专利名称：一种从成熟红麻叶片中提取dna的方法
技术领域：
本发明属于植物分子生物学领域，涉及一种红麻DNA研究技术，更具体地涉及一种高质量、高产量的红麻成熟叶片的DNA提取方法。
背景技术：
红麻(Kenaf)是锦葵科(Malvaceae)木槿属OYi^MM) —年生韧皮纤维作物， 公元前4000年的非洲苏丹就已栽培，红麻作为天然纤维作物，具有生长速度快、抗逆性强、 适应性广等特点，巨大的生物产量为树林的3-4倍，极强的二氧化碳吸收能力为森林的4-5 倍，是发展低碳经济的优势作物。红麻纤维除传统上作为加工麻绳、麻袋、地毯等的原料外， 还是加工汽车内饰、板材、麻碳等的良好材料，其纤维经变性可与棉花混纺为面料，具有吸湿、透气、抑菌等生物功能。随着分子生物学的发展，通过提取植物DNA进行基因库构建、基因克隆、遗传转化、分子标记等已在各种植物的研究中迅速展开。在这些技术的操作过程中，提取高质量 DNA样品是必要前提，能够有效提取高质量DNA，一直是广大生物技术工作者关心的问题。 棉花、荔枝等植物含有大量的酚类物质及其次生代谢物质，在DNA提取过程中通常会受到这些次生代谢物质的干扰，影响DNA的质量和产量，因此对这类植物进行DNA分离时，其提取缓冲液和分离步骤应有相应的变化(王珍，方宣钧，2003)、(郭安平，黄明等，1997)。红麻成熟叶片中含有多糖、多酚及其他次生代谢产物，这些次生物质在DNA提取过程中常与核酸形成复合物，形成粘稠的胶状物质，并产生不同程度的褐化，对酶切、PCR扩增等操作产生不良影响，从而不能用于分子生物学研究。而成熟红麻叶片含有较多多糖、 多酚及其他次生代谢产物，加大了 DNA提取的难度。另外，红麻虽是自花授粉作物，但在繁种生产中常出现自然杂交株，难以保持品种的特性和纯度(何凡，1989)。因此，为确保所提取的红麻DNA纯度，必须根据红麻生长期内纯合的植株叶片为材料，而不是幼苗期的叶片。目前，有关红麻基因组DNA提取方法的报道较少，且均以幼嫩、新鲜叶片为试材(徐建堂等，2007;郭安平等，1997)，对成熟、干燥叶片的DNA进行提取的研究虽也有报道(曹德菊， 1999 ；白凤虎，2007)，但由于步骤操作复杂，严重影响了红麻DNA的提取效率。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种高效、稳定地从成熟红麻叶片中提取DNA 的方法。本发明的目的通过如下技术方案实现
称取红麻成熟叶片l.og，用液氮迅速研磨至粉末状，将粉末装入IOml离心管中，管中加入:3ml 65°C预热的重量比为4%CTAB提取缓冲液，重量比为3%抗氧化剂β -巯基乙醇； 然后冷却至室温，加入等体积的氯仿与异戊醇混合液，混合液中氯仿/异戊醇按体积比为 24/1，轻柔颠倒混勻IOmin ； 1200rpm离心IOmin ；吸取上清液转入IOml离心管中，依次加入1/3体积的3 mol/L NaAc溶液及等体积_20°C预冷的无水乙醇，混勻，冰上沉淀30min ；于1200rpm离心IOmin ；将沉淀移入1. 5ml离心管中，用75%无水乙醇漂洗;3min，重复1次； 将沉淀真空抽干或于室温下吹干，加入100 μ 1 TE溶解沉淀，进行DNA纯化或放入-20°C冰箱保存备用。所提取的DNA条带清晰，用于分子标记研究，或红麻叶绿体DNA和线粒体DNA 的扩增研究。本发明的显著优点
红麻成熟叶片中富含多糖、色素、酚类等次生代谢物质，这些物质极易引起红麻DNA褐化、降解，严重影响了后续的PCR扩增及条带亮度。本发明操作步骤简单，节省了 DNA提取时间，在磨样后于提取液中加入了 3% β-巯基乙醇，可有效防止红麻样品的色素、酚类和醌类等次生代谢物质的氧化干扰，同时在第一次离心后得到的上清液加入1/3体积的3 mol/L NaAc (pH4. 8)，有利于变性的红麻DNA凝聚而沉淀，提高了红麻基因组DNA的产量。本发明优化的红麻成熟叶片DNA提取方法重复性好、实验结果较稳定、琼脂糖电泳条带清晰。本发明操作步骤简单，节省了 DNA提取时间，从而有效防止DNA氧化而造成的损失，提高DNA的提取产量，本发明为进一步开展红麻及其麻类的基因组学的研究奠定工作基础。
图1两种方法获得的红麻DNA的1.0%琼脂糖凝胶电泳图；1-8泳道SDS法获得的红麻福红952 DNA ；9-18泳道CTAB法获得红麻福红952 DNA。图2本发明改良的CTAB方法的红麻DNA RAPD扩增结果，泳道1_12分别表示来自福建农林大学麻类遗传育种与综合利用研究室保存的12个红麻品种。12个品种分别是 福红 952、8 个福红航 952 突变体后代 P4-4，P4-18，P441, P442, P443, P410, P411, P412，福红 951，08CCV-76，塔什干。图3引物cp3扩增结果。图4引物mt4扩增结果。
具体实施例方式本发明具体实施步骤如下
1. 1红麻成熟叶片DNA提取方法步骤改良SDS法
(1)分别称取红麻品种福红952成熟叶片各1. 0g，用液氮迅速研磨1-2遍至粉末状， 将粉末装入IOml离心管中，每管中加入:3ml 65°C预热的SDS抽提缓冲液(100 mmoL/L Tris-HCl (pH8. 0),0.5 mol / L NaC 1,20 mmol/L EDTA (pH 8. 0))，每管分别加入不同 CTAB 浓度和抗氧化剂组合，8个不同CTAB浓度和抗氧化剂组合如下。
权利要求
1.一种从成熟红麻叶片中提取DNA的方法，其特征在于所述方法的具体步骤如下称取红麻成熟叶片1. 0g，用液氮迅速研磨至粉末状，将粉末装入IOml离心管中，管中加入:3ml 65°C预热的重量比为4%CTAB提取缓冲液，重量比为3%抗氧化剂β-巯基乙醇；然后冷却至室温，加入等体积的氯仿与异戊醇混合液，混合液中氯仿/异戊醇按体积比为对/1，轻柔颠倒混勻IOmin ； 1200rpm离心IOmin ；吸取上清液转入IOml离心管中，依次加入1/3体积的3 mol/L NaAc溶液及等体积_20°C预冷的无水乙醇，混勻，冰上沉淀30min ；于1200rpm 离心IOmin ；将沉淀移入1. 5ml离心管中，用75%无水乙醇漂洗3min，重复1次；将沉淀真空抽干或于室温下吹干，加入100 μ 1 TE溶解沉淀，进行DNA纯化或放入-20°C冰箱保存备用。
2.如权利要求1所述的从成熟红麻叶片中提取DNA的方法，其特征在于，所提取的DNA 条带清晰，用于分子标记研究，或红麻叶绿体DNA和线粒体DNA的扩增研究。
全文摘要
本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种高效、稳定地从成熟红麻叶片中提取DNA的方法。本发明结合红麻成熟叶片中含多糖、多酚的特性，在已有的红麻基因组DNA提取方法上，对红麻叶片CTAB法提取基因组DNA提取方法进行改进和优化。运用本发明的方法能获得红麻基因组DNA条带清晰，无拖带，OD260/OD280为1.7-1.9，酶切完全，其质量、产量都高于改良SDS法，可用于扩增叶绿体DNA和线粒体DNA。此发明为进一步开展红麻及其麻类的基因组学及亚细胞基因组组学的研究奠定工作基础。
文档编号C12N15/10GK102533729SQ20121000599
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月11日 优先权日2012年1月11日
发明者徐建堂, 方平平, 林培清, 林荔辉, 池仁漫, 祁建民, 陈涛, 陶爱芬 申请人:福建农林大学