专利名称：来自大丽轮枝菌的分泌型激发子蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种分泌型激发子蛋白及其编码基因与应用，特别涉及一种来源于大丽轮枝菌的分泌型激发子蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
由土壤丝状真菌大丽轮枝菌(Verticilliu dahliae Kleb.)所引起的棉花黄萎病是威胁棉花生产的主要病害，多年来一直严重影响着我国棉花的品质和产量。棉花黄萎病1914年始见于美国的费吉尼亚州，随后在其它州和世界各植棉国先后发现，1935年随引进美棉品种传入我国，但危害不重。到二十世纪50年代以后，黄萎病在我国南北局部棉区陆续发生，扩散蔓延速度加快。80年代末，黄萎病已遍及全国478个植棉县(市)。进入90年代以来，我国棉花黄萎病扩展蔓延迅猛，尤其是1993、1995、1996、2002年在全国范围内连续大发生，损失严重。至今，我国大部分主产棉区已成为黄萎病重病区。黄萎病致病菌为大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.),属半知菌亚门，丛梗抱目，淡色孢科，轮枝菌属。大丽轮枝菌的寄主范围很广，涉及十字花科、蔷薇科、豆科、茄科、唇形花科、菊科等，目前已达660多种植物，并且还在逐年扩大。由于棉花黄萎病危害的严重性和寄主的广泛性，世界上不少国家的科技工作者对其进行了深入研究。关于棉花黄萎病的致病机制有多种解释，其中以导管堵塞和毒素致萎两种观点为主。60年代人们对该病菌致病机制的认识是由于菌体在导管内定殖，并大量繁殖，同时刺激邻近的薄壁细胞产生胶状物质及侵填体而堵塞导管，阻碍水分的运转，从而导致棉株萎焉。马远莉等(马远莉；甘莉；吕金殿；棉花各部位黄萎病菌在导管中的分布[J];陕西农业科学；1990年05期)对棉花各部位黄萎病菌在导管中的分布情况研究后认为，正常的次生木质部导管的潜在输水能力远远超过植物的总需水量，而且被堵塞的导管数占整个维管束的比例不大(最大的有17.7% )，因此导管堵塞不是导致棉花萎焉的主要原因。Keen等(Keen NT, Long M, Erwin DC(1972)Possible involvement of pathogen-producedprotein-1ipopoIysaccharide complex in Verticillium wilt of cotton.Physiol PlantPathol 2:317-331.)认为，黄萎病菌在代谢过程中产生的毒素为有毒的蛋白质，是一种酸性蛋白质——脂多糖的复合体。该复合物对感病棉花品种的叶片与根组织的细胞膜具有破坏作用，使细胞内K+和Na+大量渗漏。而抗病品种的细胞膜不具备毒素作用的受体位点而不受毒素破坏。越来越多的研究结果表明，大丽轮枝菌分泌的毒素是导致棉株萎焉，产生病症的主要因素。在植物与病原物的识别过程中，激发子起着非常重要的作用。激发子可能是来源于病原菌的物质分子，也可能是在病原菌的作用下植物释放的化合物。激发子可以分为两大类，非特异性的激发子和小种特异性的激发子。非特异性的激发子能够在寄主和非寄主植物上引起防卫反应，而小种特异性激发子只能在特异品种的植物上引起防卫反应。在大丽轮枝菌与植物的互做过程中， 大丽轮枝菌分泌酸性蛋白质——脂多糖复合体形式的毒素蛋白，其中可能含有大量的激发子蛋白。大丽轮枝菌新的分泌激发子基因的克隆将为我们深入研究棉花黄萎病病原大丽轮枝菌与寄主植物互作的分子机理，控制黄萎病的发生奠定坚实的基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种分泌型激发子蛋白及其编码基因。本发明所提供的分泌型激发子蛋白，名称为VdNLP2 (Verticilliu dahliaeNepl-1ike protein 2),来自大_轮枝菌(Verticilliu dahliae Kleb.),为下述 I)或 2)或3)的蛋白质:I)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)由序列表中序列2的第20-239位氨基酸序列组成的蛋白质；3)将I)或2)所限定的蛋白质的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与分泌型激发子相关的由I)衍生的蛋白质。序列表中序列2由239个氨基酸组成，其中前19个氨基酸残基为信号肽。所述VdNLP2蛋白在提高植物抗病基因表达中的应用也属于本发明的保护范围。编码上述VdNLP2蛋白的基因VdNLP2也属于本发明的保护范围。所述VdNLP2蛋白的基因VdNLP2为如下a) _d)中任一所述的基因:a)其编码序列是序列表中序列I的自5'末端第1-720位；
b)其核苷酸序列是序列表中的序列I ;c)在严格条件下与a)或b)的基因杂交，且编码所述VdNLP2蛋白的基因；d)与a)或b)所限定的基因具有90%以上的同源性，且编码所述VdNLP2蛋白的基因。上述严格条件可为用0.1 X SSPE (或0.1 X SSC), 0.1 % SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65°C下杂交并洗膜。序列表中的序列I由720个核苷酸组成，为所述VdNLP2蛋白的的编码序列，其中前57个核苷酸为VdNLP2蛋白信号肽的编码序列。所述VdNLP2基因在提高植物抗病基因表达中的应用也属于本发明的保护范围。含有所述VdNLP2基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组表达载体为在质粒pBI121或pET_28a(+)的多克隆位点处插入所述VdNLP2基因，得到表达所述VdNLP2基因的重组质粒。所述表达盒由能够启动所述VdNLP2基因表达的启动子，VdNLP2基因，以及转录终止序列组成。所述重组菌具体可为携带有所述VdNLP2基因的农杆菌，如EHA105。含有所述VdNLP2基因的重组表达载体、表达盒或重组菌在提高植物抗病基因表达中的应用也属于本发明的保护范围。所述提高植物抗病基因表达是按照如下步骤进行的:1)提供携带含有所述VdNLP2基因的重组表达载体的农杆菌，或所述VdNLP2蛋白。2)将步骤I)的农杆菌或VdNLP2蛋白注射植物叶片，诱发植物抗病基因的表达。所述VdNLP2蛋白，或所述VdNLP2基因，或上述重组表达载体、表达盒或重组菌在如下al)或a2)中的应用也属于本发明的保护范围:al)引起植物(叶片)形成坏死斑；a2)引起植物(叶片)产生活性氧(H2O2)。上述al)中所述的形成坏死斑和a2)中所述的产生活性氧(H2O2)均是植物过敏性反应的体现。植物过敏性反应是细胞程序性死亡的重要表现形式之一，表现为植物在不亲和病原菌侵染下受侵细胞及邻近细胞的快速死亡，从而导致病原菌生长受抑制，植物过敏性反应过程对于植物抗病性有重要意义。在植物-病原菌(真菌、细菌、病毒)相互作用过程中，由不亲和病原菌所导致的植物主动防卫反应一一过敏反应的早期，发现有大量活性氧产生(氧化突发)，包括超氧阴离子、羟自由基、单线态氧和过氧化氢。这些活性氧被认为有可能通过启动或参与植物细胞脂质过氧化，细胞壁木质化和蛋白质聚合；直接杀死病原菌；作为信号介导植保素合成等而直接介入或启动植物过敏性反应。现初步认为“氧化突发”可能是细胞水平上植物对付病原菌侵染的第一步。上述植物为烟草(如Ncotiana benthamiana)、拟南芥(如 Arabidopsisthaliana col)或棉花(如新陆早16号)。上述抗病基因具体如下:烟草的病程相关基因NbPR-5(X03913.1)和NbPR-1a (X06361.1);拟南芥的病程相关基因AtPRl (NM_127025.2)，乙烯途径的关键基因AtACS6 (NM_117199.1)以及茉莉酸途径的关键基因AtPDFl.2 (NM_123809.3);棉花的病程相关基因osmotin (AF304007.1)和棉酚合成途径中的关键基因CADl-Cl (AF174294.1)。扩增所述VdNLP2基因的全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。如 CGGATCCATGTCGCCGTCTCTCATCAGC 和 CGAGCTCCTACAGCGCCGCCTTCTGCAGG ；或者CGGATCCGCGCCGCTGCTCGAGTCGCGCG 和 CGAGCTCCTACAGCGCCGCCTTCTGCAG。
实验证明，本发明所提供的分泌型激发子蛋白及其编码基因在提高植物抗病基因表达、引起植物(叶片)形成坏死斑，以及引起植物(叶片)产生活性氧(H2O2)中具有重要作用。
图1为EHA105/pBI121_VdNLP2注射烟草叶片后诱发了烟草叶片的过敏性坏死结果。其中，叶片的左侧(A)为对照组；叶片的右侧⑶为实验组。图2为VdNLP2原核表达蛋白的纯化结果。其中，泳道I为蛋白Marker ;泳道2为未经纯化的总蛋白；泳道3为纯化后的VdNLP2蛋白。图3为VdNLP2原核表达蛋白在烟草、拟南芥和棉花叶片上引起的过敏性坏死斑形成及活性氧产生的结果。其中，A为拟南芥叶片；B为烟草叶片；C为棉花叶片。A、B和C中均左侧(I)为对照组，右侧(2)为实验组；A、B和C中均上数第一排为坏死斑形成结果，第
二排为活性氧产生结果。图4为VdNLP2原核表达蛋白在注射烟草、拟南芥以及棉花叶片后，诱发抗病相关基因高表达的结果。其中，A为拟南芥；B为烟草；C为棉花。具体的，A中a为以AtPRl基因为探针的northern杂交结果；b为以AtACS6基因为探针的northern杂交结果；c为以AtPDFl.2基因为探针的northern杂交结果；d为转膜后，用亚甲基蓝染色液对膜染色后的拟南芥18S rRNA的定量结果。B中a为以NbPR-5基因为探针的northern杂交结果；b为以NbPR-1a基因为探针的northern杂交结果；c为转膜后，用亚甲基蓝染色液对膜染色后的烟草18S rRNA的定量结果。C中a为以Osmotin基因为探针的northern杂交结果；b为以CADl-Cl基因为探针的northern杂交结果；c为转膜后，用亚甲基蓝染色液对膜染色后的棉花18S rRNA的定量结果。A、B和C中的泳道I均为对照组注射后12h ;泳道2均为对照组注射后48h ;泳道3均为实验组注射后12h ;泳道4均为实验组注射后48h。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、分泌型激发子基因VdNLP2的获得本发明的发明人首先构建了大丽轮枝菌T-DNA插入突变体库，然后应用热不对称交错PCR (TAIL-PCR)查找部分转化子T-DNA插入位点的序列。在对一个位点的序列分析中，获得了基因VdNLP2的部分序列信息。然后应用RACE技术获得了序列表中序列I的分泌型激发子基因VdNLP2的ORF序列。具体操作如下:1、突变体库的构建大丽轮枝菌菌株V592 (菌株V592是采自新疆棉花田，现保存于本发明人实验室，可以通过与发明人所在研究所签定材料移转合约购得)在PDA平板上25°C培养后将孢子接种于查氏液体培养基(1L查氏液体培养基中含有:2g NaNO3, Ig KH2P04，IgMgSO4 7H20，Ig KCL, 2mg FeSO4 7H20和30g蔗糖)中振荡培养5-8天直至孢子浓度为1.0X 107/mL，孢子培养液用4层无菌纱布过滤以除去菌丝。4000rpm离心IOmin得到孢子并用含有终浓度为200mM的乙酞丁香酮(AS)的诱导培养基(配方参见Gao, F.，Zhou，B.J.，Li，G.Y.，Jia,P.S., Li, H., Zhao, Y.L., Zhao, P., Xia, G.X., and Guo, H.S.2010.Aglutamic acid-richprotein identified in Verticillium dahliae from an insertional mutagenesisaffects microsclerotial formation and pathogenicity.PloS one 5:el5319.)将抱子浓度调节到(1.0X IO6-L OX IO7)/mL，得到分生孢子悬浮液。将农杆菌EHA105(Gao，F.，Zhou, B.J., Li, G.Y.，Jia, P.S.，Li，H.，Zhao, Y.L.，Zhao,P., Xia, G.X., and Guo, H.S.2010.A glutamic acid-rich protein identified inVerticillium dahliae from an insertional mutagenesis affects microsclerotialformation and pathogenicity.PloS one 5:el5319.)在 30ml 基本培养基(MM)(含有 Kan50mg/L，Rif 25mg/L)中28°C培养48h，4000rpm，离心lOmin。沉淀用诱导培养基(頂)洗两次，重悬农杆菌至OD值为0.2-0.3，并加200mM乙酞丁香酮(AS)、40mM MES以及Kan(50mg/0，281:，200印111振荡培养611。然后吸取IOOii L上述培养物与IOOyl的前述步骤制备的分生孢子悬浮液混合，泼于放在共培养基上的孔径为45 y m的47mm直径的纤维素膜上，在28°C培养36h。用2mL基本培养基洗膜，收获真菌和细菌培养物，然后取200 ii L两涂于含100 ii g/mL氯B密磺隆(Cholorimuron)的选择培养基平板上,抑制农杆菌的生长,挑取单个转化子转至选择培养基平板进行二次筛选并保存转化子。获得转化子后，提取转化子基因组 DNA。2、TAIL-PCR及RACE技术获得突变基因序列本发明的发明人利用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)来获得插入位点侧翼序列。根据载体的已知序列在左右分别设计3个与其边界距离不等的嵌套的特异性引物LB1、LB2、LB3以及RB1，RB2、RB3，特异性引物的长度约20bp，退火温度(Tm) —般为58 68°C:LBl:gggttcctatagggtttcgctcatgLB2:catgtgttgagcatataagaaaccctLB3:gaattaattcggcgttaattcagtRBl:ggcactggccgtcgttttacaacRB2:aacgtcgtgactgggaaaaccctRB3:cccttcccaacagttgcacag再按照物种普遍存在的蛋白质的保守氨基酸序列设计一系列简并引物AD，简并引物相对较短，长度为14bp，退火温度(Tm)为30 48°C:ADI: (AGCT) TCGA (GC) T (AT) T (GC) G (AT) GTTAD2: (AGCT) GTCGA (GC) (AT) GA (AGCT) A (AT) GAAAD3: (AT) GTG (AGCT) AG (AT) A (AGCT) CA (AGCT) AGAAD4: TG (AT) G (AGCT) AG (AT) A (AGCT) CA (GC) AGAAD5:AG (AT) G (AGCT) AG (AT) A (AGCT) CA (AT) CA (AT) AGGAD6:CA (AT) CGIC (AGCT) GAIA (GC) GAAAD7:TC (GC) TICG (AGCT) ACIT (AT) GGAAD8: (GC) TTG (AGCT) TA (GC) T (AGCT) CT (AGCT) TGCAD9: (AT) CAG (AGCT) TG (AT) T (AGCT) GT (AGCT) CTGADlO:TCTTICG(AGCT)ACIT(AGCT)GGAADl1:TTGIAG(AGCT)ACIA(AGCT)AGG通过三轮的PCR反应获得侧翼序列。其中第一轮的模板为步骤I得到的基因组基因组DNA，第二、三轮的模板分别为第一、二轮 的PCR产物。反应程序如下:
权利要求
1.蛋白质，为下述I)或2)或3): 1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 2)由序列表中序列2的第20-239位氨基酸序列组成的蛋白质； 3)将I)或2)所限定的蛋白质的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与分泌型激发子相关的由I)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白质在提高植物抗病基因表达中的应用。
3.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于:所述基因为如下a)-d)中任一所述的基因: a)其编码序列是序列表中序列I的自5'末端第1-720位； b)其核苷酸序列是序列表中的序列I; c)在严格条件下与a)或b)的基因杂交，且编码权利要求1所述蛋白的基因； d)与a)或b)所限定的基因具有90%以上的同源性，且编码权利要求1所述蛋白的基因。
5.权利要求3或4所述基 因在提高植物抗病基因表达中的应用。
6.含有权利要求3或4所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
7.根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于:所述重组表达载体为在质粒PBI121或pET-28a(+)的多克隆位点处插入权利要求3或4所述基因，得到表达所述基因的重组质粒。
8.权利要求6或7所述的重组表达载体、表达盒或重组菌在提高植物抗病基因表达中的应用。
9.权利要求1所述蛋白，或权利要求3或4所述基因，或权利要求6或7所述的重组表达载体、表达盒或重组菌在如下al)或a2)中的应用: al)引起植物形成坏死斑； a2)引起植物产生活性氧。
10.根据权利要求2、5、8或9所述的应用，其特征在于:所述植物为烟草、拟南芥或棉花。
全文摘要
本发明公开了一种来自大丽轮枝菌的分泌型激发子蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的分泌型激发子蛋白为下述1)或2)或3)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)由序列表中序列2的第20-239位氨基酸序列组成的蛋白质；3)将1)或2)所限定的蛋白质的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与分泌型激发子相关的由1)衍生的蛋白质。实验证明，本发明所提供的分泌型激发子蛋白及其编码基因在提高植物抗病基因表达、引起植物(叶片)形成坏死斑，以及引起植物(叶片)产生活性氧(H2O2)中具有重要作用。
文档编号C12N15/63GK103193874SQ201210006128
公开日2013年7月10日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者郭惠珊, 周邦军 申请人:中国科学院微生物研究所