桑枝提取物或萃取物在制备抗真菌感染产品中的应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体涉及桑枝提取物或萃取物在制备抗真菌感染产品中的应用。

背景技术：

随着生活水平的逐渐提高，人们的卫生防病意识也在不断的加强。真菌是细菌的一种，能引起动植物和人的各种疾病。不同真菌可以通过不同的方式致病，可以分为以下几种：(1)致病性真菌感染：由外源性真菌引起，如皮肤癣病菌；(2)条件致病性真菌感染：由内源性真菌引起，如白色念珠菌等；(3)真菌超敏反应性疾病：吸入或食入菌丝或孢子引起荨麻疹、哮喘等；(4)真菌性中毒症：食用含真菌毒素的霉变粮食所致；(5)真菌毒素：与肿瘤发生有关。

人类感染的真菌主要来自外界环境，并通过接触、吸入或食入而感染。少数致病真菌可直接致病，但多数真菌需要在一定条件下才能致病，后者称为条件致病菌。其中，皮肤癣菌中的红色毛癣菌通过接触传染，感染指(趾)甲形成足癣，还可以感染而引起头癣、体癣、股癣、手癣等。而足癣，俗称脚气，具有传染性，其难以治愈、容易交叉传染，不及时治疗，久而久之会引发灰指甲的形成，同时抓挠后极易引发身体其他部位的真菌感染，严重影响人们的生活质量。用于临床的抗真菌药皆因不能渗透角质而对治疗灰指(趾)甲无效。从前的主要治疗方法为手术拔除指(趾)甲，多人畏其疼痛而为难，成为许多人特别是年轻人心头之烦恼。目前，用于治疗灰指甲的方法有口服药和外用药两大类。口服药主要是抗真菌药物类，如斯皮仁诺(别名：伊曲康唑、依康唑、伊康唑、依他康唑)，但口服药往往会给人体带来较大的伤害；久而久之，容易引起指(趾)甲对红色毛癣菌的耐药性等很多副作用，且安全性也不断受到质疑。外用药物，如硝酸咪康唑、复方苯甲酸软膏等西药类，通过涂抹患处，杀灭真菌治疗，但是此类药物往往具有很大的刺激性，使用时还可能会带来灼烧感和刺痛感，严重时难以忍受，且复发率较高。

同样，白色念珠菌为条件致病性真菌，常寄生于人的皮肤、口腔、阴道和肠道粘膜处。随着免疫功能低下或免疫缺陷的病人日益增多，其感染率不断增加。其可侵犯人体许多部位，如皮肤皱褶处(腑窝、腹股沟，乳房下，肛门周围及甲沟，指间)，引起皮肤潮红、潮湿、发亮，有时病变周围有小水泡等症状，同时还会引起鹅口疮、口角炎、阴道炎、浅表溃疡、肺炎、肠胃炎、心内膜炎、脑膜炎、脑炎等，偶尔也可发生败血症。近年来，由于广谱抗菌药物、激素、免疫抑制剂等药物的大量应用，介入手术的普及，恶性肿瘤、艾滋病等疾病发病率逐年上升等因素，使得念珠菌感染发病率逐年升高。目前，唑类药物是临床治疗和预防白色念珠菌感染的首选药物，唑类药物的大量应用，在治疗白色念珠菌感染的同时又使白色念珠菌的耐药性提高。

因此，开发研究一种新型、高效、天然的抗真菌感染产品是目前所急需的，也是现代医学研究的热点。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供桑枝提取物或萃取物在制备抗真菌感染产品中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、桑枝提取物或萃取物在制备抗真菌感染产品中的应用。

进一步，所述真菌为红色毛癣菌或白色念珠菌。

进一步，所述桑枝提取物的制备方法为：

(1)取桑枝烘干粉碎后过100目筛，获得桑枝粉末；

(2)将步骤(1)中制得的桑枝粉末加入无水乙醇或甲醇中，经提取获得提取液，将所述提取液浓缩至浸膏，即得桑枝提取物ⅰ；

或将步骤(1)中制得的桑枝粉末加入石油醚中，经提取获得提取液，将所述提取液浓缩至浸膏，即得桑枝提取物ⅱ；将经石油醚提取后的桑枝粉末加入乙酸乙酯、氯仿或丙酮中，经提取获得提取液，将所述提取液浓缩至浸膏，即得桑枝提取物ⅲ；将经乙酸乙酯、氯仿或丙酮提取后的桑枝粉末加入正丁醇中，经提取获得提取液，将所述提取液浓缩至浸膏，即得桑枝提取物ⅳ；将经正丁醇提取后的桑枝粉末加入水中，经提取获得提取液，将所述提取液浓缩至浸膏，即得桑枝提取物ⅴ。

进一步，步骤(2)中，所述桑枝粉末与无水乙醇或甲醇的质量体积比为1mg：20ml。

进一步，步骤(2)中，所述桑枝粉末与石油醚的质量体积比为1mg：20ml；所述经石油醚提取后的桑枝粉末与乙酸乙酯、氯仿或丙酮的质量体积比为1mg：20ml；所述经乙酸乙酯、氯仿或丙酮提取后的桑枝粉末与正丁醇的质量体积比为1mg：20ml；所述经正丁醇提取后的桑枝粉末与水的质量体积比为1mg：20ml。

进一步，步骤(2)中，所述提取具体为在350w下微波提取三次，每次30min。

进一步，所述桑枝萃取物的制备方法为：

(1)取桑枝烘干粉碎后过100目筛，获得桑枝粉末；

(2)将步骤(1)中制得的桑枝粉末加入无水乙醇或甲醇中，经提取获得提取液，将所述提取液浓缩至浸膏，即得桑枝提取物ⅰ；将所述桑枝提取物ⅰ溶于水中，获得桑枝提取物ⅰ水溶液，将所述桑枝提取物ⅰ水溶液加入石油醚中，经萃取获得萃取液，将所述萃取液浓缩至浸膏，即得桑枝萃取物ⅰ；将经石油醚萃取后的桑枝提取物ⅰ水溶液加入乙酸乙酯、氯仿或丙酮中，经萃取获得萃取液，将所述萃取液浓缩至浸膏，即得桑枝萃取物ⅱ；将经乙酸乙酯、氯仿或丙酮萃取后的桑枝提取物ⅰ水溶液加入正丁醇中，经萃取获得萃取液，将所述萃取液浓缩至浸膏，即得桑枝萃取物ⅲ；将经正丁醇萃取后的桑枝提取物ⅰ水溶液浓缩至浸膏，即得桑枝萃取物ⅳ。

进一步，步骤(2)中，所述桑枝粉末与无水乙醇或甲醇的质量体积比为1mg：20ml。

进一步，步骤(2)中，所述桑枝提取物ⅰ水溶液与石油醚的体积比为1：1；所述经石油醚萃取后的桑枝提取物ⅰ水溶液与乙酸乙酯、氯仿或丙酮的体积比为1：1；所述经乙酸乙酯、氯仿或丙酮萃取后的桑枝提取物ⅰ水溶液与正丁醇的体积比为1：1。

进一步，步骤(2)中，所述提取具体为在350w下微波提取三次，每次30min。

本发明的有益效果在于：本发明公开了桑枝提取物或萃取物在制备抗真菌感染产品中的应用，桑枝提取物或萃取物成分天然、安全性好，对红色毛癣菌和白色念珠菌均具有良好的抗菌能力，能很好用于新型、高效、天然的抗真菌感染药物的研发。其中，桑枝的乙酸乙酯萃取液对红色毛癣菌和白色念珠菌的抗菌能力最好，对两种菌的最小抑菌浓度分别为1mg/ml、0.5mg/ml。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为实施例2中不同浓度的样液1-5对红色毛癣菌的抑菌率图。

具体实施方式

下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件按照制造厂商所建议的条件。

本发明实施例中使用的材料及主要试剂如下：rpm-1640培养基(含l-谷酰胺，不含碳酸氢钠，含ph指示剂)，购于上海士丰生物科技有限公司；二甲基亚砜(dmso)、mtt，购于上海生工生物工程有限公司；无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇，均为分析纯，购于重庆川东化工集团有限公司；

桑枝(湖桑32号)，采自重庆市蚕业科学技术研究院桑树资源圃；

红色毛癣菌，编号为atcc28188，购买于上海士丰生物科技有限公司；

白色念珠菌，编号为cmcc(f)98001，购买于中国兽药所。

实施例1

桑枝提取物和萃取物的制备

1、桑枝提取物的制备

(1)取无病虫害桑枝，烘干粉碎后过100目筛，获得桑枝粉末；

(2)将步骤(1)中制得的桑枝粉末加入无水乙醇中，在350w下微波提取三次，每次30min，收集每次的提取液并混合，将提取液浓缩至浸膏，即得桑枝提取物ⅰ；所述桑枝粉末与无水乙醇的质量体积比为1mg：20ml，将制得的桑枝提取物ⅰ溶于100％的二甲基亚砜制得浓度为100mg/ml的样液1，存于-20℃冰箱备用。

2、桑枝萃取物的制备

(1)取无病虫害桑枝，烘干粉碎后过100目筛，获得桑枝粉末；

(2)将步骤(1)中制得的桑枝粉末加入无水乙醇中，在350w下微波提取三次，每次30min，收集每次的提取液并混合，将提取液浓缩至浸膏，即得桑枝提取物ⅰ，所述桑枝粉末与无水乙醇的质量体积比为1mg：20ml；将所述桑枝提取物ⅰ溶于水中，获得桑枝提取物ⅰ水溶液，按体积比1：1将所述桑枝提取物ⅰ水溶液加入石油醚中，经萃取获得萃取液，将所述萃取液浓缩至浸膏，即得桑枝萃取物ⅰ，将制得的桑枝萃取物ⅰ溶于100％的二甲基亚砜制得浓度为100mg/ml的样液2，存于-20℃冰箱备用；按体积比1：1将经石油醚萃取后的桑枝提取物ⅰ水溶液加入乙酸乙酯中，经萃取获得萃取液，将所述萃取液浓缩至浸膏，即得桑枝萃取物ⅱ，将制得的桑枝萃取物ⅱ溶于100％的二甲基亚砜制得浓度为100mg/ml的样液3，存于-20℃冰箱备用；按体积比1：1将经乙酸乙酯萃取后的桑枝提取物ⅰ水溶液加入正丁醇中，经萃取获得萃取液，将所述萃取液浓缩至浸膏，即得桑枝萃取物ⅲ，将制得的桑枝萃取物ⅲ溶于100％的二甲基亚砜制得浓度为100mg/ml的样液4，存于-20℃冰箱备用；将经正丁醇萃取后的桑枝提取物ⅰ水溶液浓缩至浸膏，即得桑枝萃取物ⅳ，将制得的桑枝萃取物ⅳ溶于100％的二甲基亚砜制得浓度为100mg/ml的样液5，存于-20℃冰箱备用。

实施例2

桑枝提取物和萃取物对红色毛癣菌的最小抑菌浓度(mic)检测

用二倍稀释法将实施例1中样液1-5用rpm-1640培养基分别稀释为2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、0.063、0.031、0.015mg/ml八个浓度。取96孔细菌培养板，每孔加入100μl浓度为10⁶cfu/ml的红色毛癣菌菌液及100μl各浓度的样液，并设置空白对照(不含样液的培养基+菌液)和溶剂对照(dmso溶液+菌液)，同时设置对照培养板(不加菌液)。28℃恒温培养箱中培养93h，通过肉眼观察，得出各样液最小抑菌浓度，结果见表1。然后将96孔培养板取出，每孔加入20μl5.0mg/ml的mtt试剂，28℃恒温孵育3-4h后，取出96孔培养板，2500r/min离心5min，每孔吸出100μl上清液弃去，再加入100μl二甲亚砜，震荡30min后再次离心，将上清液转移至新96孔板中，酶标仪530nm下检测吸光值，根据实验数据通过公式：抑制率(％)＝(1-测定孔od530nm值/空白对照孔od530nm值)×100计算其抑菌率，结果见表2，并绘制成图，如图1所示，由表2和图1可知：各样液对红色毛癣菌的抑制效果均为浓度依赖型，桑枝提取物及其各萃取物对红色毛癣菌具有一定的抑菌作用。其中，样液3在浓度为1mg/ml时，能够完全抑制红色毛癣菌的生长，则其最小抑菌浓度(mic)为1mg/ml；其次是样液1和样液2，当浓度为1mg/ml时，其抑制率为83.10％和84.31％；样液4和样液5活性相对较差，但在浓度为1mg/ml时，也具有一定的抑制活性，其抑制率分别为50.98％和44.44％。

表1样液1-5作用于红色毛癣菌的最小抑菌浓度

注：样液1为桑枝的无水乙醇提取液，样液2为桑枝的石油醚萃取液，样液3为桑枝的乙酸乙酯萃取液，样液4为桑枝的正丁醇萃取液，样液5为桑枝的水萃取液。

由表1可知，样液1-5对红色毛癣菌均具有抑菌作用，其中，样液3对红色毛癣菌的抑制活性最好，即桑枝的乙酸乙酯萃取物对红色毛癣菌的抑制活性最好，最小抑菌浓度为1.00mg/ml，样液1、样液2、样液4和样液5对对红色毛癣菌的最小抑菌浓度均大于1.00mg/ml。

表2不同浓度的样液1-5对红色毛癣菌的抑菌率

注：肩字母相同表示差异不显著，肩字母不同表示差异显著(p<0.01)，样液1为桑枝的无水乙醇提取液，样液2为桑枝的石油醚萃取液，样液3为桑枝的乙酸乙酯萃取液，样液4为桑枝的正丁醇萃取液，样液5为桑枝的水萃取液。

实施例3

桑枝提取物和萃取物对白色念珠菌的最小抑菌浓度(mic)检测

用二倍稀释法将实施例1中样液1-5用rpm-1640培养基分别稀释为2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、0.063、0.031、0.015mg/ml八个浓度。取96孔细菌培养板，每孔加入100μl浓度为10⁶cfu/ml的白色念珠菌菌液及100μl各浓度的样液，并设置空白对照(不含样液的培养基+菌液)和溶剂对照(dmso溶液+菌液)，同时设置对照培养板(不加菌液)。28℃恒温培养箱中培养48h。经测试发现样液3对白色念珠菌的抑菌作用最好，即桑枝的乙酸乙酯萃取物对白色念珠菌的抑菌作用最好，其最小抑菌浓度为0.5mg/ml。

实施例4

桑枝提取物和萃取物对白色念珠菌的最小杀菌浓度检测

在实施例3中最小抑菌浓度的基础上，按照mic的试验方法，将样液3配置为2倍mic、4倍mic、8倍mic、16倍mic，取96孔细菌培养板，每孔加入100μl浓度为10⁶cfu/ml的白色念珠菌菌液，再加入100μl相应浓度的各样液，并设置空白对照(不含样液的培养基+菌液)和溶剂对照(dmso溶液+菌液)。28℃培养箱中培养48h，然后每孔取20μl菌液接种在新鲜的营养琼脂培养基上，过夜培养，无活菌生长的最小浓度即为最小杀菌浓度，经测试发现样液3，即桑枝的乙酸乙酯萃取物对白色念珠菌的最小杀菌浓度>1mg/ml。

本发明中，除了用无水乙醇制备桑枝提取物，还可用甲醇；除了用乙酸乙酯制备桑枝萃取物，还可用氯仿或丙酮。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。