专利名称：桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物在制备抑制尿酸重吸收转运子药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物，具体涉及桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物组分 和在制备抑制尿酸重吸收转运子药物中的新用途，以及以该化合物为活性成分的用于制备抑 制尿酸重吸收转运子药物组合物。
背景技术：
近年来，国内外大量流行病学研究表明高尿酸血症/痛风的患病率正逐年升高，高尿酸血 症不仅诱发痛风性关节炎、尿石症、尿酸性肾病，而且血尿酸水平升高与脂质代谢异常、肥 胖等疾病密切相关，高尿酸血症/痛风已成为威胁人类健康的重要疾病。尿酸排泄减少和/或生 成增加是原发性高尿酸血症的主要病因。嘌呤代谢过程中关键酶的缺陷所导致的嘌呤利用障 碍和/或嘌呤氧化酶的活性增强是尿酸生成增加的主要原因，肾近端小管对尿酸的重吸收增加 和/或分泌减少是尿酸排泄减少的主要原因。尿酸排出减少或生成增加，可导致血液中尿液浓 度增高，直接或间接引起相关疾病。尿酸的排泄是一复杂过程，尿酸随血液循环流入肾小球
时，游离型的尿酸将全部滤过，在近端肾小管约99%尿酸盐被重吸收。
研究表明尿酸排泄过程受多种基因和表达产物共同调控，是一个复杂过程。由于尿酸带 负电荷，不能自由通过细胞膜脂质双层，因此肾小管对尿酸的排泄依赖于离子通道。有学者 发现，有一些尿酸盐转运蛋白参与了近曲肾小管对尿酸盐的重吸收和主动分泌。而且有研究 发现，通过肾皮质细胞膜的尿酸转运有两种方式:一种是通过电中性的阴离子转运体与一系列 有机和无机阴离子的交换来转运尿酸盐；另一种是通过产电的尿酸盐转运体，它是一种单向 转运体。近年来,已从分子水平证实4种蛋白质参与了尿酸盐的转运产电的尿酸盐单向转运 体(UAT);有机阴离子转运体(OAT)家族的两种蛋白OATl(Ichida K, Hosoyamada M, Kimura H， etal. Urate transport via human PAH trans porter hOATl and its gene structure [ J ]. Kid ney Int, 2003, 63: 143-155)和OAT3(Cha SH, Sekine T, Fukushima J I, et al. Identification and characterization of human organic anion transporter 3 exp ressing predominantly in the kidney[ J ]. Mol Pharmacol, 2001, 59: 1277-1286)参与了尿酸盐的转运；与OAT4有部分同源性的蛋白质,命 名为人尿酸盐阴离子交换器(URAT1),已证实它主要参与尿酸的重吸收(Enomoto A, KimuraH， Chairoungdua A, et al. Molecular identification of a renal urate anion exchanger that regulates blood urate levels[ J ]. Nature, 2002, 417: 4472452.)。
桑枝(Ramulus mori)是桑科植物桑(Morus alba L.)的一年生干燥嫩枝，作为民间常用中草 药，中国药典记载桑枝具有祛风湿、利关节、行水之功效，适用于风寒湿痹、四肢拘挛、脚
气浮肿之病症。其所含化学成分种类较多，主要有多糖、黄酮类化合物、香豆素类化合物、生物碱，此外还含有挥发油、氨基酸、有机酸及各种维生素等。另有报道桑枝中含有二苯乙 烯类化合物桑皮苷。虽然桑枝有较好的临床基础，但一直没有找到适当的成分进行质量监控。
发明内容
本发明的目的在于公开桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物的新用途，具体的说是提供桑枝黄 酮和二苯乙烯类提取物的质量标准和在制备抑制尿酸重吸收转运子药物中的应用，以及以该 化合物为活性成分的用于制备抑制尿酸重吸收转运子药物组合物。
本发明的技术解决方案之一桑枝通过水醇法，大孔吸附树脂柱洗脱得到的桑枝黄酮和 二苯乙烯类提取物，以Quercetin-3-0-p-D-mannopyranoside为对照品经紫外分光光度法和 HPLC法分别测得黄酮类化合物重量比含量为30X-70。/。；以桑皮苷为对照品经紫外分光光度 法和HPLC法分别测得二苯乙烯类化合物重量比含量为30 % -70°/o。
本发明的技术解决方案之一提供桑枝黄酮和一苯乙烯类提取物在制备抑制尿酸重吸收 转运子药物中的新用途，以及以该化合物为活性成分和药学上可接受的载体的用于制备抑制 尿酸重吸收转运子药物组合物。包括了以本发明所述的桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物，配以
常用的药用辅料(如赋形剂、助溶剂、控释剂)，制成各种剂型包括口服液、注射剂、胶囊
剂、片剂、颗粒剂、微囊剂，用于制备抑制尿酸重吸收转运子药物。
上文所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如稀释剂、赋形剂如 水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮； 湿润剂如廿油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂 如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、聚乙一 醇等。另外还可以组合物屮加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
本发明化合物可以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用于需 要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、颗粒剂、胶囊剂等， 制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其 制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。优选的形式是片剂、胶囊剂、栓剂、鼻喷雾剂和注 射剂，特别优选在肠道的特定部位释放的制剂。
本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分 与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。
本发明化合物的使用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗疾病的类型和严重 程度等变化，确定其日剂量，可以一次或多次施用。
本发明所得桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物的组分可作为临床制剂原料的质量标准，亦可 作为制剂的质量标准。
4本发明利用高尿酸血症动物模型在基因转录水平和蛋白表达水平上科学地评价并确定了 桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物对尿酸重吸收转运子的抑制调节作用。
本发明所涉及的桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物对模型动物表达异常增高的尿酸重吸收转 运子具有确切的抑制作用；而对正常动物的正常水平的尿酸重吸收转运子表达无显著抑制作 用，具有很好的安全性。
本发明的优点是，提供了对尿酸重吸收转运子具有确切抑制作用的桑枝黄酮和二苯乙烯 类提取物，用于制备抑制尿酸重吸收转运子药物，可用于治疗与尿酸重吸收转运子异常高表 达相关的疾病。与针对痛风或高尿酸血症的发明比较，本发明提供的桑枝黄酮和二苯乙烯类 提取物新用途具有三个明显的进步和优点1、药效成分明确(分别为黄酮类化合物重量比含 量30%-70%和二苯乙烯类化合物重量比含量为30%-70%); 2、作用靶点明确(尿酸重吸收转 运子)3、调节作用明确(抑制调节)。
为更好的理解本发明的实质，下面用桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物的提取分离、药理实 验及结果来说明其在制备抑制尿酸重吸收转运子药物中的应用。
图1为ER对小鼠高尿酸血症血清尿酸水平的影响结果图2为ER对小鼠肝脏尿酸水平的影响结果图3为ER对小鼠高尿酸血症肝脏XOD的影响结果图4为肝脏XOD蛋白水平结果图5为肾脏URAT1蛋白水平结果图6为肝脏XOD mRNA水平结果图7为肾脏URAT1 mRNA水平结果图。
具体实施例方式
实施例l:
桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物的制备
(1) 取干燥桑枝，热回流三次，每次加7倍60%乙醇，每次2小时，合并提取液，滤过，
滤液经减压浓縮至每ml药液含有0.5g药材，放冷，过滤，弃去药渣。
(2) 取滤液，按流速为14BV/h上已预处理好的HPD-600型大孔吸附树脂柱，以2~6倍 量柱床体积的蒸馏水洗脱，流速为l-4BV/h，弃去水洗脱液，再以2—6倍量柱床体积的60% 乙醇按l一BV/h的速度洗脱，收集洗脱液，回收乙醇并浓縮至稠膏，减压干燥，得干浸膏。
(3) 以桑皮苷为对照品，按照药典法测定桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物中二苯乙烯类化合 物重量比含量30%-70%。(4)以Quercetin-3-O-p-D-mannopyranoside为对照品，按照药典法测定桑枝黄酮和二苯乙 烯类提取物中黄酮类化合物重量比含量为30%-70%。 实施例2:
桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物对尿酸重吸收转运子的抑制调节作用
氧嗪酸钾盐是一种尿酸酶抑制剂，可诱导抑制尿酸分解，增加体内血清尿酸水平，造成 高尿酸血症动物模型，国际上普遍用其评价药物的抗高尿酸血症和痛风作用。本发明亦采用 高尿酸血症模型动物验证药物的降尿酸疗效，疗效可靠，效果显著。
具体实施例方式
1. 实验动物昆明种小鼠，体重24士2g，雄性。
2. 药物配制桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物(ER)、别嘌呤醇分散于生理盐水中，用于灌胃 给药，给药剂量分别为低剂量300mg/kg、高剂量为600 mg/kg， Apu=5 mg/kg。
3. 实验材料HPD—600型大孔吸附树脂，Trizol Reagment(Invigen)，氯仿，异丙醇，无水 乙醇，DEPC， M-MLV反转录酶，PCR试剂盒，RIPA裂解液，尿酸试剂盒，肌酐试剂盒。
4. 实验仪器高速冷冻离心机，高速匀浆机，Bio-radio-rad垂直电泳槽，MBI-PCR仪、水平 电泳槽等.
5. 实验模型高尿酸血症模型
6. 模型的建立动物适应环境l周后，灌胃给予氧嗪酸钾盐250 mg/kg;对照给予等体积生 理盐水，造模周期7天。
7. 给药造模期间同时给药，在给予氧嗪酸钾盐造模/生理盐水对照lh后，分组灌胃给予桑
枝黄酮和二苯乙烯类提取物(ER)两个剂量300 mg/kg、600 mg/kg，别嘌呤醇(Apu)5 mg/kg，
对照组给予生理盐水。
8. 小鼠处死及组织的保存小鼠灌胃给予桑皮苷/生理盐水后lh处死，取血、尿液，冰台上 分离肝脏、肾脏组织，组织经液氮冷冻后保存于-8(TC，待测。
9. 蛋白质印迹法(Western-blotting):提取小鼠肝脏、肾脏组织刷状缘膜蛋白，提取蛋白经12 %的SDS-PAGE胶电泳分离后，PVDF转膜，封闭液封闭1小时后加入mURATl抗体(根 据NCBI数据库mURATl蛋白序列制备，使用浓度为1:4000)4。C孵育过夜，二抗(1:4000) 室温摇床孵育l小时，HRP-ECL发光，暗室曝光显影。胶片扫描后对图片灰度分析。
11.逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR):鼠组织(肝脏或肾脏)O.lg加入lml的Trizol Reagent (Invitrogen)，按照试剂盒的要求提取RNA， RNA逆转录到cDNA模板，根据NCBI数据 库mURATl基因设计引物，进行mURATl目的基因扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后 UV成像，对图片进行灰度分析。12.实验结果
(1) ER对高尿酸血症小鼠血清尿酸水平的影响，结果见图l。
+++P < 0.001, ++P < 0.01, +P < 0.05与空白组比较；***P < 0週,"P < 0.01, *P < 0.05与模型
组比较
(2) ER对小鼠肝脏尿酸水平的影响，结果见图2。 +++P < 0.001, ++P < 0.01, +P < 0.05与空白组比较；***P < 0.001,**P < 0.01， *P < 0.05与模型
组比较
(3) ER对小鼠高尿酸血症肝脏XOD的影响，结果见图3。
+++P < 0.001, ++P < 0.01, +P < 0.05与空白组比较；***P < 0.001，**P < 0.01, *P < 0.05与模型
组比较
(4) 蛋白质印迹法Western-blotting
a. 肝脏XOD蛋白水平，结果见图4。
b. 肾脏URAT1蛋白水平，结果见图5。
+++P < 0.001, ++P < 0.01, +P < 0.05与空白组比较；***P < 0.001,**P < 0.01, *P < 0.05与模型
组比较
(5) 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)
a. 肝脏XOD mRNA水平，结果见图6。
b. 肾脏URAT1 mRNA水平，结果见图7。
+++P < 0.001, ++P < 0.01， +P < 0.05与空白组比较；***P < 0.001,**P < 0.01, *P < 0.05与模型
组比较
结果桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物可显著降低高尿酸血症模型下动物血清尿酸水平、 肝脏尿酸水平，而对正常动物血清尿酸水平和肝脏尿酸水平无显著影响，表明桑枝黄酮和二 苯乙烯类提取物可安全有效地治疗和预防高尿酸血症和痛风。桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物
能显著抑制模型小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶(XOD)的活性及其mRNA和蛋白表达、肾脏mURATl mRNA和蛋白表达，表明桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物的降尿酸作用与其抑制XOD活性和 抑制尿酸重吸收转运子mURATl mRNA和蛋白表达有关，以降低高尿酸血症动物尿酸合成和 增加排泄，达到降尿酸作用。表明桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物可用来制备抑制尿酸重吸收 转运子mURATl药物。
权利要求
1. 桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物在制备抑制尿酸重吸收转运子药物中的应用。
2. 根据权利要求1所述的桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物在制备抑制尿酸重吸收转运子药物 中的应用，其特征在于，所述的桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物中黄酮类化合物重量比含量 为30%-70%， 二苯乙烯类化合物重量比含量30%-70%。
3. 用于制备抑制尿酸重吸收转运子药物组合物，其中含有制备抑制尿酸重吸收转运子药物有 效量的权利要求1或2所述的桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物和药学上可接受的载体；用 该组合物作为药效成分来制备抑制尿酸重吸收转运子药物制剂，可单独或与制药可接受的 赋形剂等结合，按照常规方法制成口服液、胶囊剂、片剂、颗粒剂、靶向制剂等剂型。
全文摘要
本发明公开了桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物的组分和新用途。动物试验结果表明桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物对高尿酸血症模型动物表达异常增高的尿酸重吸收转运子具有确切的抑制作用，而对正常动物正常水平的尿酸重吸收转运子表达无显著抑制作用，具有很好的安全性。利用桑枝黄酮和二苯乙烯类提取物配以相关药用辅料，用常规的制剂方法可制成抑制尿酸重吸收转运子的药物，以及以该化合物为活性成分的用于制成抑制尿酸重吸收转运子的药物组合物，可用于治疗与尿酸重吸收转运子异常高表达相关的疾病。
文档编号A61P19/06GK101502563SQ200910095840
公开日2009年8月12日 申请日期2009年2月12日 优先权日2009年2月12日
发明者孔令东, 宪 张, 星 王, 王彩萍, 胡季强, 胡林水, 珺 郑, 黄正标 申请人:浙江康恩贝制药股份有限公司;南京大学