用本发明方法可以对人工培养的金耳菌种和寄主真菌粗毛韧革菌种进行准确鉴定。为品系鉴定、品种保护、菌种质量控制、有效菌种繁育及金耳的人工栽培提供可靠技术。
文档编号C12Q1/68GK101314795SQ20081012443
公开日2008年12月3日 申请日期2008年7月16日 优先权日2008年7月16日
发明者俞建国, 刘春卉, 瞿伟箐, 马维新 申请人:江苏同源堂生物工程有限公司